Name: Migracja jądrowa w oocycie Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Poznaj metodę obserwacji migracji jądrowej w oocytach Drosophila przy użyciu mikroskopii obrazowania na żywo. Protokół umożliwia utrzymanie komór jajowych przy życiu przez 12 godzin, co pozwala na rejestrację szczegółowych filmów czasowych 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Jean-Antoine Lepesant i Nicolasowi Tissotowi, którzy pierwotnie opracowali protokół i podzielili się z nami niektórymi elementami graficznymi Rysunku 3. Dziękujemy Fanny Roland-Gosselin, która wykonała zdjęcia rysunku 4. Dziękujemy również innym członkom laboratorium za pomocne dyskusje, które przyczyniły się do ulepszenia tej techniki oraz Nathanielowi Hennemanowi za jego komentarze, które pomogły ulepszyć ten manuskrypt. Wyrażamy uznanie dla głównego ośrodka Instytutu ImagoSeine Jacques Monod, członka France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh jest wspierana przez stypendium doktoranckie francuskiego Ministerstwa Badań Naukowych (MESRI). Antoine Guichet i Fred Bernard byli wspierani przez ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) oraz przez grant Emergence z IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Przygotowanie medium obrazującego
<ol>
	<li>Przygotować świeże podłoże w dniu planowanego użycia. Odpipetować 200 µL podłoża Schneidera (zawierającego L-Glutaminę i 0,40 g/L NaHCO3, uzupełnionego o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny oraz 100 mg/mL streptomycyny).</li>
	<li>Uzupełnić o 30 µL insuliny o stężeniu 10 mg/mL.</li>
	<li>Dodać 4 µL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory obserwacyjnej
<ol>
	<li>Za pomocą końcówki pipety nanieś niewielką ilość smaru silikonowego wokół otworu na spodniej stronie przebitego szkiełka (Rycina 4D).</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywką o wymiarach 24 x 50 mm i grubości 0,13-0,16 mm.</li>
	<li>Szerokim końcem końcówki pipety dociśnij szkiełko nakrywkę, aby rozpłaszczyć silikon, uszczelnić szkiełko i utworzyć pierścień silikonowy wewnątrz szkiełka (Rycina 4F,G).</li>
</ol>
3. Disekcja jajnika
<ol>
	<li>Znieczulić samicę muchy o pożądanym fenotypie na podkładce z CO2.</li>
	<li>Przenieść samicę do dołka sekcyjnego zawierającego 150 µL medium do obrazowania (Rysunek 4H).</li>
	<li>Otworzyć ciało samicy, chwytając klatkę piersiową pęsetą i ściskając kutykulę grzbietową odwłoka drugą pęsetą.</li>
	<li>Wyizolować i oddzielić parę jajników, które powinny być dobrze widoczne po otwarciu kutykuli.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć macicę, jajowody oraz pochewkę mięśniową (Rysunek 4I).</li>
	<li>Nanieść kroplę 10-15 µL medium do obrazowania i przenieść jeden jajnik do komory obrazowania (Rysunek 4J,K).</li>
</ol>
4. Izolacja komór jajowych
<ol>
	<li>Aby oddzielić owariole, należy przytrzymać tylny koniec jajnika (w stronę starszych stadiów) za pomocą igły. Rozdzielić owariole, ostrożnie pociągając za germarium drugą igłą.</li>
	<li>Usunąć pozostałą osłonkę mięśniową z komór jajowych; jedną igłą przytrzymać osłonkę, a drugą pociągnąć owariol przez większe komory (stadium 9 lub starsze).</li>
	<li>Pozwolić, aby odsłonięty owariol opadł i zetknął się z szkiełkiem cover-slip.</li>
	<li>Usunąć późne stadia oraz resztę jajników z mikrokomory za pomocą pęsety. Ostrożnie odsunąć od siebie poszczególne owariole za pomocą igieł, aby ułatwić ich obrazowanie (Rysunek 4L).</li>
</ol>
5. Zamykanie komory obserwacyjnej
<ol>
	<li>Wytnij mały kwadrat (10 x 10 mm) membrany przepuszczalnej (Rysunek 4M,N).</li>
	<li>Ostrożnie nałóż membranę na medium obrazujące, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza (Rysunek 4O).</li>
	<li>Hermatycznie uszczelnij komorę, nakładając cienką warstwę oleju halocarbonowego wokół otworu wzdłuż konturu membrany (Rysunek 4P,Q).</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść zestaw do obrazowania na uchwycie do preparatów mikroskopu odwróconego, korzystając z obiektywu 40x (HCX PL Apo, 1.25NA, imersja olejowa).</li>
	<li>Zlokalizuj i zapisz pozycje różnych oocytów w stadium 6, w których jądro jest gotowe do migracji.</li>
	<li>Skonfiguruj lasery 488 i 561 nm. Przy zmierzonej mocy wyjściowej lasera 150 mW, zastosuj odpowiednio 30% mocy lasera oraz czas ekspozycji 300 ms i 500 ms.</li>
	<li>Skonfiguruj eksperyment. Wykonaj obrazowanie time-lapse przez 12 h w odstępach 15 min – 41 sekcji w odstępach 1 µm wycentrowanych na jądrze. 
