Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Jednocząsteczkowy FRET może uchwycić dynamikę zachodzącą w odległości nanometrów, co jest odpowiednią skalą dla procesu biosyntezy białek rybosomalnych. Rybosom działa poprzez allosteryczne koordynowanie wielu czynników i składników, co jest wewnętrznie niejednorodne. Metoda jednocząsteczkowa może śledzić każdy rybosom bez ograniczeń związanych z tym niejednorodnym średnim efektem.

Metoda ta ujawni, w jaki sposób antybiotyki hamują funkcję rybosomów, aby opracować nowe leki w kierunku lekoopornych infekcji bakteryjnych. Rozpocznij od przygotowania PRE, mieszając inicjację EFTU, NOG i mieszankę PAG w stosunku jeden do dwóch do dwóch w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Po inkubacji oczyścić PRE za pomocą ultrawirowania z poduszką sacharozową o stężeniu 1,1 molowym przez noc w temperaturze 100 000 razy G. Przygotować POST, mieszając inicjację EFTU, WG i PHE w stosunku jeden do dwóch do dwóch w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po inkubacji oczyść POST za pomocą ultrawirowania z poduszką sacharozową o smile 1,1 molowej przez noc w temperaturze 100 000 razy G. Wyczyść szkiełka mikroskopowe zawierające sześć par otworów o średnicy jednego milimetra i szkiełka nakrywkowe mikroskopu numer 1,5. Piecz czyste szkiełka i szkiełka nakrywkowe w temperaturze 300 stopni Celsjusza przez trzy godziny, a następnie pokryj szkiełko nakrywkowe aminozaliną. W czystym kapturze laminarnym połóż jedno szkiełko nakrywkowe płasko na powierzchni.

Ostrożnie upuść 60 mikrolitrów roztworu PEG na górną krawędź, a następnie połóż na nim kolejne szkiełko nakrywkowe, pozwalając, aby efekt kapilarny rozprowadził roztwór między nimi, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki. Powtórz te kroki dla dwóch kolejnych par szkiełek nakrywkowych. Przechowuj te szkiełka nakrywkowe w pustym pudełku wypełnionym wodą i inkubuj je przez trzy godziny w ciemności.

Po trzech godzinach oddzielić szkiełka nakrywkowe, spłukać wodą w trzech kolejnych tyglach i przepłukać suchym strumieniem azotu. Przeciągnij ostre końcówki pipet przez otwory w szklanych szkiełkach, aż będą ściśle przylegać. Zeskrob ostre końce, aż będą całkowicie płaskie ze szklaną powierzchnią, a następnie przetnij dwustronną taśmę z wzorem kanału.

Przyklej do szkiełek szkiełkowych po płaskiej stronie. Przyklej powlekane szkiełko nakrywkowe do taśmy dwustronnej i dociśnij je, aby szczelnie uszczelnić komorę próbki, upewniając się, że powlekana strona jest skierowana do wewnątrz. Włącz komputer i przełącznik mikroskopu.

Uruchom interfejs sterowania laserem i włącz laser. Naciśnij przycisk włączania na skrzynce sterowniczej lasera, aby rozgrzać laser. Włącz kamery, a następnie uruchom oprogramowanie powiązane z mikroskopem.

Wyłącz górną migawkę i włącz lampę. Przygotuj TAM10 z buforem Tween dodając 10 mikrolitrów 5%Tween-20 do jednego mililitra buforu TAM10. Przygotuj roztwór deoksy, ważąc trzy miligramy oksydazy glukozowej w małej probówce do mikrowirówek i dodaj do niego 45 mikrolitrów katalazy.

Delikatnie przekręć rurkę, aby rozpuścić ciało stałe. Wirować z prędkością 20 000 G w mikrowirówce przez jedną minutę i pobrać supernatant. Przygotować 30% roztwór glukozy, 200 milimolowy roztwór Trolox i 0,5 miligrama na mililitr roztworu streptawidyny, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie tekstowym.

Dodaj jedną kroplę oleju obrazującego do obiektywu do murawy. Umieść komory na próbki na obiektywie. Napełnij komorę 10 mikrolitrami roztworu streptawidyny i odczekaj minutę.

Przemyć komorę 30 mikrolitrami TAM10 z buforem Tween i zebrać roztwór przepływowy za pomocą złożonej bibuły filtracyjnej. Odczekaj minutę po umyciu. Rozcieńczyć kompleksy rybosomów PRE lub POST do stężeń 10-15 nanomolowych za pomocą TAM10 z buforem Tween .

Załaduj 20 mikrolitrów próbki rybosomu do kanału i odczekaj dwie minuty. Sporządzić bufor do obrazowania, używając 50 mikrolitrów buforu TAM10 i po 0,5 mikrolitra roztworu deoksyglukozy i Troloxu. Dobrze je wymieszaj.

Przepłukać komorę 30 mililitrami bufora obrazowania. Ustaw aparat do rejestrowania obrazów. Włącz górną migawkę, a lampa zgaśnie.

Rozpocznij akwizycję z kamery i rozmieść obrazy w trzech oknach reprezentujących dwie pojedyncze kamery i nakładkę. W menu pobierania wybierz przechwytywanie poklatkowe, a następnie kliknij przechwytywanie automatycznie. Ustaw odpowiednią nazwę pliku, ścieżkę pliku i liczbę pętli, a następnie kliknij uruchom teraz.

Zamknij wyskakujące okienko po zakończeniu akwizycji obrazu, a następnie otwórz uzyskany plik ND. Kliknij ROI, prosty edytor ROI i wybierz kółko opcji. Wybierz zwrot z inwestycji na obrazie i kliknij zakończ po zakończeniu.

Kliknij pomiar, pomiar czasu, aby wyświetlić dane w postaci wykresu lub arkusza kalkulacyjnego. Otwórz kartę eksportu, aby ustawić parametry eksportu, a następnie kliknij eksport, aby zapisać intensywność. Na koniec otwórz plik, który został wyeksportowany za pomocą odpowiedniej aplikacji.

Odległość od pozostałości znakowania L27 do tRNA miejsca A lub P wynosi odpowiednio 61 lub 52 angstremów, co odpowiada wydajności FRET wynoszącej 0,47 i 0,65. Intensywności kwitnienia z kanałów donorowych i akceptorowych zostały pobrane i wykreślone jako timelapsy. Po wybielaniu dawcy obie ścieżki zbliżały się do linii podstawowej, ponieważ nie mogło dojść do wzbudzenia bezpośrednio na akceptorze.

Po bieleniu akceptora intensywność dawcy wzrosła, ponieważ mniej szlaków reakcji rozpraszało energię wzbudzenia. Poszczególne rybosomy wykazywały różne fluktuacje ze względu na chybotliwy ruch tRNA, co powodowało wahania odległości do L27. Inne metody, takie jak test Puromycyny, test, test odcisku palca u nogi i specyfikacja masy, są komplementarne do metody FRET pojedynczej cząsteczki i ujawniają więcej szczegółów na temat syntezy białek.

Jednocząsteczkowy FRET ma szerokie zastosowanie, ponieważ wiele procesów biologicznych zachodzi w zakresie nanometrów i w milisekundowych skalach czasowych. Oznaczając odpowiednie barwniki we właściwych pozycjach, można ujawnić wiele innych dynamik.