Name: Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii do obrazowania dystrybucji liposomów w oku myszy. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie systemów dostarczania leków w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez grant NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) przyznany (SV) oraz częściowo przez Singapore National Research Foundation Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 oraz Singapore's Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) grant H18/01/a0/018 administrowany przez Agencję ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR) (dla AMC). Podziękowania dla członków z Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) za ułatwienie logistyki i realizacji badań oraz szkoleń na sprzęcie. Specjalne podziękowania dla Pani Wisny Novera za pomoc redakcyjną.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) w SingHealth (Singapur). Samice myszy C57BL/6 J (w wieku 6-8 tygodni; 18-20 g) uzyskano z InVivos w Singapurze i umieszczono w wiwarium o kontrolowanej temperaturze i świetle w Duke-NUS Medical School w Singapurze. Zwierzęta były leczone zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
UWAGA: Schemat blokowy przedstawiający główne procedury jest pokazany w Rysunek 2.
1. Przygotowanie środków kontrastowych: Evans Blue (EB) i liposomów
<ol>
	<li>Aby uzyskać 2% roztwór barwnika EB, rozpuść 1 g EB w 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Przefiltruj roztwór za pomocą filtrów 0,22 μm do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj je w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia.</li>
	<li>W przypadku liposomów o zielonej fluorescencji dodać POPC/Fl-DHPE (95:5), chloroform/metanol (2:1) do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml. Użyj wyparki obrotowej o prędkości 150 obr./min w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę, z podciśnieniem utrzymywanym na poziomie 0 mbar1, aby utworzyć cienki film lipidowy. 
	UWAGA: Porównując wpływ właściwości liposomalnych (np. rozmiar, ładunek, nasycenie lipidów, długość łańcucha lipidowego) na dystrybucję, należy utrzymać stałą zawartość procentową Fl-DHPE lub innych fluorescencyjnych lipidów, aby potwierdzić, że obserwowane wyniki wynikają z wpływu badanych właściwości, a nie ze zmiennego obciążenia dużych barwników hydrofobowych.</li>
	<li>Uwodnić warstwę lipidową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (w celu uzyskania 26,3 mM liposomów fluorescencyjnych) w temperaturze 40 °C, aby utworzyć pęcherzyki wieloblaszkowe (MLV). Załaduj MLV do szklanej strzykawki w celu ręcznego wytłaczania (30 razy przy użyciu filtra poliwęglanowego o wielkości porów 0,08 μm), aby uzyskać żądany rozmiar 100 nm. 
	UWAGA: Temperatura nawodnienia musi być wyższa niż temperatura przejścia lipidów.</li>
	<li>Przefiltruj liposomy, przepuszczając je przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm. Potwierdź średnicę hydrodynamiczną (DH) liposomów za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła.</li>
</ol>
2. Podawanie EB i liposomów żywym myszom
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszu EB IV (dożylnie) przez żyłę ogonową (2,5 mg/kg), 2 godziny przed wstrzyknięciem podspojówkowym.</li>
	<li>W przypadku wstrzyknięcia podspojówkowego, najpierw uspokoić mysz za pomocą 5% izofluranu poprzez inhalację w komorze indukcyjnej, aby uzyskać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia. Przenieś mysz do stożka nosowego i utrzymuj sedację na poziomie 2%-2,5% izofluranu podczas korzystania z poduszki grzewczej przez cały zabieg.</li>
	<li>Przyciąć wąsy w pobliżu oka, które ma być wstrzyknięte, i wkroplić kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proksymetakainy do środka znieczulającego bezpośrednio na oko.</li>
	<li>Do szklanej strzykawki o pojemności 10 μl (z igłą 32 G) należy napełnić liposomami fluorescencyjnymi (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) i przed wstrzyknięciem usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki. 
