Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia pełną procedurę tworzenia kropelek od filmu lipidowego do roztworu lipidowego do mikropęcherzyków, a następnie do kropel. Główną zaletą tej techniki jest prostota kondensacji mikropęcherzyków w kropelki. Wystarczy schłodzić i zawirować, aby kropelki mogły być wytwarzane bez konieczności utrzymywania ciśnienia.

Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ prostym testem mającym na celu sprawdzenie, czy mikropęcherzyki zostały pomyślnie zagęszczone, jest wizualne sprawdzenie zmiany przezierności. Procedurę zademonstruje Kimoon Yoo, student studiów magisterskich w laboratorium Gang Zheng. Za pomocą decappera usuń aluminiową uszczelkę z fiolki surowicy i przenieś jeden mililitr roztworu lipidów do fiolki z próbką ze szkła borokrzemianowego o pojemności 1,85 mililitra za pomocą zakrętki fenolowej, pozwalając roztworowi lipidów spłynąć po wewnętrznej ściance bez tworzenia pęcherzyków.

Za pomocą fiolki z próbką o pojemności 1,85 mililitra przygotuj się do przepływu dekafluorobutanu do przestrzeni nad fiolką z próbką za pomocą wymiennika gazowego. Upewnij się, że wszystkie zawory na wymienniku gazowym są prawidłowo zamknięte, a pompa jest wyłączona. Otwórz zawór kolektora i ostrożnie wyjmij odpowiednią igłę z kolektora.

Otwórz zawór ciśnieniowy A i zawór ciśnieniowy B i przekręć zawór butli gazowej o około 1/16 do 1/8 w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby częściowo go otworzyć. Otwórz zawór z uchwytem T i odkręć fiolkę z próbką roztworem lipidów. Umieścić igłę kolektora nad interfejsem ciekłego powietrza fiolki, powoli obracać zawór regulatora powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż igła regulatora powietrza przesunie się nieznacznie z pozycji spoczynkowej i pozwolić, aby gaz perfluorowęglowy delikatnie przepływał do przestrzeni nad fiolką przez 30 sekund, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.

W razie potrzeby wyreguluj zawór regulatora powietrza. Po 30 sekundach ostrożnie i szybko zachowaj fiolkę z próbką, nie przesuwając jej zbyt mocno. Zarówno zawór butli gazowej, zawór uchwytu T, zawór regulatora powietrza, zawór ciśnieniowy A, zawór ciśnieniowy B i zawór kolektora.

Ostrożnie owinąć igłę, a następnie oznaczyć fiolkę z próbką i uszczelnić szyjkę folią woskową zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Fiolkę z próbką należy przechowywać w ciemności i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut lub do 24 godzin. Umieść około 100 gramów suchego lodu w izolowanym pojemniku, a zwykły lód w innym izolowanym pojemniku.

Pobrać wcześniej przygotowaną fiolkę z dekafluorobutanem na 1,5-calowe igły o rozmiarze 20, plastikową strzykawkę o średnicy jednego mililitra, pojemnik o pojemności 200 mililitrów, metalowe szczypce i termometr. Umieścić fiolkę z próbką z roztworem lipidów w mieszadle mechanicznym i mieszać przez 45 sekund. Powinna nastąpić zmiana koloru i przezierności.

Po mechanicznym wymieszaniu należy ustawić fiolkę z próbką prawą stroną do góry, osłoniętą przed światłem i rozpocząć 15-minutowe odliczanie do schłodzenia fiolki i dobrania wielkości mikropęcherzyków. Gdy odliczanie osiągnie 10 minut, napełnij pojemnik około 200 mililitrami izopropanolu i schłodzić go do minus 20 stopni Celsjusza suchym lodem za pomocą metalowych szczypiec. Po wybraniu wielkości mikropęcherzyków przez 15 minut, należy poszukać przegrody o wybranym rozmiarze wewnątrz fiolki z próbką.

Trzymając fiolkę z próbką prawą stroną do góry, ostrożnie odkręć fiolkę z próbką i wyjmij około 0,7 mililitra dolnej przegrody za pomocą igły o średnicy 1,5 cala o rozmiarze 20 przymocowanej do plastikowej strzykawki o średnicy jednego mililitra. Upewnij się, że żadna z górnych przegród nie została usunięta i nie potrząsaj strzykawką w celu usunięcia kieszeni powietrznych. Kierując się do środkowego okręgu na gumowym korku, włóż inną igłę o rozmiarze 20 do fiolki z dekafluorobutanem, trzymając igłę w pobliżu górnej części fiolki z surowicą, aby odpowietrzyć, a następnie włóż igłę z wybranymi mikropęcherzykami o rozmiarze.

