Name: Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę syntezy multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej bez konieczności stosowania ciśnienia. Protokół obejmuje kondensację mikropęcherzyków przez chłodzenie i mieszanie oraz wizualną kontrolę zmiany przezroczystości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Brandonowi Helfieldowi za pomoc w budowie wymiennika gazu oraz dr Miffy Hok Yan Cheng za dyskusje techniczne. Autorzy pragną podziękować następującym źródłom finansowania: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute oraz Princess Margaret Cancer Foundation.

<ol><li>Gramiak, R., Shah, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiography+of+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Radiology%22%5BJournal%5D)">Echocardiography of the aortic root.</a> Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).</li>
<li>Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble+contrast+agents%3A+fundamentals+and+application+to+gene+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).</li>
<li>Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+%28BBB%29+disruption+using+a+diagnostic+ultrasound+scanner+and+Definity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).</li>
<li>Helfield, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+accumulation+of+submicron+phase-change+droplets+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891(2020).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Ultrasonics%2C+Ferroelectrics%2C+and+Frequency+Control%22%5BJournal%5D)">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).</li>
<li>Yoo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+encapsulation+on+in+vitro+and+in+vivo+performance+of+volatile+nanoscale+phase-shift+perfluorocarbon+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+ultrasound+characterization+of+volatile+sub-micron+phase-shift+droplets+in+the+20-40+MHz+frequency+range%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+bubbles%3A+creating+phase-shift+droplets+from+commercially+available+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+with+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+using+acoustically-activated+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets.</a> Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).</li>
<li>Wu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-enhanced+siRNA+delivery+using+magnetic+nanoparticle-loaded+chitosan-deoxycholic+acid+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246(2017).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+release+from+phase-changeable+nanodroplets+triggered+by+low-intensity+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound.</a> Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).</li>
<li>Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregate+enhanced+trimodal+porphyrin+shell+microbubbles+for+ultrasound%2C+photoacoustic%2C+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).</li>
<li>Dhaliwal, A., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+accessibility+of+EPR-insensitive+tumor+phenotypes+using+EPR-adaptive+strategies%3A+Designing+a+new+perspective+in+nanomedicine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery.</a> Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).</li>
<li>Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+size+distribution+measurements+of+Definity+and+manipulated+Definity+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376(2007).</li>
<li>Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold-dependent+nonlinear+scattering+from+porphyrin+nanobubbles+for+vascular+and+extravascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001(2018).</li>
<li>Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+collapse+and+microbubble+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer collapse and microbubble stability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).</li>
<li>Overchuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtherapeutic+Photodynamic+Treatment+Facilitates+Tumor+Nanomedicine+Delivery+and+Overcomes+Desmoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia.</a> Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).</li>
<li>Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li>
<li>Paproski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+nanodroplets%3A+Sub-micrometer+ultrasound+and+photoacoustic+contrast+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents.</a> Small. 12 (3), 371-380 (2016).</li>
<li>Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+the+local+and+targeted+delivery+of+osteoarthritis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs.</a> Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).</li>
<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie ultradźwiękowe to nieinwazyjna, niejonizująca forma obrazowania medycznego, która wykorzystuje fale akustyczne. Podczas gdy ultrasonografy są bardziej przenośne i mogą dostarczać obrazy w czasie rzeczywistym, obrazowanie ultrasonograficzne może cierpieć z powodu niskiego kontrastu, co utrudnia ultrasonografom niezawodne rozróżnienie podobnie echogenicznych cech patologicznych. Aby przeciwdziałać temu ograniczeniu, mikropęcherzyki mogą być wstrzykiwane do gospodarza w celu poprawy kontrastu naczyniowego. Mikropęcherzyki to mikronowe środki kontrastowe wypełnione gazem, które są silnie echogeniczne w stosunku do fal akustycznych i mogą zapewniać zwiększony kontrast naczyń1,2. Powłoki i rdzenie gazowe mikropęcherzyków mogą być dostosowane do różnych zastosowań, takich jak obrazowanie, tromboliza, przepuszczalność błony komórkowej lub przejściowe otwarcie naczyń krwionośnych2.
