Migracja jądrowa w oocycie Drosophila
13 maja 2021
U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.
Technika ta umożliwia obserwację długich procesów biologicznych w wypreparowanych komorach jajowych Drosophila, takich jak migracja jądra jajowego, za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo. Protokół ten opisuje, w jaki sposób utrzymać wypreparowane komory jajowe przy życiu przez 12 godzin w celu przeprowadzenia mikroskopii obrazowania na żywo. Na początek odpipetuj 200 mikrolitrów pożywki Schneidera i uzupełnij 30 mikrolitrami 10 miligramów insuliny na mililitr, a następnie dodaj cztery mikrolitry inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej.
Za pomocą końcówki pipety nałóż niewielką ilość smaru silikonowego wokół otworu na spodzie przebitego szkiełka. Umieść szkiełko nakrywkowe i użyj szerokiego końca końcówki pipety, aby wywrzeć nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć smar silikonowy w celu utworzenia silikonowego pierścienia wewnątrz szkiełka. Przenieś znieczulone samice much do studzienki preparacyjnej zawierającej 150 mikrolitrów pożywki do obrazowania.
Do preparowania samicy użyj kleszczy, aby chwycić klatkę piersiową i uszczypnąć naskórek grzbietu brzucha drugą parą kleszczy. Ostrożnie usuń macicę, jajowód i osłonkę mięśniową. Odizoluj i odłącz parę jajników widocznych przy otworze naskórka.
Umieść kroplę od 10 do 15 mikrolitrów pożywki do obrazowania na jajnikach i przenieś jeden jajnik do komory obrazowania. Aby oddzielić jajniki, użyj igły, aby przytrzymać tylny koniec jajnika. Użyj innej igły, aby ostrożnie wyciągnąć germarium, aby rozdzielić jajniki.
Przytrzymaj osłonkę jedną igłą i przeciągnij jajnik przez większe komory za pomocą innej igły, aby usunąć pozostałą osłonkę mięśniową z komór jajowych. Pozostawić odsłonięty jajnik do opadnięcia i zetknąć się ze szkiełkiem nakrywkowym. Usuń późne stadia i resztę jajników z mikrokomory za pomocą kleszczy.
Użyj igieł, aby ostrożnie oddalić jajniki, aby ułatwić nabycie. Wytnij mały kwadrat przepuszczalnej membrany o wymiarach 10 na 10 milimetrów. Ostrożnie nałóż membranę na wierzch podłoża obrazowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie hermetycznie zamknij komorę cienką warstwą oleju halowęglowego wokół studni na konturze membrany. Umieść zestaw do obrazowania na uchwycie szkiełek mikroskopu odwróconego i użyj obiektywu 40X. Migrację jądra oocytu komory jajowej typu dzikiego uchwycono za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo.
Jądro dociera do przedniej błony plazmatycznej lub bocznej błony plazmatycznej, zanim przesuwa się wzdłuż trajektorii, aby osiągnąć ostateczną pozycję na przecięciu dwóch błon plazmatycznych. Deformacje błony, zdezorganizowane komórki pęcherzykowe, skarłowaciałe komórki i skurczone jądra to pierwsze oznaki umierania komór jajowych. Zdegenerowany oocyt przed ośmioma godzinami obrazowania zwykle nie jest wykrywany.
Jednak rzadkie przypadki wczesnego zwyrodnienia są spowodowane problemami podczas sekcji lub etapów montażu. Uszkodzenie komór na jaja zagraża ich przetrwaniu. Tak delikatna ręka, precyzyjna sekcja i przygotowanie mikrokomory są najważniejsze.
Ta procedura pozwoliła nam zwizualizować, że jądro oocytu może przyjąć trzy różne trajektorie podczas swojej migracji, a różne organelle regulują te trajektorie w oocycie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę obserwacji migracji jąder oocitowych u Drosophila za pomocą mikroskopii obrazu żywego. Technika ta umożliwia utrzymanie żywotności rozciętych komór jajowych przez 12 godzin, co pozwala na rejestrację wielopoziomowych filmów 3D time-lapse.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Tło
- Drosophila służy jako organizm modelowy do badania oogeneszy.