	UWAGA: W przestrzeni podspojówkowej myszy można umieścić do 20 μl iniekcji myszy 18,19.</li>
	<li>Za pomocą pęsety lekko unieś spojówkę i powoli wstrzyknij do przestrzeni podspojówkowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Powoli wyjmować igłę, aby zapobiec cofaniu się. Upewnij się, że utworzy się widoczny pęcherzyk wypełniony fluorescencyjnymi liposomami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy podać kroplę antybiotyku 1% kwasu fusydowego na oko i monitorować mysz aż do odzyskania przytomności.</li>
</ol>
3. Konfiguracja CLM
<ol>
	<li>Włącz system CLM i upewnij się, że zarówno złącze, jak i dystalna końcówka sondy skanującej są czyste.</li>
	<li>Wyczyść złącze sondy skanującej za pomocą środka do czyszczenia złączy optycznych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Naciśnij zapadkę (często kolorową) środka do czyszczenia złączy optycznych, aby odsłonić wstążkę czyszczącą.</li>
		<li>Umieść złącze w kontakcie z taśmą czyszczącą i przesuń złącze wzdłuż taśmy, zachowując kontakt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść dystalną końcówkę (znaną również jako końcówka skanująca) sondy, zanurzając ją w roztworze czyszczącym, a następnie w roztworze płuczącym dostarczonym przez producenta. Aplikator z bawełnianą końcówką może być również używany do dokładniejszego czyszczenia, jeśli końcówka jest bardzo brudna.</li>
	<li>Podłącz sondę do systemu CLM. W tym momencie wybierz pole widzenia (FOV) i lokalizację plików akwizycji. 
	UWAGA: Dostosuj intensywność lasera na tym etapie, aby upewnić się, że wykrywanie fluorescencji dla Fl-DHPE mieści się w zakresie liniowym. Intensywność lasera musi być spójna w celu porównania obrazów wykonanych w różnych punktach czasowych.</li>
	<li>Pozwól systemowi rozgrzać się przez 15 minut zgodnie z instrukcją i użyj zestawu kalibracyjnego, aby skalibrować system zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: W zestawie kalibracyjnym znajdują się trzy fiolki do każdego lasera zawierające następujące roztwory: roztwór czyszczący, roztwór do płukania i roztwór fluoroforu 488/660 nm do kalibracji wewnętrznej. Kroki kalibracji są wyświetlane przez system i należy ich odpowiednio wykonać.
	<ol>
		<li>Zanurzyć końcówkę w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania (5 s w każdej fiolce). Pozostaw go w powietrzu do nagrywania w tle dla obu kanałów. 
		UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ normalizuje wartości tła z różnych włókien sondy i zapewnia jednolitość obrazu.</li>
		<li>Zanurzyć końcówkę w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania (5 s w każdej fiolce). Zanurz końcówkę w fiolce z fluoroforem 488 nm na 5 sekund, aby znormalizować wartości sygnału z różnych włókien w sondzie.</li>
		<li>Zanurzyć końcówkę w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania (5 s w każdej fiolce). Zanurzyć końcówkę w fiolce do płukania aż do uzyskania sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego w ppkt 3.5.2. Znika. Zanurz końcówkę w fiolce z fluoroforem 660 nm, aby znormalizować wartości sygnału z różnych włókien w sondzie. 
		UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki kalibracji, aby uzyskać prawidłową kalibrację i optymalną jakość obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po skalibrowaniu sondy sprawdź, czy wartości tła dla sond są tak niskie, jak to możliwe. W przypadku używanego systemu CLM należy utrzymywać wartości tła poniżej 100. Wykonaj wielokrotne czyszczenie sondy za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i kalibrację, jeśli wartości przekraczają 100/zdefiniowaną wartość użytkownika lub jeśli sonda wydaje się być brudna. Ma to na celu zapewnienie, że szum tła jest utrzymywany na poziomie zbliżonym do tej samej wartości. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zdefiniować maksymalną wartość tła (na przykład 100, jak podano w kroku 3.6), aby upewnić się, że warunki sondy są podobne. Pozwoli to na właściwe porównanie ilościowe między zdjęciami wykonanymi w różnych punktach czasowych. Wartość może się różnić w zależności od systemu i warunków sondy.</li>
	<li>Włączyć regulator temperatury zwierzęcia (ATC). Ustaw ATC na 37 °C. Przykryj poduszkę grzewczą serwetą chirurgiczną i zamocuj stożek nosowy na poduszce grzewczej. 