Wadą mikropęcherzyków jest ich krótki okres półtrwania. Na przykład, klinicznie dostępne mikrosfery lipidowe perflutren mają tylko okres półtrwania 1,3 minut3. W przypadku długich sesji obrazowania konieczne jest wielokrotne wstrzyknięcie mikropęcherzyków. Kolejną wadą mikropęcherzyków są ich duże średnice. Podczas gdy mikrosfery lipidowe perflutrenu mają średnicę około 1 do 3 μm, wystarczająco małe, aby krążyć w układzie krwionośnym, są zbyt duże, aby wynaczynić i pasywnie gromadzić się w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak nowotwory4. Jedną ze strategii przezwyciężenia tych ograniczeń jest skondensowanie mikropęcherzyków rdzenia gazowego w mniejsze kropelki z ciekłym rdzeniem5,6. Chociaż kropelki nie są echogeniczne w stanie ciekłym, mogą zostać odparowane do mikropęcherzyków po wystawieniu na działanie ultradźwięków o wystarczająco wysokim szczytowym podciśnieniu, odzyskując zdolność do zapewniania kontrastu. Pozwala to na wykorzystanie korzystniejszej farmakokinetyki małego ciekłego rdzenia, zachowując jednocześnie zdolność do zapewnienia kontrastu podczas insonacji i bez zmiany składu chemicznego4,7.
Dekafluorobutan jest idealnym związkiem perfluorowęglowodorowym do przechodzenia fazowo między stanem gazowym a ciekłym5,6,7. Dekafluorobutan pozwala na kondensację mikropęcherzyków w kropelki przy samym obniżeniu temperatury, podczas gdy mniej gęste perfluorowęglowodory wymagają dodatkowego zwiększania ciśnienia5. Ta delikatna metoda minimalizuje niszczenie pęcherzyków podczas kondensacji7,8,9. Ponieważ ich rdzenie są płynne, kropelki są nieechogeniczne i niewidoczne dla ultradźwięków. Jednak przy zastosowaniu wystarczającej ilości energii akustycznej lub cieplnej, ciekłe rdzenie mogą odparować z powrotem do stanu gazowego, generując echogeniczne mikropęcherzyki8. Ta waporyzacja pozwala na kontrolę, kiedy i gdzie wytwarzać mikropęcherzyki.
Chociaż kropelki są przydatne do pasywnej akumulacji, waporyzacji in situ lub poprawy przepuszczalności komórek4, kropelki (i ich fragmenty) nie mogą być obrazowane ani określane ilościowo ex vivo. W związku z tym wymierne towarzyszące środki diagnostyczne, takie jak fluorescencyjne4,10,11, cząsteczki magnetyczne12, optycznie absorbujące środki13, są wykorzystywane jako analog do pomiaru dostarczania kropelek do tkanek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład Helfield i in. zastosowali jednoczesną iniekcję fluorescencyjnych nanokulek do ilościowej oceny obrazu histologicznego narządów myszy, ponieważ kropelki nie mogły być wykryte fluorescencyjnie4. Wadą leków do diagnostyki w terapii towarzyszącej jest to, że śledzony składnik może działać niezależnie od kropli, w zależności od jej indywidualnego profilu farmakokinetycznego.
Na szczęście, powłokę mikropęcherzyków i kropelek można dostosować. Na przykład Huynh i wsp. zademonstrowali ultradźwiękowe środki kontrastowe z otoczkami porfirynowo-lipidowymi, tworząc multimodalne mikropęcherzyki14. Porfiryny to klasa związków organicznych o aromatycznej strukturze makrocyklicznej14,15. Są optycznie chłonne, fluorescencyjne i mogą być chelatowane do szerokiej gamy metali do radioterapii, obrazowania opartego na radionuklidach lub kwantyfikacji na podstawie metali śladowych14. Jednym z przykładów porfiryny jest pirofeoforbid (Pyro). Poprzez sprzężenie Pyro z lipidami, włączenie Pyro-lipidów do mikropęcherzyków lub kropelek pozwala na ich obrazowanie i śledzenie za pomocą wielu modalności: akustycznie, fluorescencyjnie i poprzez absorbancję14. Ten multimodalny środek kontrastowy może być używany do śledzenia i ilościowego oznaczania akumulacji. Może to wyeliminować potrzebę stosowania towarzyszących środków diagnostycznych, ponieważ kwantyfikowalny składnik jest teraz sprzężony z powłoką, umożliwiając dokładniejsze kwantyfikowanie dostarczania16.
Tutaj nakreślony jest protokół tworzenia multimodalnych kropel porfiryny zmiennofazowej. Ponieważ ultrasonograficzne środki kontrastowe mogą być wykorzystywane jako platforma do dostarczania leków do tkanek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak nowotwory2,4, rozszerzenie ich wykrywalności poza ultradźwięki może okazać się przydatne do ilościowego określenia skuteczności dostarczania. Celem tych kropelek jest dostarczenie możliwych do śledzenia ultradźwiękowych środków kontrastowych zdolnych do pasywnej akumulacji in vivo, parowania in situ i akustyki, a także z potencjałem do ilościowego określania biodystrybucji lub akumulacji z narządów ex vivo bez polegania na czujnikach wtórnych. Przedstawiono również metody charakteryzacji, aby pokazać potencjał kropelek porfiryny jako czujników biodystrybucji. Omówiono również wpływ obciążenia pirolipidami w skorupie (od 0% do 50% według stosunku molowego).

