Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Protokół ten ułatwia badania przesiewowe nowych preparatów, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób modyfikacje wpływają na czas przebywania w tkankach, co ma kluczowe znaczenie dla zaprojektowania optymalnego systemu dostarczania leków. Technika ta jest nieinwazyjna i umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym, co ogranicza nadmierne wykorzystanie zwierząt do pobierania próbek. Systemy dostarczania leków można przeprojektować pod kątem zastosowań obrazowych i terapeutycznych, po prostu łącząc lek terapeutyczny i ugrupowanie obrazowania w jednym nanonośniku.

Ma to przydatne zastosowanie zarówno w leczeniu raka, jak i chorób zakaźnych. Procedurę zademonstruje Rasha Msallam, starszy pracownik naukowy z mojego laboratorium. Na początek, dwie godziny przed wstrzyknięciem podspojówkowym, wstrzyknij myszu dożylnie przez ogon 2,5 miligrama na kilogram błękitu Evansa lub EB. Po uśpieniu myszy 5% izofluranem, przenieś mysz do stożka nosowego i utrzymuj uspokojoną mysz na poduszce grzewczej.

Następnie przyciąć wąsy w pobliżu oka, które mają być wstrzyknięte. Wkraplać kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proksymetakainy bezpośrednio na oko. Następnie załaduj szklaną strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 32 z fluorescencyjnymi liposomami i upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie są obecne w strzykawce.

Za pomocą pęsety podnieś spojówkę i powoli wstrzyknij liposomy do przestrzeni podspojówkowej, a następnie powoli wycofaj igłę, zapobiegając cofaniu się. Upewnij się, że tworzy się pęcherzyk wypełniony fluorescencyjnymi liposomami. Podaj 1% kroplę kwasu fusitynowego na oko i monitoruj mysz do momentu odzyskania przytomności.

Włączyć system CLM. Podłącz sondę do systemu CLM. W tym momencie wybierz pole widzenia i lokalizację plików akwizycji.

Dostosuj intensywność lasera, aby upewnić się, że detekcja fluorescencji fluoresceiny DHPE mieści się w zakresie liniowym i utrzymuj stałą intensywność w celu porównania obrazów wykonanych w różnych punktach czasowych. Po rozgrzaniu systemu przez 15 minut należy skalibrować go zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z zestawu kalibracyjnego zawierającego roztwory oczyszczające, płuczące i fluoro-4 dla każdego lasera. Krótko mówiąc, rozpocznij kalibrację, zanurzając końcówkę na pięć sekund w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania.

Pozostaw końcówkę w powietrzu do nagrywania w tle, aby znormalizować wartości tła z różnych włókien sondy, zapewniając jednolitość obrazu. Ponownie zanurz końcówkę na pięć sekund w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania. Następnie zanurz końcówkę w fiolce zawierającej fluoro-4 488-nanometr na pięć sekund, aby znormalizować wartości sygnału.

Powtórzyć zanurzenie końcówki na pięć sekund w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania. Trzymaj końcówkę w fiolce do płukania do momentu zniknięcia sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego w poprzednim kroku. Następnie przenieś końcówkę do fiolki zawierającej fluoro-4 660 nanometrów, aby znormalizować wartości sygnału z różnych włókien w sondzie.

Po kalibracji upewnij się, że wartość tła sondy jest mniejsza niż 100. W przeciwnym razie należy wielokrotnie czyścić sondę aplikatorem z bawełnianą końcówką. Włącz regulator temperatury zwierzęcia z dołączoną poduszką grzewczą i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.

Po przykryciu poduszki grzewczej obłożeniem chirurgicznym, przymocuj stożek nosowy do poduszki grzewczej. Po uspokojeniu myszy za pomocą 5% izofluranu w komorze indukcyjnej, przenieś mysz do stożka nosowego i utrzymuj uspokojoną mysz na poduszce grzewczej. Następnie wkroplić kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proksymetakainy znieczulającego do oka.

Aby umyć powierzchnię oka i uniknąć krystalizacji soczewki, utrzymuj oczy nawilżone, upuszczając kilka kropli soli fizjologicznej. Następnie obróć i wyreguluj okular mikroskopu, aby ergonomicznie view oko myszy w bezpośrednim ogniskowaniu przy powiększeniu 0,67 razy. Włącz laser i umieść sondę jak długopis bezpośrednio na obszarze oka, który ma być obrazowany.

Następnie rozpocznij rejestrowanie akwizycji, aby obserwować fluorescencję w oku w obszarze zainteresowania. Zatrzymaj nagrywanie, gdy wszystkie regiony zostaną oznaczone i oznaczone zgodnie z mapą oka, aby poznać dokładną lokalizację sondy w dokładnej klatce. Pliki akwizycji zostaną automatycznie zapisane jako pliki wideo w wcześniej wybranej lokalizacji.

Obrazowanie fluorescencyjne wykazało wyraźne zróżnicowanie między obszarami twardówki i rogówki. Wysokie unaczynienie twardówki i spojówki spowodowało, że obszar twardówki zabarwił się na czerwono z EB. Rogówka, która nie ma unaczynienia, wydawała się. Kontrastową fluorescencję rąbka i twardówki obserwowano w badaniu siedmiodniowym.

Myszy kontrolne wstrzyknięte barwnikiem fluoresceinowym potwierdziły specyficzność fluorescencji pochodzącej z liposomów. Intensywność fluorescencji była wysoka w pierwszym i trzecim dniu. Zielona fluorescencja z czasem zmniejszała redukcję liposomów w obszarach rąbka i twardówki.

Różnice w sygnałach fluorescencyjnych od pierwszego dnia po wstrzyknięciu do trzeciego dnia w regionach rąbka skroniowego i rąbka górnego nie były istotne, co wskazuje na preferencję neutralnych liposomów do obszaru rąbka, szczególnie na obrzeżach rogówki. W przypadku obszarów skroniowych i górnych w pierwszym dniu po wstrzyknięciu fluorescencja w twardówce była sześciokrotnie wyższa niż w rąbku. W trzecim i siódmym dniu liposomy były znacznie zmniejszone w twardówce w okolicy skroniowej i górnej, co przypisuje się mechanizmom klirensu ocznego.

Najmniejszą ilość fluorescencji wykryto w okolicy nosowej i dolnej, ze względu na odległość od miejsca wstrzyknięcia. Ważne jest, aby oznaczyć klatki plamki zgodnie z mapą oka przed zatrzymaniem nagrywania. Utrzymuj stałą intensywność lasera i zdefiniuj maksymalną wartość tła w celu prawidłowego porównania między różnymi eksperymentami.

Po zidentyfikowaniu postaci ołowianych można przeprowadzić kompleksowe badania farmakokinetyczne i biodystrybucji na zwierzętach w celu zbadania biodostępności leku i walidacji skuteczności terapeutycznej jego preparatów.