	UWAGA: ATC z dołączoną poduszką grzewczą jest wymagane, aby zapewnić zwierzęciu ciepło przez cały czas trwania obrazowania.</li>
	<li>Zaciśnij stojak mikroskopu preparacyjnego do blatu, aby go zabezpieczyć. Obróć i wyreguluj okular mikroskopu, aby ergonomicznie view oko myszy przez okular, gdy użytkownik siedzi (dokonaj regulacji po umieszczeniu zwierzęcia).</li>
	<li>Uspokoić mysz za pomocą 5% izofluranu w komorze indukcyjnej. Przenieś mysz do stożka nosowego, gdy zwierzę przestanie reagować i utrzymuj sedację na poziomie 2%-2,5% izofluranu podczas korzystania z poduszki grzewczej przez cały zabieg.</li>
	<li>Przyciąć wąsy myszy i wkroplić do oka kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proksymetakainy znieczulającego.</li>
	<li>Aby upewnić się, że oczy są czyste, upuść kilka kropli soli fizjologicznej, aby umyć powierzchnię oka.</li>
	<li>Ustaw mikroskop tak, aby oko myszy było w bezpośrednim ustawieniu ostrości przy powiększeniu 0.67x. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby nasmarować oczy solą fizjologiczną. Jeśli oczy nie są smarowane przez całą sesję obrazowania, mogą wyschnąć, powodując krystalizację soczewki. W rezultacie, podczas obrazowania CLM, soczewka może emitować czerwoną fluorescencję tła.</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo oczu myszy za pomocą CLM i akwizycji
<ol>
	<li>Włącz laser, umieść sondę na oku i rozpocznij rejestrację, aby obserwować fluorescencję w oku w obszarach wskazanych na mapie oka w <silna klasa="xfig">Rysunek 3. 
	UWAGA: Trzymaj sondę jak długopis, trzymając dystalny koniec sondy bezpośrednio na obszarze, który ma być obrazowany.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie, gdy wszystkie regiony zostaną oflagowane i oznaczone etykietami. Pliki akwizycji zostaną automatycznie zapisane w lokalizacji pliku wybranej w kroku 3.4. 
	UWAGA: Plik zostanie zapisany jako plik wideo, który można wyeksportować do poszczególnych obrazów. Oznacz flagę zgodnie z mapą oka, aby dokładnie poznać położenie sondy w dokładnej klatce, w której wykonano nagranie.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Korzystając z tego samego oprogramowania do akwizycji CLM, wyeksportuj pliki akwizycji obrazów w celu dalszej analizy. Kliknij Plik | Eksportuj i wybierz format, do którego chcesz wyeksportować dane. Pliki w formacie Mkt pozwolą na dostosowanie tabeli przeglądowej (LUT) i dalszy eksport do formatów plików graficznych za pomocą oprogramowania przeglądarki CLM.</li>
	<li>Aby uzyskać dokładne porównanie intensywności fluorescencji, użyj tej samej tabeli LUT dostosowanej dla każdego kanału podczas eksportowania wszystkich plików obrazów. 
	UWAGA: Wybierz minimalny i maksymalny próg LUT w stosunku do progów myszy kontrolnej (bez wstrzykiwanych liposomów), aby zminimalizować odczyty fluorescencji tła.</li>
	<li>Otwórz obraz w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazu/darmowym programie (np. ImageJ). Narysuj obszar zainteresowania (ROI). 