<table><tbody><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (sól amonowa)Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>880220</td><td>Znany również jako "DSPE-PEG5K"</td></tr><tr><td>1-stearoyl-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>855775</td><td>Znany również jako "DSPC"</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki aluminiowe, Tear-Off</td><td>VWR</td><td>16171-840</td><td>Standardowe aluminium, średnica zewnętrzna 13 mm</td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Zdolny do&nbsp; sonikacji i podgrzewania do 70 > C,</td></tr> <tr><td>Fiolki z nakrętką Bio-Stor</td> National <td>Scientific</td><td>BS20NABP</td><td>Plastic, 2 ml z osłoną, z przezroczystymi</td></tr><tr><td>fiolkami na surowicę ze szkła borokrzemianowego</td><td>O-ring VWR</td><td>16171-285</td><td>3 ml, wewnętrzna średnica otworu 7 mm, zewnętrzna średnica otworu 13 mm</td></tr><tr><td>Fiolka na próbkę ze szkła borokrzemianowego z fenolową nakrętką</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>1,85 mL, krótka forma, średnica zewnętrzna 12 mm, wysokość 35 mm, rozmiar</td></tr> <tr><td>nakrętki 8-425Fiolka ze szkła borokrzemianowego z zakręcaną nakrętką</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik redlic Elctrolyte Diluent</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Kompatybilny z Coulter Counter</td></tr><tr><td>Dekafluorobutan (C4F10)</td><td>FluoroMed</td><td>355-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód (dwutlenek węgla)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator cząstek z dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Możliwość regulacji temperatury</td></tr><tr><td>Zaciskarka EZ 13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225302</td><td>13 mm Standardowe uszczelki aluminiowe</td></tr><tr><td>E-Z Decapper, 13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225352</td><td>13 mm Standardowe aluminiowe uszczelki</td></tr><tr><td>Spektrofotometr fluorescencyjny</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Możliwość wzbudzenia od 400 do 600 i wykrywania emisji od 300 do 800 nm, detektor prostopadły do źródła</td></tr> <tr><td>laseraKuweta kompatybilna ze spektrofotometrem fluorescencyjnym</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Może pomieścić co najmniej 2 ml, zdolne do 300 do 800 nm, wszystkie cztery strony są&nbsp; okna optyczne&nbsp;</td></tr><tr><td>Wymiennik gazowy</td><td>wykonany we własnym zakresie</td><td></td><td>Instrukcje montażu znajdują się w informacjach uzupełniających - "Inne protokoły i dane".</td></tr><tr><td>Szklane strzykawki</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości</td></tr><tr><td>GLWR Custom Aperture Tube 10 um</td><td>Beckman Coulter</td><td>B42812</td><td>10 &micro; m otwór, kompatybilny z Beckman Coulter MultiSizer 4e</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolowane pojemniki styrofaom z pokrywkami</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Korki gumowe do liofilizacji</td><td>VWR</td><td>71000-060</td> 7 <td>mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica otworu, 2-nożna, membrana chlorobutylowa</td></tr><tr><td> Membranowa pompa próżniowa</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16694-1-60-06</td><td>Regulowane</td></tr><tr><td>ciśnienie Metalowe szczypce</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 21 MHz Liniowy przetwornik ultradźwiękowy</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>21 MHz, Zdolny do obrazowania w trybie B i nieliniowym.</td></tr><tr><td>Redlica</td><td></td> <td>Beckman MultiSizer 4e</td><td>Możliwość sortowania od 0,2 i mikro; m do 6 i mikro; m</td></tr><tr><td>Nalgene Szybkoprzepływowe, sterylne, jednorazowe filtry próżniowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>567-0010</td><td>Membrana polieterosulfonowa (PES), 0,1 i mu; m wielkość porów, objętość 1000 ml. Ponieważ Isoton II jest niesterylny, może wielokrotnie używać jednostek filtrujących</td></tr><tr><td>Igły, konwencjonalne</td><td>BD</td><td>305176</td><td>20 gauge, 1,5 cala długości</td></tr><tr><td>Azot</td><td>Dowolny marek</td><td></td><td>Upewnij się, że są zawory regulacyjne i rurki do kierowania przepływem. Konfiguracja będzie zależeć od marki i źródła.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Nazywana w protokole "folią woskową".</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Pipeta 1X, pH 7,4</td></tr><tr><td></td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości</td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>1 ml, 3 ml i 30 ml. Z połączeniami Luer Lock</td></tr><tr><td>Filtr membranowy z polieterosulfonu (PES)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>0,2 i mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Glikol propylenowy</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirofeoforbid sprzężony z 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiną</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie</td><td></td><td>Znany również jako "Pyro-SPC". Patrz "Informacje uzupełniające - Inne protokoły i dane" w celu syntezy.</td></tr><tr><td>Termometr</td><td>dowolnej marki</td><td></td> <td>(od -20 do 100 stopni; C)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Znany również jako "2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol"</td></tr> <tr><td>Ultraczysta woda</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Typ 1 Czystość</td></tr><tr><td>Ultrafiolet&ndash; Spektrofotometr widzialny (UV-Vis)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Zdolny do absorbancji od 300 do 800 nm, rozdzielczość co najmniej 0,5 nm</td></tr><tr><td>Ultrafiolet&ndash; Spektrofotometr widzialny (UV-Vis) Kuweta kompatybilna, długość ścieżki 1 cm</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Może pomieścić co najmniej 2 ml, zdolny do 300 do 800 nm</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma obrazowania ultradźwiękowego Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>Przedkliniczny system obrazowania ultrasonograficznego</td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Bristol-Myers-Squibb</td><td></td><td>Nazywany w protokole "mieszadłem mechanicznym". Miesza przez 45 s.</td></tr><tr><td>Mikser Vortex</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