	UWAGA: Zgodnie z opisanym powyżej czasem ekspozycji, ustawienie to pozwala na akwizycję jednej pozycji w około 45 s. Ze względu na opóźnienie wynikające ze zmiany pozycji, w tych warunkach zaleca się ustawienie maksymalnie 12 pozycji.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Przetwórz filmy w oprogramowaniu Fiji, korzystając z wtyczki Orthogonal view, a następnie ręcznie śledź jądra komórkowe.</li>
</ol>
<img alt="Konfiguracja mikroskopu i przygotowanie preparatu do sekcji i obrazowania owadów, w tym zastosowane urządzenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Krok po kroku zdjęcia montażu mikrokomory. (A,B,C) Przygotowanie niezbędnych narzędzi: płytki do sekcji, pęsety, igieł, medium do obrazowania, smaru silikonowego, membrany przepuszczalnej i szkiełka aluminiowego. (D) Nakładanie smaru silikonowego na tył szkiełka aluminiowego za pomocą końcówki pipety. (E) Przykrycie szklane zostaje przyklejone do smaru silikonowego, tworząc dno komory. (F,G) Wywieranie nacisku na przykrycie szklane za pomocą szerszego końca końcówki pipety w celu stworzenia uszczelnienia wewnątrz komory. (H,I) Sekcja jajników muchy w medium do obrazowania. (J) Naniesienie kropli medium do obrazowania do mikrokomory. (K,L) Rozdzielenie owarioli w mikrokomorze za pomocą igieł. (M,N,O) Membrana przepuszczalna wycięta w kwadrat o wymiarach 10 x 10 mm i umieszczona nad kroplą medium w mikrokomorze. (P,Q) Uszczelnienie mikrokomory olejem halokarbonowym. Próbki są gotowe do obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li>
<li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891(2009).</li>
<li>Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+and+round+gets+you+somewhere%3A+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li>
<li>Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+%27+n+Villa%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li>
<li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li>
<li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).</li>
<li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Oogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Inne protokoły opisują, jak przygotować i hodować komory jajowe Drosophila ex vivo do testu obrazowania na żywo12,13. Nowatorstwem tego protokołu jest zastosowanie komory obrazowania zbudowanej z wydrążonego szkiełka aluminiowego, szkiełka nakrywkowego i membrany przepuszczalnejO2/CO2. Główną zaletą tej konfiguracji jest ograniczenie ruchu w Z bez wywierania nacisku na próbkę. W ten sposób oocyt może nadal swobodnie się poruszać, dl...