	UWAGA: ROI odnosi się tutaj do obszaru zainteresowania w programie przetwarzania. W większości przypadków ROI będzie obejmowało cały zeskanowany obraz. Jednak w przypadku obrazowania rąbka nie może po prostu uzyskać obrazu rąbka osobno. W związku z tym należy narysować zwrot z inwestycji, aby "określić ilościowo" fluorescencję w obszarze rąbka, zgodnie z rysunkiem w <silna klasa="xfig">Rysunek 4. Aby zachować stały zwrot z inwestycji, użyj tego samego zwrotu z inwestycji na wszystkich obrazach.</li>
	<li>Zmierz i zapisz wartości ROI dla zielonej fluorescencji. Wprowadź wartości w arkuszu kalkulacyjnym. Tabelaryczne wartości średniego i intensywności fluorescencji (au) ROI.</li>
</ol>
6. Ocena histologiczna
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji metodą zatwierdzoną przez lokalny IACUC. </li>
	<li>Wyłuszczyć oko i utrwalić oko w 1 ml 4% roztworu formaldehydu lub 10% roztworu formaliny na noc.</li>
	<li>Odetnij nadmiar tłuszczów i zanurz oko w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez co najmniej jeden dzień.</li>
	<li>Wyciąć odcinki o grubości 5 μm w kriostacie z temperaturą cięcia utrzymywaną na poziomie 20 °C. Przenieść sekcję na szkiełko mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną. 
	UWAGA: Histologia może służyć jako dodatkowa walidacja rozkładu DDS. Wymaga to jednak dodatkowej optymalizacji, specjalistycznej wiedzy technicznej i poświęcania zwierząt, które badanie ma na celu ograniczenie poprzez stosowanie CLM.</li>
</ol>

<ol><li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li>
<li>Kuo, J. C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231(2016).</li>
<li>Wu, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944(2020).</li>
<li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li>
<li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Research+on+Chemical+Intermediates%22%5BJournal%5D)">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li>
<li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li>
<li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li>
<li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Interventions%22%5BJournal%5D)">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li>
<li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143(2013).</li>
<li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+in+drug+delivery%3A+Progress+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li>
<li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization%2C+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+%28Avastin%29+for+intravitreal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li>
<li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li>
<li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li>
<li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li>
<li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li>
<li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li>
<li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879(2014).</li>
<li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li>
<li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li>
<li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li>
<li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009(2018).</li>
<li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li>
<li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak pokazują wyniki, CLM zapewnia prostą i wykonalną metodę obrazowania rozmieszczenia liposomów w oku w oku. Wcześniej zademonstrowaliśmy zastosowanie CLM do scharakteryzowania lokalizacji różnych preparatów liposomalnych w oku myszy w czasie1. W przypadku zastosowań nieinwazyjnych CLM umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym przedniej powierzchni oka w celu uzyskania wglądu w to, jak liposomy są rozmieszczone w oku tego samego zwierzęcia. To sprawia, że CLM nadaje się do wstępnego badania prz...

Oczyszczanie krwi, dystrybucja tkanek i docelowe zaawansowanie leków w żywych systemach są filarami zrozumienia rozmieszczenia leków in vivo. W przedklinicznych modelach zwierzęcych parametry te są zwykle oceniane poprzez częste pobieranie próbek krwi i tkanek w określonych punktach czasowych po podaniu leku. Jednak procedury te są na ogół inwazyjne, często obejmują pomiary niezwiązane z przeżywalnością i wymagają dużych kohort zwierząt do statystycznego zasilania. Może to wiązać się z dodatkowymi kosztami i czasem, a także z obawami etycznymi związanymi z nadmiernym wykorzystywaniem zwierząt. W rezultacie, nieinwazyjne obrazowanie szybko staje się integralnym krokiem w badaniach nad biodystrybucją. Konfokalna mikroendoskopia laserowa (CLM1,2) doskonale nadaje się do zastosowań okulistycznych do nieinwazyjnego obrazowania czasoprzestrzennego rozkładu środków terapeutycznych w oczach żywych zwierząt z wysoką czułością i wysoką rozdzielczością1,3,4.