Krople zmiennofazowe to klasa ultradźwiękowych środków kontrastowych, które mogą przekształcić się w echogeniczne mikropęcherzyki in situ przy zastosowaniu wystarczającej energii akustycznej. Kropelki są mniejsze i bardziej stabilne niż ich odpowiedniki z mikropęcherzykami. Jednak tradycyjne ultradźwiękowe środki kontrastowe nie są możliwe do śledzenia poza pomiarami akustycznego sprzężenia zwrotnego, co utrudnia ilościowe określenie biodystrybucji lub akumulacji środka kontrastowego ex vivo. Naukowcy mogą być zmuszeni do polegania na fluorescencyjnych lub optycznie absorbujących towarzyszących cząstkach diagnostycznych, aby wywnioskować biodystrybucję. Celem tego protokołu jest wyszczególnienie etapów tworzenia multimodalnych kropel porfiryny zmiennofazowych przy użyciu metody kondensacji. Porfiryny to cząsteczki fluorescencyjne o wyraźnych pasmach absorbancji, które mogą być sprzężone z lipidami i włączane do kropelek w celu rozszerzenia wszechstronności kropel, umożliwiając bardziej solidną biodystrybucję przy zachowaniu właściwości akustycznych. Stworzono siedem preparatów o różnej zawartości lipidów porfirynowych i zasadowych w celu zbadania rozkładu wielkości mikropęcherzyków i kropel. W protokole opisano również charakterystyki odpowiednie dla struktur zawierających porfirynę, aby wykazać ich analityczną wszechstronność w roztworze. Wymiarowanie wykazało, że średnie średnice po skondensowaniu były od 1,72 do 2,38 razy mniejsze niż populacje prekursorów. Charakterystyka absorbancji wykazała, że nienaruszone zespoły miały pik w paśmie Q 700 nm, podczas gdy próbki zakłócone miały pik absorbancji przy 671 nm. Charakterystyka fluorescencji wykazała, że nienaruszone 30% zespołów porfirynowo-lipidowych zostało wygaszonych fluorescencyjnie (>97%), z odzyskiem fluorescencji osiągniętym po rozerwaniu. Waporyzacja akustyczna wykazała, że kropelki porfiryny są nieechogeniczne przy niższych ciśnieniach i mogą być przekształcane w echogeniczne mikropęcherzyki przy wystarczającym ciśnieniu. Charakterystyki te wskazują na potencjał kropelek porfiryny w eliminowaniu potrzeby stosowania absorbancji lub towarzyszących strategii diagnostycznych opartych na fluorescencji w celu ilościowego określenia biodystrybucji ultradźwięków środka kontrastowego do dostarczania lub zastosowań terapeutycznych in vivo lub ex vivo.