Od kilku lat oocyt Drosophila stanowi modelowy system do badania migracji jądra komórkowego. Oocyt Drosophila rozwija się w wielokomórkowej strukturze zwanej komorą jajową. Komory jajowe obejmują 16 komórek linii zarodkowej (15 komórek pielęgnujących i oocyt) otoczonych nabłonkową warstwą somatycznych komórek pęcherzykowych. Rozwój komory jajowej został podzielony na 14 stadiów (Rycina 1A), podczas których oocyt rośnie i gromadzi rezerwy niezbędne do wczesnego rozwoju zarodka. W trakcie rozwoju, w wyniku reorganizacji mikrotubul i asymetrycznego transportu determinantów matczynych, oocyt polaryzuje się wzdłuż osi przednio-grzbietowej i grzbietowo-brzusznej. Osie te determinują późniejsze osie polarności zarodka i osobnika dorosłego powstającego w wyniku zapłodnienia tego oocytu1. Podczas oogenezy jądro przyjmuje asymetryczną pozycję w oocycie. W stadium 6 jądro znajduje się w centrum komórki. Pod wpływem jeszcze nie zidentyfikowanego sygnału emitowanego przez tylne komórki pęcherzykowe i odbieranego przez oocyt, jądro migruje w kierunku przecięcia przedniej i bocznej błony plazmatycznej w stadium 7 (Rycina 1B)2,3. Ta asymetryczna pozycja jest niezbędna do indukowania determinacji osi grzbietowo-brzusznej.
<img alt="Oogeneza Drosophila, mikroskopia fluorescencyjna, stadia komór jajowych, oznakowane jądra komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Komory jajowe Drosophila melanogaster. (A) Utrwalona owariola z much transgenicznych wykazujących ekspresję Fs(2)Ket-GFP, który znakuje otoczki jądrowe, oraz ubi-PH-RFP, który znakuje błony plazmatyczne. Owariola składa się z rozwijających się komór jajowych na różnych stadiach. Stopień dojrzałości wzrasta wzdłuż osi przednio-tylnej, przy czym germarium znajduje się na przednim końcu (lewo), gdzie bytuje komórka macierzysta linii zarodkowej, a starsze stadia na końcu tylnym (prawo). (B) Projekcja Z żywej komory jajowej wykonana za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej w stadium 6 oogenezy (lewo), w którym jądro znajduje się w centrum oocytu. Jądro przemieści się, przyjmując asymetryczną pozycję w stadium 7 (prawo), w kontakcie z przednią błoną plazmatyczną (między oocytem a komórką pielęgnującą) oraz boczną błoną plazmatyczną (między oocytem a komórkami pęcherzykowymi). Pozycja ta zaindukuje determinację strony grzbietowej, a tym samym osi grzbietowo-brzusznej komory jajowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przez wiele dziesięcioleci migrację jądra badano w utrwalonych tkankach za pomocą immunobarwienia. Podejście to pozwoliło w szczególności wykazać, że proces ten zależy od gęstej sieci mikrotubul4,5. Niedawno opracowaliśmy protokół zapewniający warunki kompatybilne z obrazowaniem oocytu na żywo przez kilka godzin, co umożliwiło dynamiczne badanie tego procesu6.
Zatem, po raz pierwszy udało nam się opisać, że jądro wykazuje preferencyjne i charakterystyczne trajektorie podczas migracji – jedną wzdłuż przedniej błony plazmatycznej (APM) oraz drugą wzdłuż bocznej błony plazmatycznej (LPM) oocytu (Rysunek 2). Te najnowsze wyniki podkreślają znaczenie protokołów obrazowania na żywo podczas badania procesów dynamicznych, takich jak migracja jądra.