CLM ma potencjał, aby ułatwić solidne badania przesiewowe systemów dostarczania leków do oczu (DDS), takich jak liposomy, przed kompleksową kwantyfikacją DDS i biodostępnością leków. Liposomy są atrakcyjne ze względu na swoją elastyczność w dostosowywaniu swoich właściwości fizykochemicznych i biofizycznych5,6,7,8,9,10,11 do hermetyzacji szerokiej gamy ładunków terapeutycznych i kontrolowania miejsca uwalniania leku i czasu działania. Liposomy były używane w zastosowaniach okulistycznych do dostarczania dużych cząsteczek, takich jak przeciwciało monoklonalne bewacyzumab12, oraz małych cząsteczek, takich jak cyclosporine13 i ganciclovir14. Liposomy obciążone lekami mają dłuższe biologiczne okresy półtrwania i przedłużone efekty terapeutyczne w porównaniu z nieliposomalnymi preparatami "wolnych leków". Jednak dystrybucja leku w tkance oka jest zwykle ekstrapolowana na podstawie stężeń leku w płynnych składnikach oka (tj. krwi, cieczy wodnistej i ciele szklistym15,16,17). Ponieważ początkowy los in vivo załadowanego ładunku leku jest określany przez właściwości samego nanonośnika, obrazowanie CLM liposomów fluorescencyjnych może służyć jako substytut leku w celu ujawnienia czasu ukierunkowania tkankowego i czasu przebywania w tkankach in situ. Co więcej, wizualne dowody dostarczania z CLM mogą sterować ponownym projektowaniem DDS, oceniać korzyści terapeutyczne leku, a być może nawet przewidywać niepożądane zdarzenia biologiczne (np. toksyczność tkankową spowodowaną niepożądaną lokalizacją DDS przez dłuższy czas).
Tutaj szczegółowo opisano procedurę krok po kroku, jak badać biodystrybucję liposomów w oku u żywych myszy za pomocą dwupasmowego systemu CLM. Ten specyficzny system CLM może wykrywać dwukolorową fluorescencję (za pomocą zielonych i czerwonych laserów wzbudzających o długości fali 488 nm i 660 nm) w czasie rzeczywistym, z częstotliwością 8 klatek/s. Poprzez fizyczne umieszczenie sondy detekcyjnej na oku, protokół demonstruje akwizycję obrazu i analizę liposomów zielonofluorescencyjnych po podaniu podspojówkowym myszom, którym wstępnie wstrzyknięto dożylnie (IV) 2% barwnik Evans Blue (EB). Barwnik EB pomaga uwidocznić unaczynione struktury w kanale czerwonej fluorescencji. Pokazujemy reprezentatywne wyniki badania oceniającego neutralne liposomy 100 nm złożone z fosfolipidu POPC (tj. 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholiny) i domieszkowane fosfolipidem Fl-DHPE znakowanym fluoresceiną (tj. N-(fluoresceiną-5-tiokarbamoilo)-1,2-dihexa-dekanoilosn-glicero-3-fosfoetanoloaminą) w stosunku 95% POPC: 5% Fl-DHPE (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). CLM jest w stanie wychwycić zielone liposomy znakowane fluoresceiną w rozdzielczości osiowej 15 μm i bocznej 3,30 μm poprzez wyznaczenie granic tkanki oka zabarwionej EB.