Przedskondensowane, wyselekcjonowane pod kątem wielkości próbki mikropęcherzyków (n = 3) oraz poskondensowane próbki kropel (n = 3) poddano pomiarowi wielkości za pomocą licznika Coulter (CC) z aperturą 10 µm. Ograniczeniem apertury 10 µm jest fakt, że nie pozwala ona na pomiar cząstek mniejszych niż 200 nm, co może wpływać na średnią wielkość i stężenie. Rycina 4 przedstawia dane dotyczące wielkości dla każdej z formulacji o różnej zawartości Pyro-lipidów. Tabela 1 przedstawia statystyki oparte na danych o wielkości. Wykorzystując stosunek średnich średnic przed i po kondensacji, wyniki wykazały, że formulacja z 0% Pyro-lipidów miała najmniejszą zmianę średniej średnicy, wynoszącą 1,72 ± 0,02. Formulacja z 50% Pyro-lipidów miała największą średnią średnicę, wynoszącą 2,38 ± 0,08. Próbka kropel z 1% Pyro-lipidów wykazała najwyższe zaobserwowane stężenie wynoszące (2,71 ± 0,13) × 1010 /mL, podczas gdy próbka kropel z 40% Pyro-lipidów miała najniższe zaobserwowane stężenie wynoszące (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Dane o wielkości wykazały, że próbka kropel z 10% Pyro-lipidów miała najmniejszą średnicę szczytową wynoszącą 261 ± 13 nm, natomiast próbka kropel z 50% Pyro-lipidów miała największą, wynoszącą 390 ± 55 nm. Ogólnie, wraz ze wzrostem zawartości Pyro-lipidów, stężenie spadało, a średnia średnica rosła. Ponieważ próbki poskondensowane bazują na prekursorowych próbkach mikropęcherzyków, trend ten wystąpił dla obu typów środków kontrastowych do ultradźwięków. Wraz ze wzrostem zawartości Pyro-lipidów zaczęła tworzyć się subpopulacja mikropęcherzyków (z rozmiarem szczytowym wynoszącym około 2000 µm). Ten wtórny szczyt nie występował w próbce mikropęcherzyków z 0% Pyro-lipidów i był najbardziej widoczny w populacjach z 40% i 50% Pyro-lipidów.
Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne pomiary absorbancji próbki kropli lipidowych Pyro 30%. Szczyt nienaruszonej próbki w PBS wynosił 700 nm, natomiast w przypadku próbki zniszczonej w Triton szczyt przesunął się do 671 nm. Wykazało to, że nienaruszone kompleksy posiadają inne właściwości optyczne w porównaniu do pojedynczych, niezłożonych komponentów lipidowych.
Rycina 6A przedstawia reprezentatywne pomiary fluorescencji próbki mikropęcherzyków przed kondensacją, natomiast Rycina 6B przedstawia próbkę kropel po kondensacji z 30% Pyro-lipid. Próbka nienaruszona w PBS wykazywała szczyt fluorescencji przy 704 nm, natomiast forma rozbita miała szczyt przy 674 nm. Odjęcie pola pod krzywą dla formy rozbitej od pola pod krzywą dla formy nienaruszonej, a następnie podzielenie różnicy przez pole pod krzywą dla formy rozbitej pozwala wyznaczyć wydajność wygaszania, która wyniosła odpowiednio 98,61% dla próbki mikropęcherzyków i 98,07% dla próbki kropel z 30% Pyro-lipid.
Aby zademonstrować proces przekształcania się kropel w mikropęcherzyki, wykonano obrazowanie i waporyzację rozcieńczonych kropel w fantomie przepływowym o temperaturze 37 °C przy użyciu systemu ultradźwiękowego. Rycina 7 przedstawia reprezentatywne obrazy ultradźwiękowe próbki kropel piro-lipidowych 30% obrazowanych przy różnych ciśnieniach. Przy niskich ciśnieniach (Rycina 7A) sygnał był bardzo słaby, ograniczając się jedynie do sygnału tła pochodzącego z pęcherzyków powietrza pozostałych po syntezie agaru. Wynika to z faktu, że krople są nieechogeniczne i nie rozpraszają fal ultradźwiękowych. Przy nieco wyższej mocy wygenerowano kilka mikropęcherzyków (Rycina 7B), co objawiło się pojawieniem jasnych plamek. Wraz ze wzrostem ciśnienia generowano coraz więcej mikropęcherzyków (Rycina 7C oraz 7D). Wykazano tym samym, że krople nie waporyzują się samoistnie w temperaturze 37 °C.
<img alt="Etapy procesu chemicznego w zamkniętych fiolkach; roztwory w słoikach (A-F) do analizy eksperymentu syntezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zdjęcia kroków prowadzących do otrzymania 30% roztworu Pyro-lipidów. A) Proszek lipidowy oraz Pyro-SPC w chloroformie. B) Dodany roztwór rozpuszczający. C) Wysuszony film lipidowy osadzony na wewnętrznej ściance fiolki. D) Fiolka z lipidami owinięta folią aluminiową (zewnętrzna folia zaklejona taśmą w celu ponownego użycia). E) Nawodniony roztwór lipidowy. F) Roztwór lipidowy w fiolce do surowic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="System próżniowy i kolektor gazowy, schemat przedstawiający zawory i pompę membranową dla układu transportu gazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: 10-kanałowy wymiennik gazowy. Oznaczone są zawory wspomniane w protokole. Instrukcje dotyczące montażu wymiennika gazowego znajdują się w pliku uzupełniającym „Other Protocols and Data”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Fiolki z różnymi stężeniami do eksperymentu rozpuszczalności, pokazujące zmianę koloru cieczy i osad." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: A) Roztwory lipidowe 7 formulacji (0% do 50% Pyro-SPC) w fiolkach z próbkami. Ryciny B do D przedstawiają etapy przygotowania 30% kropli Pyro-lipidowych. B) 30% roztwór Pyro-lipidowy w fiolce z próbką. C) Po agitacji. D) Po 15 min selekcji rozmiaru. E) Przeniesienie dolnej frakcji do fiolki z decafluorobutanem. D) Po kondensacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy stężeń pęcherzyków i kropel; analiza średnicy w stosunku do stężenia z wynikami na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Dane dotyczące wielkości z licznika Coulter (CC) dla próbek mikro-pęcherzyków i kropel o wyselekcjonowanym rozmiarze z różną zawartością otoczki pirolipidowej (n = 3). Ciągłe zielone linie reprezentują mikro-pęcherzyki, a przerywane cyjanowe linie reprezentują krople. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) Całkowite zaobserwowane stężenia próbek mikro-pęcherzyków i kropel z CC w zależności od zawartości Pyro-SPC w otoczce. Wszystkie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Wszystkie pomiary zostały wykonane przy użyciu apertury 10 µm, która posiada zakres wielkości od 200 nm do 6000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres widma absorbancji; porównanie Triton, PBS z kroplami Pyro; piki absorpcji przy 430, 700 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne pomiary absorbancji w spektroskopii ultrafioletowej i widzialnej (UV-Vis) w zakresie od 300 do 800 nm dla próbki post-kondensowanych kropel lipidowych Pyro 30% rozcieńczonych w PBS oraz w 1% Triton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres widm fluorescencji; pęcherzyki/kropelki pyro, Triton/PBS; długość fali, intensywność, wykres porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Reprezentatywna emisja fluorescencji od 600 do 750 nm przy wzbudzeniu 410 nm. A) Próbka mikropęcherzyków Pyro-lipidowych 30% w PBS i w 1% Triton, wyselekcjonowana pod względem wielkości, przed kondensacją. B) Próbka kropelek Pyro-lipidowych 30% w PBS i w 1% Triton, po kondensacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy dynamicznego przepływu, krople pyro w PBS, zmiana ciśnienia od 0,73 do 4,36 MPa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne fantomu przepływowego z agaru w temperaturze 37 °C, wykonane przy użyciu przedklinicznego liniowego przetwornika 21 MHz w trybie B (patrz Tabela Materiałów). Lewa kolumna (Ryciny A, C, E,&amp; G) przedstawia kontrole PBS. Prawa kolumna (Ryciny B, D, F,&amp; H) przedstawia próbkę 20 µL po-kondensowanych kropli 30% Pyro-lipid rozcieńczonych w 50 mL PBS w temperaturze 37 °C. Każdy wiersz reprezentuje szczytowe ujemne ciśnienia w polu swobodnym, które zostały oszacowane na podstawie pracy Sheeran et al.8 Żółte trójkąty wskazują głębokość ogniskowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metoda</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Powłoka pirolityczna %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Pęcherzyki</td>
			<td>Stęż. [/mL]</td>
			<td>(2.76 ± 0.28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1.91 ± 0.22) × 10^10</td>
			<td>(1.47 ± 0.05) × 10^10</td>
			<td>(8.47 ± 0.95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0.15) × 10^9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Pęcherzyki</td>
			<td>Szczyt [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Pęcherzyki</td>
			<td>Średnia [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Pęcherzyki</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Kropelki</td>
			<td>Stężenie [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.75 ± 0.18) × 10^10</td>
			<td>(1.72 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Kropelki</td>
			<td>Szczyt [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Kropelki</td>
			<td>Średnia [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Krople</td>
			<td>Mediana [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5 </td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Statystyki danych dotyczących rozmiarów próbek mikropęcherzyków i kropli z różną zawartością Pyro-SPC, zmierzone za pomocą licznika Coulter (CC) (n = 3). Wszystkie błędy oznaczają odchylenie standardowe.
Informacje uzupełniające - Arkusz wzorów lipidowych: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Informacje uzupełniające – pozostałe protokoły i dane: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary_Information-Other_Protocols_and_Data.docx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