- Migracja zależna od mikrotubul jest kluczowa dla rozwoju oocitów.
- Techniki obrazowania żywych komórek poprawiają rozumienie dynamicznych procesów komórkowych.
- Utrzymanie żywotności komór jajowych jest niezbędne do długotrwałego obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie protokołu obrazowania żywych oocitów w celu obserwacji migracji ich jąder.
- Utrzymanie komór jajowych przy życiu przez dłuższy czas podczas obserwacji.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej z dyskiem wirującym do szczegółowego obrazowania.
Stosowane metody
- Przygotowanie pożywki Schneidera uzupełnionej insuliną i surowicą cielęcą.
- Zastosowanie smaru silikonowego w celu stworzenia stabilnego środowiska do obrazowania.
- Rozcięcie samicy muchówki w celu uzyskania komór jajowych do obrazowania.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej z dyskiem wirującym do rejestracji filmów time-lapse.
Główne wyniki
- Udane utrzymanie komór jajowych przez 12 godzin podczas obrazowania.
- Wyraźna wizualizacja procesów migracji jąder oocitowych.
- Wykazanie skuteczności technik obrazowania żywych komórek.
- Wkład w zrozumienie biologii rozwoju u Drosophila.
Wnioski
- Protokół umożliwia szczegółową obserwację dynamiki oocitów.
- Obrazowanie żywych komórek dostarcza informacji na temat mechanizmów migracji komórkowej.
- Ta metoda może być zastosowana do innych procesów biologicznych u Drosophila.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding nuclear migration dynamics in model systems like Drosophila oocytes provides foundational insights into cytoskeletal regulation and intracellular transport mechanisms relevant to target validation in cell-based assays. Live imaging of 3D organelle movement enables mechanistic de-risking of hypotheses involving motor proteins, microtubule stability, or polarity establishment—key considerations in early discovery where phenotypic screening relies on subcellular readouts. This approach supports predictive confidence by linking molecular perturbations to observable, quantifiable cellular behaviors in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cytoskeletal regulators and nuclear positioning proteins through direct visualization of migration trajectories.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating genetic or pharmacological perturbations with alterations in 3D nuclear movement patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by providing quantitative, time-resolved readouts of nuclear position and migration kinetics in a controlled, long-term imaging environment.
- Operational Value: Enhances screening readiness through reproducible chamber preparation and stable viability of Drosophila egg chambers for up to 12 hours, enabling multi-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to study polarity defects linked to developmental disorders, supporting translational biomarker exploration via correlation of nuclear mislocalization with phenotypic outcomes.
- Operational Value: Promotes translational continuity by allowing discovery-phase findings to be validated in a genetically tractable, live-imaging-compatible model before mammalian system translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through assay optimization to preclinical validation, particularly when nuclear dynamics or cytoskeletal function are central to the mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by visualizing how specific gene knockdowns or compound treatments alter nuclear migration in real time.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chamber setup and quantitative 3D tracking of nuclear position as a functional readout for compound effects.
- Analytics: Generates measurable outputs such as migration velocity, trajectory choice, and final nuclear positioning, which can be statistically compared across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing a causal link between nuclear positioning defects and developmental phenotypes, informing risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying intracellular transport, organelle positioning, or polarity establishment across multiple projects in developmental and cell biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing ambiguity in how molecular interventions affect subcellular organization and dynamics.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility via a validated chamber preparation protocol that maintains tissue viability for extended live imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, observable phenotypic anchors for targets involved in cytoskeletal regulation or intracellular transport.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated impact on nuclear migration, a process linked to cell fate and developmental integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection, live imaging microscopy, and fluorescent sample preparation.
- Depends on access to spinning-disk confocal or equivalent long-term 3D imaging systems with environmental control.
- Necessitates standardization of chamber sealing and medium composition across teams to ensure consistent egg chamber survival.
- Involves adaptation considerations when applying the chamber system to other tissue types or developmental stages beyond mid-oogenesis.
- Limited by the physiological relevance of Drosophila to human disease, necessitating orthogonal validation in mammalian systems for translational targets.