<table><tbody><tr><td>0,08 &mikro; m filtr poliwęglanowy</td><td>Whatman, USA</td><td>110604</td><td></td></tr><tr><td>0,22 & mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Fisherbrand, Irlandia</td><td>09-720-3</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Sterylny roztwór okulistyczny chlorowodorku proksymetakainy</td><td>Alcon, Singapur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &; L Szklana strzykawka</td><td>Hamilton, USA</td><td>65460-06</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti, USA</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Igła 32 G (Hamilton, 0,5" PT4)</td><td>Hamilton, USA</td><td>7803-04</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury zwierząt z płytą grzewczą (15 cm x 20 cm)</td><td>WPI, USA</td><td>ATC 2000 & 61800</td><td></td></tr><tr><td>Cellvizio Dual Band, sonda S1500 i Quantikit (zestaw kalibracyjny w kroku 3.5)</td><td>Mauna Kea Technologies, Francja</td><td></td><td>Średnica końcówki: 1,5 mm, pole widzenia: 600 &micro; m x 500 &mikro; m, rozdzielczość osiowa: 15 &mikro; m, rozdzielczość boczna: 3,3 i mikro; m</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>472476</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pęseta #5, Dumostar</td><td>WPI, USA</td><td>500233</td><td>11 cm, prosta, 0,1 mm x 0,06 mm Końcówki</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fusydowy krople do oczu</td><td>LEO Pharma, Dania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Mini ekstruder</td><td>Avanti, USA</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>N-(fluoresceina-5-tiokarbamoilo)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-fosfoetanoloamina (sól trietyloamonowa) (FL-DHPE)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>F362</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>System stereomikroskopowy z uchwytem stołowym</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>SZ51 i SZ2-STU3</td><td></td></tr></tbody></table>

przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Wstrzyknięcie podspojówkowe jest atrakcyjną drogą podawania leków ocznych ze względu na łatwy dostęp przeztwardówkowy, który omija bariery przednie oka, takie jak rogówka i spojówka. Chociaż efekty terapeutyczne i farmakokinetyka leków po wstrzyknięciu podspojówkowym zostały opisane w niektórych badaniach, bardzo niewiele z nich ocenia dystrybucję leków do oczu lub systemy dostarczania leków (DDS). To ostatnie ma kluczowe znaczenie dla optymalizacji konstrukcji wewnątrzgałkowej DDS i biodostępności leku w celu osiągnięcia pożądanej lokalizacji oka i czasu działania (np. ostry vs. przedłużony). Badanie to ustanawia zastosowanie światłowodowej konfokalnej mikroendoskopii laserowej (CLM) do jakościowego badania rozkładu oczu liposomów fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym u żywych myszy po wstrzyknięciu podspojówkowym. Przeznaczony do wizualnej kontroli tkanek in vivo na poziomie mikroskopowym, jest to również pierwszy pełny opis metody obrazowania CLM do badania czasoprzestrzennego rozmieszczenia iniekcji w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Protokół demonstruje użyteczność CLM w ocenie przestrzenno-czasowego rozkładu w oku zielonych fluorescencyjnych liposomów podanych poprzez wstrzyknięcie podsp Conjunctival. Aby wykorzystać możliwość dwukolorowej detekcji (długości fal wzbudzenia 488 nm i 660 nm) systemu CLM, neutralne liposomy POPC o rozmiarze 100 nm przeznaczone do wstrzyknięcia domieszkowano 5% Fl-DHPE (dane dotyczące składu i charakterystyki przedstawiono na Rysunku 1B), natomiast EB wstrzyknięto dożylnie w celu zidentyfi...