W tym protokole opisane są metody syntezy i charakterystyki kropel porfiryny o wielomodalnej przemianie fazowej.

Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia pełną procedurę tworzenia kropelek od filmu lipidowego do roztworu lipidowego do mikropęcherzyków, a następnie do kropel. Główną zaletą tej techniki jest prostota kondensacji mikropęcherzyków w kropelki. Wystarczy schłodzić i zawirować, aby kropelki mogły być wytwarzane bez konieczności utrzymywania ciśnienia.Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ prostym testem mającym na celu sprawdzenie, czy mikropęcherzyki zostały pomyślnie zagęszczone, jest wizualne sprawdzenie zmiany przezierności. Procedurę zademonstruje Kimoon Yoo, student studiów magisterskich w laboratorium Gang Zheng. Za pomocą decappera usuń aluminiową uszczelkę z fiolki surowicy i przenieś jeden mililitr roztworu lipidów do fiolki z próbką ze szkła borokrzemianowego o pojemności 1,85 mililitra za pomocą zakrętki fenolowej, pozwalając roztworowi lipidów spłynąć po wewnętrznej ściance bez tworzenia pęcherzyków.Za pomocą fiolki z próbką o pojemności 1,85 mililitra przygotuj się do przepływu dekafluorobutanu do przestrzeni nad fiolką z próbką za pomocą wymiennika gazowego. Upewnij się, że wszystkie zawory na wymienniku gazowym są prawidłowo zamknięte, a pompa jest wyłączona. Otwórz zawór kolektora i ostrożnie wyjmij odpowiednią igłę z kolektora.Otwórz zawór ciśnieniowy A i zawór ciśnieniowy B i przekręć zawór butli gazowej o około 1/16 do 1/8 w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby częściowo go otworzyć. Otwórz zawór z uchwytem T i odkręć fiolkę z próbką roztworem lipidów. Umieścić igłę kolektora nad interfejsem ciekłego powietrza fiolki, powoli obracać zawór regulatora powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż igła regulatora powietrza przesunie się nieznacznie z pozycji spoczynkowej i pozwolić, aby gaz perfluorowęglowy delikatnie przepływał do przestrzeni nad fiolką przez 30 sekund, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.W razie potrzeby wyreguluj zawór regulatora powietrza. Po 30 sekundach ostrożnie i szybko zachowaj fiolkę z próbką, nie przesuwając jej zbyt mocno. Zarówno zawór butli gazowej, zawór uchwytu T, zawór regulatora powietrza, zawór ciśnieniowy A, zawór ciśnieniowy B i zawór kolektora.Ostrożnie owinąć igłę, a następnie oznaczyć fiolkę z próbką i uszczelnić szyjkę folią woskową zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Fiolkę z próbką należy przechowywać w ciemności i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut lub do 24 godzin. Umieść około 100 gramów suchego lodu w izolowanym pojemniku, a zwykły lód w innym izolowanym pojemniku.Pobrać wcześniej przygotowaną fiolkę z dekafluorobutanem na 1,5-calowe igły o rozmiarze 20, plastikową strzykawkę o średnicy jednego mililitra, pojemnik o pojemności 200 mililitrów, metalowe szczypce i termometr. Umieścić fiolkę z próbką z roztworem lipidów w mieszadle mechanicznym i mieszać przez 45 sekund. Powinna nastąpić zmiana koloru i przezierności.Po mechanicznym wymieszaniu należy ustawić fiolkę z próbką prawą stroną do góry, osłoniętą przed światłem i rozpocząć 15-minutowe odliczanie do schłodzenia fiolki i dobrania wielkości mikropęcherzyków. Gdy odliczanie osiągnie 10 minut, napełnij pojemnik około 200 mililitrami izopropanolu i schłodzić go do minus 20 stopni Celsjusza suchym lodem za pomocą metalowych szczypiec. Po wybraniu wielkości mikropęcherzyków przez 15 minut, należy poszukać przegrody o wybranym rozmiarze wewnątrz fiolki z próbką.Trzymając fiolkę z próbką prawą stroną do góry, ostrożnie odkręć fiolkę z próbką i wyjmij około 0,7 mililitra dolnej przegrody za pomocą igły o średnicy 1,5 cala o rozmiarze 20 przymocowanej do plastikowej strzykawki o średnicy jednego mililitra. Upewnij się, że żadna z górnych przegród nie została usunięta i nie potrząsaj strzykawką w celu usunięcia kieszeni powietrznych. Kierując się do środkowego okręgu na gumowym korku, włóż inną igłę o rozmiarze 20 do fiolki z dekafluorobutanem, trzymając igłę w pobliżu górnej części fiolki z surowicą, aby odpowietrzyć, a następnie włóż igłę z wybranymi mikropęcherzykami o rozmiarze.Powoli przenieś wybrane mikropęcherzyki o odpowiedniej wielkości. Pozwól, aby płyn delikatnie zsunął się po wewnętrznej ściance fiolki z dekafluorobutanem. Po przeniesieniu całego roztworu mikropęcherzyków o wybranej wielkości, wyjmij igłę ze strzykawką, ale trzymaj igłę odpowietrzającą, aby zmniejszyć podciśnienie.Dodać niewielkie ilości suchego lodu lub izopropanolu o temperaturze pokojowej do kąpieli izopropanolowej, aby upewnić się, że temperatura kąpieli wynosi od minus 15 do minus 17 stopni Celsjusza. Z igłą odpowietrzającą o rozmiarze 20 włożoną w górną część fiolki z surowicą, umieścić fiolkę z surowicą i kąpiel izopropanolową, utrzymując poziom mikropęcherzyków poniżej poziomu izopropanolu, ale szyjkę fiolki powyżej niej i z przerwami obracaj fiolkę z surowicą przez dwie minuty, aby skondensować mikropęcherzyki. Nie obracać fiolki z surowicą w sposób ciągły w izopropanolu i nie dopuścić do zamarznięcia roztworu.Obracać przez około pięć sekund i wyjąć fiolkę z surowicą z izopropanolu. Sprawdź, czy nie ma zarodków lodu, a następnie wznów wirowanie w izopropanolu. Jeśli tworzy się lód, należy zakręcić fiolkę z surowicą w powietrzu, aż się rozproszy.Po dwuminutowej kondensacji wyjąć fiolkę surowicy z kąpieli izopropanolowej i usunąć igłę odpowietrzającą. Mikropęcherzyki powinny skondensować się w kropelki, na co wskazuje zmiana przezierności. Wytrzyj fiolkę z surowicą, oznacz ją i umieść na zwykłym lodzie w ciemnym izolowanym pojemniku, aż będzie gotowa do użycia.Nieotwarte kropelki z nienaruszoną aluminiową uszczelką powinny być stabilne do sześciu godzin, o ile stopiony lód zostanie wymieniony w razie potrzeby. Gdy produkt będzie gotowy do użycia, usuń aluminiową uszczelkę za pomocą odkręcacza. Po zastosowaniu tego protokołu, wstępnie skondensowane, wybrane mikropęcherzyki i post-skondensowane kropelki zostały zwymiarowane na liczniku Coulter z aperturą 10 mikronów.Przedstawiono dane dotyczące wielkości preparatu 30% pirolipidowego. Statystyki oparte na danych dotyczących rozmiaru są pokazane tutaj. Wykorzystując stosunek średnich średnic przed i po skondensowaniu, wyniki wykazały, że wraz ze wzrostem zawartości pirolipidów stężenie spadało, a średnia średnica wzrastała.Przedstawiono reprezentatywne pomiary absorbentów w próbce kropelek 30% pirolipidów. Wykazało to, że nienaruszone zespoły mają różne właściwości optyczne, odzwierciedlone przez różne piki w porównaniu z pojedynczymi niezmontowanymi składnikami lipidowymi. Przedstawiono tutaj reprezentatywne pomiary florescencji wstępnie skondensowanej mikropęcherzykowej, postskondensowanej próbki kropelkowej z 30% pirolipidem, wykazujące różne piki fluorescencji dla nienaruszonych próbek w postaci zaburzonej.Pokazano reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne próbki 30% kropelek pirolipidów zobrazowanej pod różnymi ciśnieniami. Przy niskich ciśnieniach obserwowano tylko sygnał tła z pęcherzyków powietrza zablokowanych w wyniku syntezy agaru. Przy nieco większej mocy wygenerowano kilka mikropęcherzyków, o czym świadczy pojawienie się jasnych plamek.Wraz ze wzrostem ciśnienia powstawało więcej mikropęcherzyków. Ważne jest, aby pamiętać, że temperatura kondensacji jest tutaj zoptymalizowana dla tej konkretnej formuły skorupy kropelkowej. Różne formuły powłok mogą wymagać różnej temperatury.