<img alt="Schemat rozwoju oocytu z komórkami pielęgnującymi i pęcherzykowymi, ilustrujący oś przednio-tylną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie różnych dróg migracji jądra komórkowego. W stadium 6 oogenezy oocyt jest dużą komórką z centralnie położonym jądrem. Na tym etapie ustalana jest oś polarności przednio-tylnej, gdzie tylna/boczna błona plazmatyczna oocytu styka się z komórkami pęcherzykowymi, a przednia błona plazmatyczna (zaznaczona na żółto) styka się z komórkami pielęgnującymi2. Wcześniej wykazaliśmy, że jądro może migrować wzdłuż przedniej błony plazmatycznej (APM), wzdłuż bocznej błony plazmatycznej (LPM) lub przez cytoplazmę (STAD, bezpośrednio do kory przednio-grzbietowej)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Migracja jądra oocytu jest zjawiskiem trwającym około 3 h6, a zdarzenie wyzwalające rozpoczęcie właściwej migracji pozostaje do tej pory nieznane. Początek migracji może być również opóźniony przez mutanty białek wykorzystywane do badania tego mechanizmu. Te nieznane zmienne skłoniły nas do pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu (10-12 h). Dlatego ważne jest zapewnienie przeżycia oocytów. W miarę rozwoju komora jajowa wydłuża się wzdłuż osi przednio-tylnej, zmieniając kształt z kulistego na eliptyczny. Wydłużenie to jest napędzane przez rotację komórek pęcherzykowych, która zachodzi od stadium 1 do stadium 8 prostopadle do osi przednio-tylnej7. Dodatkowo komory jajowe są otoczone rurkowatą pochewką mięśniową o właściwościach pulsujących. Jej funkcją fizjologiczną jest ciągłe przesuwanie rozwijających się pęcherzyków w stronę jajowodu8. Aby ograniczyć ruchy wywołujące oscylacje komór jajowych po ich wypreparowaniu, zaprojektowaliśmy mikrokomorę obserwacyjną o wysokości 150 µm (Rysunek 3A). Wysokość ta jest nieco większa niż rozmiar pęcherzyka w stadiach 10 i 11. Znacznie ogranicza to ruchy pionowe próbki, zachowując jednocześnie rotację komory jajowej, co skutkuje minimalnymi wadami w rozwoju pęcherzyka. Następnie przeprowadzamy obrazowanie na żywo przez 12 h wypreparowanych komór jajowych za pomocą wielopozycyjnej akwizycji time-lapse z użyciem konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem. Poniżej opisujemy nasz protokół badania migracji jądra oocytu między stadiami 6 a 7.
<img alt="Schemat komory szkiełka, opisane wymiary; ustawienie do obserwacji mikroskopowych z szkiełkiem nakrywką i olejem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schematyczna reprezentacja komory obserwacyjnej. (A) (Widok z góry) Dokładne wymiary aluminiowego szkiełka wraz z wysokością (A') i obwodem (A'') otworu wywierconego na środku szkiełka. (B) (Widok z dołu) Szkiełko nakrywka blokujące otwór jest uszczelnione ze szkiełkiem za pomocą smaru silikonowego. (C) (Widok z góry) Wypreparowane owariolki rozwijają się w medium obrazującym, które jest przykryte membraną przepuszczalną dla gazów. Do stabilizacji membrany użyto oleju halokarbonowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby śledzić migrację jądra i precyzyjnie ocenić trajektorie w oocycie, niezbędne są markery zarówno otoczki jądrowej, jak i błony plazmatycznej. W tym celu wybrano dwa transgeny o wysokim stosunku sygnału do szumu, których intensywność nie spada w trakcie obrazowania na żywo. Do znakowania błony plazmatycznej zaleca się użycie P[ubi-PH-RFP], który koduje domenę Pleckstrin Homology (PH) ludzkiej fosfolipazy C ∂1 (PLC∂1) połączoną z RFP. Domena PH ta wiąże się z fosfoinozytydem PI(4,5)P2 rozmieszczonym wzdłuż błony plazmatycznej oocytu9. W przypadku otoczki jądrowej szczep protein-trap P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP, w którym GFP jest wstawione w gen kodujący ß-importynę Drosophila, wykazuje jednorodny i intensywny sygnał10. Młode muchy (w wieku 1-2 dni) umieszcza się w świeżych fiolkach zawierających suchy drożdże na 24-48 h przed wycięciem jajników.
Do tego badania z obrazowaniem na żywo wykorzystano kawałek aluminium o grubości 1 mm, który nie reaguje z próbką, docięty do wymiarów szkiełka przedmiotowego. W centrum szkiełka znajduje się otwór o średnicy 16 mm z pogłębieniem do 0,85 mm. W tym pogłębieniu wykonano dodatkowy otwór o średnicy 6 mm i głębokości 150 µm (Rycina 3A). Osłonkę szkiełka przyklejono smarem silikonowym (obojętnym dla próbki) do dna aluminiowej komory (Rycina 3B). Po umieszczeniu próbek w wypełnionym pożywką otworze, na pożywkę nałożono membranę przepuszczalną dla wymiany O2/CO2 i otoczono ją olejem halocarbonowym (Rycina 3C).
