Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

Protokół ten opisuje metody wizualizacji morfologii kolców dendrytycznych i stanów przejściowych wapnia w neuronach C.elegans. Nasze podejście powinno ułatwić podejście genetyczne do odkrywania determinantów morfogenezy i funkcji kręgosłupa. Nasz protokół obejmuje kolce dendrytyczne w neuronach GABA-ergicznych.

Kolce w innych klasach neuronów C.elegans mogą być również badane za pomocą tych metod. Nasz protokół opisuje metody unieruchamiania żywych C.elegans. Szczególnie ważne jest, aby zapobiec ruchom zwierząt podczas akwizycji obrazu i wybrać odpowiednie konfiguracje lasera do pobudzania i rejestrowania aktywności neuronalnej.

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, dodaj trzy mikrolitry roztworu znieczulającego i nałóż od 15 do 20 młodych dorosłych robaków na 10% płatki agarozowe. Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe, aby unieruchomić ślimaki i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego stopioną mieszanką kleju uszczelniającego. Aby uzyskać akwizycję w super rozdzielczości, użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w mikroskopię superrozdzielczą.

Zdobądź stosy Z, używając rozmiaru kroku zalecanego przez oprogramowanie producenta. Zbierz serię odcinków optycznych, które obejmują całkowitą objętość grzbietowego wyrostka brzusznego D lub DD. Prześlij stosy Z do przetworzenia obrazu za pomocą oprogramowania producenta i przeanalizuj obrazy z wynikiem wyższym niż siedem.

Do akwizycji Nyquista użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i wybierz optymalny rozmiar piksela dla długości fali światła i apertury numerycznej soczewki obiektywu. Następnie prześlij stos do dekonwolucji 3D za pomocą automatycznego algorytmu. Do analizy obrazu użyj odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby utworzyć projekcje maksymalnej intensywności stosów Z.

I ręcznie policz wypukłości na dendrycie DD. Następnie określ długość naciętego dendrytu DD, aby obliczyć gęstość kolców na 10 mikrometrów dendrytu DD. Następnie sklasyfikuj kolce jako cienkie lub grzybowe, filopodialne, przysadziste lub rozgałęzione.

Korzystając z konwencjonalnych technik, takich jak mikroiniekcja, stwórz transgeniczne robaki wyrażające czujnik wapnia GCaMP w neuronach DD i Chrimson, przesuniętą ku czerwieni rodopsynę kanałową w presynaptycznych neuronach VA. Następnie, pod kapturem laminarnym, przygotuj wszystkie płytki trans-siatkówkowe lub ATR, dodając 300 mikrolitrów wyhodowanej przez noc kultury bakteryjnej OP50 i 0,25 mikrolitra ATR do każdej 60-milimetrowej płytki agarowej z podłożem odżywczym dla nicieni. Następnie rozprowadź kulturę za pomocą sterylnego szklanego pręta.

W przypadku płytek kontrolnych dodaj 300 mikrolitrów bakterii OP50 i 0,25 mikrolitrów etanolu. Aby umożliwić rozwój bakterii, inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, chroniąc je przed światłem otoczenia. Aby przygotować eksperyment, umieść pięć larw w stadium L4 na płytkach ATR lub kontrolnych z nasionami OP50 i inkubuj płytki w ciemności w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Po trzech dniach użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby potwierdzić rozwój sromu i wybierz potomstwo w stadium L4 z płytek ATR i kontrolnych do obrazowania. Następnie umieść dwa mikrolitry polikulek o grubości 0,05 mikrometra na szkiełku mikroskopowym. I umieść około 10 larw L4 w roztworze.

Za pomocą drutu platynowego dodaj do roztworu małą kuleczkę super kleju. Delikatnie zamieszaj roztwór, aby wytworzyć nitkowate pasma kleju. Następnie dodaj trzy mikrolitry buforu M9.

Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij jego krawędzie, jak pokazano wcześniej. Aby zarejestrować wywołane stany przejściowe wapnia w kolcach dendrytycznych, użyj mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i dostosuj stolik mikroskopu, aby ustawić kolce DD w płaszczyźnie ogniskowej. Następnie skonfiguruj akwizycję poklatkową, aby oświetlić próbkę linią laserową o długości 488 nanometrów w każdej klatce w celu wykrycia fluorescencji GCaMP oraz linią laserową o długości 561 nanometrów w okresowych odstępach czasu w celu wzbudzenia Chrimsona.

W przypadku obrazowania wapnia in vivo należy użyć dekonwolucji 2D i wyrównania obrazu, aby skorygować niewielkie odchylenia od ruchu robaka podczas akwizycji. Następnie zdefiniuj grzbiet dendrytyczny DD jako obszar zainteresowania lub ROI. Zduplikuj zwrot z inwestycji i przenieś się do sąsiedniego regionu wewnątrz robaka, aby zebrać sygnał w tle.

Następnie, za pomocą odpowiedniego oprogramowania, wyeksportuj intensywności GFP do Excela dla każdego punktu czasowego i odejmij fluorescencję tła od fluorescencji ROI kręgosłupa. Określ zmianę fluorescencji, odejmując fluorescencję GFP w układzie bezpośrednio przed wzbudzeniem 561 nanometrów lub w punkcie zerowym od każdego punktu czasowego po wzbudzeniu lub Delta F. Następnie podziel przez F zero, aby wyznaczyć Delta F przez F zero. I narysuj na wykresie znormalizowane ślady.

Najpierw określ, czy dane są normalnie rozłożone, używając testu Shapiro-Wilka. W przypadku danych, które nie mają rozkładu normalnego, należy użyć nieparametrycznej analizy ANOVA z korektą post-hoc dla wielu testów. Alternatywnie, w przypadku pomiarów pokazujących rozkład normalny lub gaussowski, należy wykonać sparowany parametryczny test ANOVA dla każdego pomiaru fluorescencji GCaMP przed i po każdym impulsie 561 nanometrów.

I popraw dla wielokrotnych porównań w każdej z dwóch grup. Znakowanie kolców dendrytycznych DD za pomocą trzech niezależnych markerów, cytozolowego mCherry, MYR:mRuby i LifeAct:GFP dało średnią gęstość 3,4 kolców dendrytycznych DD na 10 mikronów dendrytu DD u młodych dorosłych typu dzikiego. Marker GFP:Utrophin został wykluczony z tej analizy, ponieważ dawał znacznie niższą gęstość kręgosłupa, potencjalnie z powodu interakcji utrofiny z cytoszkieletem aktyny, który napędza morfogenezę kręgosłupa.

Podejście do obrazowania żywych komórek potwierdziło, że cienka morfologia kolców DD w kształcie grzyba dominuje u dorosłego osobnika w porównaniu z alternatywnymi kształtami kręgosłupów, takimi jak filopodialny, przysadzisty i rozgałęziony. Aktywację kolców dendrytycznych DD oceniano za pomocą presynaptycznej sygnalizacji cholinergicznej u transgenicznych robaków eksprymujących GCaMP w neuronach DD i Chrimson w presynaptycznych neuronach VA. Przejściowe impulsy sygnału GCaMP wykryto w kolcach DD natychmiast po optogenetycznej aktywacji Chrimson w presynaptycznych neuronach VA.

Eksperyment kontrolny przy braku ATR potwierdził, że pomiar sygnału GCaMP zależy od optogenetycznej aktywacji Chrimson, która jest ściśle zależna od ATR. Aby uwidocznić kolce DD, najlepiej jest wyobrazić sobie zwierzęta leżące na boku, takie jak wystające kolce są pod kątem prostym do ścieżki światła. Dzięki tej metodzie naukowcy mogą również wykorzystać manipulacje farmakologiczne, aby zrozumieć mechanizmy, które napędzają stany przejściowe wapnia w kolcach DD.