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Protokół ten ułatwia badania przesiewowe nowych preparatów, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób modyfikacje wpływają na czas przebywania w tkankach, co ma kluczowe znaczenie dla zaprojektowania optymalnego systemu dostarczania leków. Technika ta jest nieinwazyjna i umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym, co ogranicza nadmierne wykorzystanie zwierząt do pobierania próbek. Systemy dostarczania leków można przeprojektować pod kątem zastosowań obrazowych i terapeutycznych, po prostu łącząc lek terapeutyczny i ugrupowanie obrazowania w jednym nanonośniku.Ma to przydatne zastosowanie zarówno w leczeniu raka, jak i chorób zakaźnych. Procedurę zademonstruje Rasha Msallam, starszy pracownik naukowy z mojego laboratorium. Na początek, dwie godziny przed wstrzyknięciem podspojówkowym, wstrzyknij myszu dożylnie przez ogon 2,5 miligrama na kilogram błękitu Evansa lub EB. Po uśpieniu myszy 5% izofluranem, przenieś mysz do stożka nosowego i utrzymuj uspokojoną mysz na poduszce grzewczej.Następnie przyciąć wąsy w pobliżu oka, które mają być wstrzyknięte. Wkraplać kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proksymetakainy bezpośrednio na oko. Następnie załaduj szklaną strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 32 z fluorescencyjnymi liposomami i upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie są obecne w strzykawce.Za pomocą pęsety podnieś spojówkę i powoli wstrzyknij liposomy do przestrzeni podspojówkowej, a następnie powoli wycofaj igłę, zapobiegając cofaniu się. Upewnij się, że tworzy się pęcherzyk wypełniony fluorescencyjnymi liposomami. Podaj 1% kroplę kwasu fusitynowego na oko i monitoruj mysz do momentu odzyskania przytomności.Włączyć system CLM. Podłącz sondę do systemu CLM. W tym momencie wybierz pole widzenia i lokalizację plików akwizycji.Dostosuj intensywność lasera, aby upewnić się, że detekcja fluorescencji fluoresceiny DHPE mieści się w zakresie liniowym i utrzymuj stałą intensywność w celu porównania obrazów wykonanych w różnych punktach czasowych. Po rozgrzaniu systemu przez 15 minut należy skalibrować go zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z zestawu kalibracyjnego zawierającego roztwory oczyszczające, płuczące i fluoro-4 dla każdego lasera. Krótko mówiąc, rozpocznij kalibrację, zanurzając końcówkę na pięć sekund w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania.Pozostaw końcówkę w powietrzu do nagrywania w tle, aby znormalizować wartości tła z różnych włókien sondy, zapewniając jednolitość obrazu. Ponownie zanurz końcówkę na pięć sekund w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania. Następnie zanurz końcówkę w fiolce zawierającej fluoro-4 488-nanometr na pięć sekund, aby znormalizować wartości sygnału.Powtórzyć zanurzenie końcówki na pięć sekund w fiolce oczyszczającej, a następnie w fiolce do płukania. Trzymaj końcówkę w fiolce do płukania do momentu zniknięcia sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego w poprzednim kroku. Następnie przenieś końcówkę do fiolki zawierającej fluoro-4 660 nanometrów, aby znormalizować wartości sygnału z różnych włókien w sondzie.Po kalibracji upewnij się, że wartość tła sondy jest mniejsza niż 100. W przeciwnym razie należy wielokrotnie czyścić sondę aplikatorem z bawełnianą końcówką. Włącz regulator temperatury zwierzęcia z dołączoną poduszką grzewczą i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.Po przykryciu poduszki grzewczej obłożeniem chirurgicznym, przymocuj stożek nosowy do poduszki grzewczej. Po uspokojeniu myszy za pomocą 5% izofluranu w komorze indukcyjnej, przenieś mysz do stożka nosowego i utrzymuj uspokojoną mysz na poduszce grzewczej. Następnie wkroplić kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proksymetakainy znieczulającego do oka.Aby umyć powierzchnię