Do sekcji zaleca się użycie pęset ze stali nierdzewnej o wymiarach końcówki 0,05 x 0,02 mm oraz igieł o średnicy 0,20 mm do rozdzielania ovaroli (Rycina 4B,C). Migrujące jądra obrazowane są przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z dyskiem wirującym CSU-X1 wyposażonego w kamerę. Obrazy z wielu pozycji pozyskiwano metodą time-lapse co 15 min w temperaturze 24 °C. 15-minutowy odstęp pozwala na przeprowadzenie akwizycji z wielu pozycji przy ograniczonym fotobleachingu białek fluorescencyjnych oraz fototoksyczności dla próbek. Ponadto krótszy odstęp nie dostarczyłby znacznie bardziej informatywnych danych do śledzenia trajektorii jąder. Filmy są przetwarzane i analizowane za pomocą oprogramowania Fiji11.

<table><tbody><tr><td>Podkładka znieczulająca CO2</td><td>Dutscher</td><td>789060</td><td>Znieczulenie much</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (24x50 mm)</td><td>Szkło z dzianiny</td><td>VD12450Y100A</td><td>Przygotowanie komory obserwacyjnej</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Carl Roth</td><td>K342.1</td><td>Rozwarstwienie</td></tr><tr><td>Igły ze stali nierdzewnej</td><td>Entosphinx</td><td>20</td><td>Rozwarstwienie</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica</td> <td>cielęca płoduSIGMA-ALDRICH</td><td>F7524</td><td>Pożywka do obrazowania</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny trzustka bydlęca</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10516 - 5ml</td><td>Pożywka do obrazowania</td></tr><tr><td>Roztwór penicyny/streptomycyny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P0781</td><td>Podłoże obrazowe</td></tr><tr><td>Membrana przepuszczalna</td><td>Leica</td><td>11521746</td><td>Przygotowanie komory obserwacyjnej</td></tr><tr><td>Schneider Medium</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-91500</td><td>Podłoże obrazowe</td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>335148</td><td>Przygotowanie komory obserwacyjnej</td></tr><tr><td>Wirujący dysk konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>CSU-X1</td><td>Obserwacja migracji jądrowej</td></tr><tr><td>Olej Voltalef 10S</td><td>VWR</td><td>24627 - 188</td><td>Przygotowanie komory obserwacyjnej</td></tr></tbody></table>

migracja jądrowa w oocycie drosophila

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie potrzebne do zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych, które regulują ruchy organelli, przegrupowania cytoszkieletu lub wzorce polaryzacji w komórkach. Podczas badania położenia jądra oocytów techniki obrazowania na żywo są niezbędne do uchwycenia dynamicznych zdarzeń tego procesu. Komora jajowa Drosophila jest strukturą wielokomórkową i doskonałym systemem modelowym do badania tego zjawiska ze względu na jej duże rozmiary i dostępność licznych narzędzi genetycznych. Podczas środkowej oogenezy Drosophila jądro migruje z centralnej pozycji w oocycie, aby przyjąć asymetryczną pozycję, w której pośredniczą siły generowane przez mikrotubule. Ta migracja i umiejscowienie jądra są niezbędne do określenia osi biegunowości zarodka i późniejszej dorosłej muchy. Jedną z cech charakterystycznych tej migracji jest to, że zachodzi ona w trzech wymiarach (3D), co stwarza konieczność obrazowania na żywo. W związku z tym, aby zbadać mechanizmy regulujące migrację jądrową, opracowaliśmy protokół hodowli wypreparowanych komór jajowych i wykonywania obrazowania na żywo przez 12 godzin za pomocą akwizycji poklatkowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Ogólnie rzecz biorąc, nasze warunki pozwalają nam zachować komory jajowe Drosophila przy życiu przez długi okres czasu, umożliwiając w ten sposób wizualizację zakończenia migracji jądrowej w dużej liczbie próbek w 3D.

Przed migracją jądro jest dynamiczne i oscyluje wokół pozycji centralnej w okresie zdefiniowanym jako przedmigracyjny. Te niewielkie ruchy odzwierciedlają równowagę sił pchających i ciągnących, które utrzymują stan równowagi w centrum oocytu. Poprzez kwantyfikację trajektorii jąder wykazaliśmy, że trajektorie APM i LPM miały podobne proporcje. Naturę trajektorii definiujemy poprzez pierwszy kontakt jądra z błoną plazmatyczną6. Zatem jądro dociera albo do APM, albo do LPM, a następnie przesuwa się ...