synthesis-characterization-multi-modal-phase-change-porphyrin

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy protokół do badania wieloskładnikowych diagramów fazowych przy użyciu zewnętrznie kontrolowanych kulek magnetycznych jako nośników cieczy w podejściu lab-in-tube. Takie podejście może być pomocne w zastosowaniach, które mają na celu zebranie dalszych informacji na temat przemiany fazowej w złożonych układach cieczowych.

Charakterystyka diagramu fazowego z wykorzystaniem kulek magnetycznych jako nośników cieczy

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Przedstawiono protokół syntezy i przygotowania nanocząstek składających się z elektroaktywnych polimerów.

Elektroaktywne nanocząstki polimerowe wykazujące właściwości fototermiczne

Przedstawiono protokół syntezy i charakterystyki ruchu dyfuzyjnego cyklicznych polimerów na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Synteza polimerów cyklicznych i charakterystyka ich ruchu dyfuzyjnego w stanie stopionym na poziomie pojedynczej cząsteczki

Przedstawiono protokoły syntezy mikrosfer z polimerów, manipulacji mikrosferami i pomiarów mikrofotoluminescencji.

Wytwarzanie mikrosfer polimerowych do zastosowań w rezonatorach optycznych i laserach

Tutaj prezentujemy protokoły analiz detekcji różnicowej czasowo-rozdzielczej spektroskopii oscylacyjnej w podczerwieni i dyfrakcji elektronów, które umożliwiają obserwacje deformacji lokalnych struktur wokół fotowzbudzonych cząsteczek w kolumnowym ciekłym krysztale, dając atomową perspektywę na związek między strukturą a dynamiką tego fotoaktywnego materiału.

Nowatorskie techniki obserwacji dynamiki strukturalnej fotoczułych ciekłych kryształów

Protokół wykorzystujący ulepszoną metodę QM/MM do zbadania wpływu izotopowego na proces podwójnego transferu protonów w porficenie jest przedstawiony tutaj.

Wpływ izotopowy porficenu w procesie podwójnego transferu protonów badany metodą Enhanced QM/MM

Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta jest ważną metodologią generowania sprzężonych z metyną bicyklicznych związków aromatycznych. Dzięki wykorzystaniu wariantu reakcji aldolowej, w którym pośredniczy zasada, można uzyskać dostęp do szeregu cząsteczek fluorescencyjnych i/lub biologicznie istotnych za pomocą ogólnie niedrogiego i prostego w obsłudze podejścia do syntezy.

Synteza zależnych od pH pirazoli, imidazolu i izoindolonu dipirynonu przy użyciu podejścia kondensacyjnego Claisena-Schmidta

Ten protokół opisuje metodę generowania dużych ilości mikropęcherzyków dekafluorobutanu zamkniętych w lipidach za pomocą sonikacji końcówki sondy, a następnie kondensacji ich w nanokropelki z przesunięciem fazowym za pomocą wytłaczania wysokociśnieniowego i filtracji mechanicznej.

Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Optycznie aktywowane nanokropelki perfluorocarbonu są obiecujące w zastosowaniach obrazowania poza układem naczyniowym. W tym artykule pokażemy, jak syntetyzować te cząstki, sieciować fantomy poliakrylamidu i modulować kropelki akustycznie, aby wzmocnić ich sygnał.

Formulacja i modulacja akustyczna optycznie odparowanych nanokropel perfluorowęglowodoru

Poznaj metodę syntezy multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej bez konieczności stosowania ciśnienia. Protokół obejmuje kondensację mikropęcherzyków przez chłodzenie i mieszanie oraz wizualną kontrolę zmiany przezroczystości.

Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Przeglądaj więcej filmów