oka i uniknąć krystalizacji soczewki, utrzymuj oczy nawilżone, upuszczając kilka kropli soli fizjologicznej. Następnie obróć i wyreguluj okular mikroskopu, aby ergonomicznie view oko myszy w bezpośrednim ogniskowaniu przy powiększeniu 0,67 razy. Włącz laser i umieść sondę jak długopis bezpośrednio na obszarze oka, który ma być obrazowany.Następnie rozpocznij rejestrowanie akwizycji, aby obserwować fluorescencję w oku w obszarze zainteresowania. Zatrzymaj nagrywanie, gdy wszystkie regiony zostaną oznaczone i oznaczone zgodnie z mapą oka, aby poznać dokładną lokalizację sondy w dokładnej klatce. Pliki akwizycji zostaną automatycznie zapisane jako pliki wideo w wcześniej wybranej lokalizacji.Obrazowanie fluorescencyjne wykazało wyraźne zróżnicowanie między obszarami twardówki i rogówki. Wysokie unaczynienie twardówki i spojówki spowodowało, że obszar twardówki zabarwił się na czerwono z EB. Rogówka, która nie ma unaczynienia, wydawała się. Kontrastową fluorescencję rąbka i twardówki obserwowano w badaniu siedmiodniowym.Myszy kontrolne wstrzyknięte barwnikiem fluoresceinowym potwierdziły specyficzność fluorescencji pochodzącej z liposomów. Intensywność fluorescencji była wysoka w pierwszym i trzecim dniu. Zielona fluorescencja z czasem zmniejszała redukcję liposomów w obszarach rąbka i twardówki.Różnice w sygnałach fluorescencyjnych od pierwszego dnia po wstrzyknięciu do trzeciego dnia w regionach rąbka skroniowego i rąbka górnego nie były istotne, co wskazuje na preferencję neutralnych liposomów do obszaru rąbka, szczególnie na obrzeżach rogówki. W przypadku obszarów skroniowych i górnych w pierwszym dniu po wstrzyknięciu fluorescencja w twardówce była sześciokrotnie wyższa niż w rąbku. W trzecim i siódmym dniu liposomy były znacznie zmniejszone w twardówce w okolicy skroniowej i górnej, co przypisuje się mechanizmom klirensu ocznego.Najmniejszą ilość fluorescencji wykryto w okolicy nosowej i dolnej, ze względu na odległość od miejsca wstrzyknięcia. Ważne jest, aby oznaczyć klatki plamki zgodnie z mapą oka przed zatrzymaniem nagrywania. Utrzymuj stałą intensywność lasera i zdefiniuj maksymalną wartość tła w celu prawidłowego porównania między różnymi eksperymentami.Po zidentyfikowaniu postaci ołowianych można przeprowadzić kompleksowe badania farmakokinetyczne i biodystrybucji na zwierzętach w celu zbadania biodostępności leku i walidacji skuteczności terapeutycznej jego preparatów.

spatio-temporal-vivo-imaging-ocular-drug-delivery-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający uzyskać trójwymiarową (3D) fluorescencję (3D) i obraz siatkówki OCT o dużym polu widzenia (FOV) za pomocą nowatorskiej platformy multimodalnej do obrazowania. Przedstawimy konfigurację systemu, metodę wyrównania i protokoły operacyjne. Przeprowadzone zostaną badania obrazowe in vivo, a ich wyniki zostaną przedstawione.

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.

In Vivo Mikroskopia konfokalna w diagnostyce i leczeniu suchego oka: Skupienie się na protokołach obrazowania i interpretacji

Opisano pełną konstrukcję niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego z przeskanowaniem w czasie rzeczywistym. System ten, który może być łatwo wykorzystany do mikroskopii i mikroendoskopii w tempie wideo, umożliwia zastosowanie szeregu geometrii obrazowania i aplikacji niedostępnych w standardowych komercyjnych systemach konfokalnych, przy ułamku ich kosztów.

Skaningowa mikroskopia konfokalna w czasie rzeczywistym i mikroendoskopia

Poznaj metodę światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii do obrazowania dystrybucji liposomów w oku myszy. Technika ta umożliwia nieinwazyjne badanie systemów dostarczania leków w czasie rzeczywistym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (Wideo) | JoVE Journal

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Przeglądaj więcej filmów