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Technika ta umożliwia obserwację długich procesów biologicznych w wypreparowanych komorach jajowych Drosophila, takich jak migracja jądra jajowego, za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo. Protokół ten opisuje, w jaki sposób utrzymać wypreparowane komory jajowe przy życiu przez 12 godzin w celu przeprowadzenia mikroskopii obrazowania na żywo. Na początek odpipetuj 200 mikrolitrów pożywki Schneidera i uzupełnij 30 mikrolitrami 10 miligramów insuliny na mililitr, a następnie dodaj cztery mikrolitry inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej.Za pomocą końcówki pipety nałóż niewielką ilość smaru silikonowego wokół otworu na spodzie przebitego szkiełka. Umieść szkiełko nakrywkowe i użyj szerokiego końca końcówki pipety, aby wywrzeć nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć smar silikonowy w celu utworzenia silikonowego pierścienia wewnątrz szkiełka. Przenieś znieczulone samice much do studzienki preparacyjnej zawierającej 150 mikrolitrów pożywki do obrazowania.Do preparowania samicy użyj kleszczy, aby chwycić klatkę piersiową i uszczypnąć naskórek grzbietu brzucha drugą parą kleszczy. Ostrożnie usuń macicę, jajowód i osłonkę mięśniową. Odizoluj i odłącz parę jajników widocznych przy otworze naskórka.Umieść kroplę od 10 do 15 mikrolitrów pożywki do obrazowania na jajnikach i przenieś jeden jajnik do komory obrazowania. Aby oddzielić jajniki, użyj igły, aby przytrzymać tylny koniec jajnika. Użyj innej igły, aby ostrożnie wyciągnąć germarium, aby rozdzielić jajniki.Przytrzymaj osłonkę jedną igłą i przeciągnij jajnik przez większe komory za pomocą innej igły, aby usunąć pozostałą osłonkę mięśniową z komór jajowych. Pozostawić odsłonięty jajnik do opadnięcia i zetknąć się ze szkiełkiem nakrywkowym. Usuń późne stadia i resztę jajników z mikrokomory za pomocą kleszczy.Użyj igieł, aby ostrożnie oddalić jajniki, aby ułatwić nabycie. Wytnij mały kwadrat przepuszczalnej membrany o wymiarach 10 na 10 milimetrów. Ostrożnie nałóż membranę na wierzch podłoża obrazowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie hermetycznie zamknij komorę cienką warstwą oleju halowęglowego wokół studni na konturze membrany. Umieść zestaw do obrazowania na uchwycie szkiełek mikroskopu odwróconego i użyj obiektywu 40X. Migrację jądra oocytu komory jajowej typu dzikiego uchwycono za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo.Jądro dociera do przedniej błony plazmatycznej lub bocznej błony plazmatycznej, zanim przesuwa się wzdłuż trajektorii, aby osiągnąć ostateczną pozycję na przecięciu dwóch błon plazmatycznych. Deformacje błony, zdezorganizowane komórki pęcherzykowe, skarłowaciałe komórki i skurczone jądra to pierwsze oznaki umierania komór jajowych. Zdegenerowany oocyt przed ośmioma godzinami obrazowania zwykle nie jest wykrywany.Jednak rzadkie przypadki wczesnego zwyrodnienia są spowodowane problemami podczas sekcji lub etapów montażu. Uszkodzenie komór na jaja zagraża ich przetrwaniu. Tak delikatna ręka, precyzyjna sekcja i przygotowanie mikrokomory są najważniejsze.Ta procedura pozwoliła nam zwizualizować, że jądro oocytu może przyjąć trzy różne trajektorie podczas swojej migracji, a różne organelle regulują te trajektorie w oocycie.

nuclear-migration-in-the-drosophila-oocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obserwacji migracji jądrowej w oocytach Drosophila przy użyciu mikroskopii obrazowania na żywo. Protokół umożliwia utrzymanie komór jajowych przy życiu przez 12 godzin, co pozwala na rejestrację szczegółowych filmów czasowych 3D.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

Przeglądaj więcej filmów