Powoli przenieś wybrane mikropęcherzyki o odpowiedniej wielkości. Pozwól, aby płyn delikatnie zsunął się po wewnętrznej ściance fiolki z dekafluorobutanem. Po przeniesieniu całego roztworu mikropęcherzyków o wybranej wielkości, wyjmij igłę ze strzykawką, ale trzymaj igłę odpowietrzającą, aby zmniejszyć podciśnienie.

Dodać niewielkie ilości suchego lodu lub izopropanolu o temperaturze pokojowej do kąpieli izopropanolowej, aby upewnić się, że temperatura kąpieli wynosi od minus 15 do minus 17 stopni Celsjusza. Z igłą odpowietrzającą o rozmiarze 20 włożoną w górną część fiolki z surowicą, umieścić fiolkę z surowicą i kąpiel izopropanolową, utrzymując poziom mikropęcherzyków poniżej poziomu izopropanolu, ale szyjkę fiolki powyżej niej i z przerwami obracaj fiolkę z surowicą przez dwie minuty, aby skondensować mikropęcherzyki. Nie obracać fiolki z surowicą w sposób ciągły w izopropanolu i nie dopuścić do zamarznięcia roztworu.

Obracać przez około pięć sekund i wyjąć fiolkę z surowicą z izopropanolu. Sprawdź, czy nie ma zarodków lodu, a następnie wznów wirowanie w izopropanolu. Jeśli tworzy się lód, należy zakręcić fiolkę z surowicą w powietrzu, aż się rozproszy.

Po dwuminutowej kondensacji wyjąć fiolkę surowicy z kąpieli izopropanolowej i usunąć igłę odpowietrzającą. Mikropęcherzyki powinny skondensować się w kropelki, na co wskazuje zmiana przezierności. Wytrzyj fiolkę z surowicą, oznacz ją i umieść na zwykłym lodzie w ciemnym izolowanym pojemniku, aż będzie gotowa do użycia.

Nieotwarte kropelki z nienaruszoną aluminiową uszczelką powinny być stabilne do sześciu godzin, o ile stopiony lód zostanie wymieniony w razie potrzeby. Gdy produkt będzie gotowy do użycia, usuń aluminiową uszczelkę za pomocą odkręcacza. Po zastosowaniu tego protokołu, wstępnie skondensowane, wybrane mikropęcherzyki i post-skondensowane kropelki zostały zwymiarowane na liczniku Coulter z aperturą 10 mikronów.

Przedstawiono dane dotyczące wielkości preparatu 30% pirolipidowego. Statystyki oparte na danych dotyczących rozmiaru są pokazane tutaj. Wykorzystując stosunek średnich średnic przed i po skondensowaniu, wyniki wykazały, że wraz ze wzrostem zawartości pirolipidów stężenie spadało, a średnia średnica wzrastała.

Przedstawiono reprezentatywne pomiary absorbentów w próbce kropelek 30% pirolipidów. Wykazało to, że nienaruszone zespoły mają różne właściwości optyczne, odzwierciedlone przez różne piki w porównaniu z pojedynczymi niezmontowanymi składnikami lipidowymi. Przedstawiono tutaj reprezentatywne pomiary florescencji wstępnie skondensowanej mikropęcherzykowej, postskondensowanej próbki kropelkowej z 30% pirolipidem, wykazujące różne piki fluorescencji dla nienaruszonych próbek w postaci zaburzonej.

Pokazano reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne próbki 30% kropelek pirolipidów zobrazowanej pod różnymi ciśnieniami. Przy niskich ciśnieniach obserwowano tylko sygnał tła z pęcherzyków powietrza zablokowanych w wyniku syntezy agaru. Przy nieco większej mocy wygenerowano kilka mikropęcherzyków, o czym świadczy pojawienie się jasnych plamek.

Wraz ze wzrostem ciśnienia powstawało więcej mikropęcherzyków. Ważne jest, aby pamiętać, że temperatura kondensacji jest tutaj zoptymalizowana dla tej konkretnej formuły skorupy kropelkowej. Różne formuły powłok mogą wymagać różnej temperatury.