Migracja jądrowa w oocycie Drosophila
13 maja 2021
U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.
Technika ta umożliwia obserwację długich procesów biologicznych w wypreparowanych komorach jajowych Drosophila, takich jak migracja jądra jajowego, za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo. Protokół ten opisuje, w jaki sposób utrzymać wypreparowane komory jajowe przy życiu przez 12 godzin w celu przeprowadzenia mikroskopii obrazowania na żywo. Na początek odpipetuj 200 mikrolitrów pożywki Schneidera i uzupełnij 30 mikrolitrami 10 miligramów insuliny na mililitr, a następnie dodaj cztery mikrolitry inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej.
Za pomocą końcówki pipety nałóż niewielką ilość smaru silikonowego wokół otworu na spodzie przebitego szkiełka. Umieść szkiełko nakrywkowe i użyj szerokiego końca końcówki pipety, aby wywrzeć nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć smar silikonowy w celu utworzenia silikonowego pierścienia wewnątrz szkiełka. Przenieś znieczulone samice much do studzienki preparacyjnej zawierającej 150 mikrolitrów pożywki do obrazowania.
Do preparowania samicy użyj kleszczy, aby chwycić klatkę piersiową i uszczypnąć naskórek grzbietu brzucha drugą parą kleszczy. Ostrożnie usuń macicę, jajowód i osłonkę mięśniową. Odizoluj i odłącz parę jajników widocznych przy otworze naskórka.
Umieść kroplę od 10 do 15 mikrolitrów pożywki do obrazowania na jajnikach i przenieś jeden jajnik do komory obrazowania. Aby oddzielić jajniki, użyj igły, aby przytrzymać tylny koniec jajnika. Użyj innej igły, aby ostrożnie wyciągnąć germarium, aby rozdzielić jajniki.
Przytrzymaj osłonkę jedną igłą i przeciągnij jajnik przez większe komory za pomocą innej igły, aby usunąć pozostałą osłonkę mięśniową z komór jajowych. Pozostawić odsłonięty jajnik do opadnięcia i zetknąć się ze szkiełkiem nakrywkowym. Usuń późne stadia i resztę jajników z mikrokomory za pomocą kleszczy.
Użyj igieł, aby ostrożnie oddalić jajniki, aby ułatwić nabycie. Wytnij mały kwadrat przepuszczalnej membrany o wymiarach 10 na 10 milimetrów. Ostrożnie nałóż membranę na wierzch podłoża obrazowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie hermetycznie zamknij komorę cienką warstwą oleju halowęglowego wokół studni na konturze membrany. Umieść zestaw do obrazowania na uchwycie szkiełek mikroskopu odwróconego i użyj obiektywu 40X. Migrację jądra oocytu komory jajowej typu dzikiego uchwycono za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo.
Jądro dociera do przedniej błony plazmatycznej lub bocznej błony plazmatycznej, zanim przesuwa się wzdłuż trajektorii, aby osiągnąć ostateczną pozycję na przecięciu dwóch błon plazmatycznych. Deformacje błony, zdezorganizowane komórki pęcherzykowe, skarłowaciałe komórki i skurczone jądra to pierwsze oznaki umierania komór jajowych. Zdegenerowany oocyt przed ośmioma godzinami obrazowania zwykle nie jest wykrywany.
Jednak rzadkie przypadki wczesnego zwyrodnienia są spowodowane problemami podczas sekcji lub etapów montażu. Uszkodzenie komór na jaja zagraża ich przetrwaniu. Tak delikatna ręka, precyzyjna sekcja i przygotowanie mikrokomory są najważniejsze.
Ta procedura pozwoliła nam zwizualizować, że jądro oocytu może przyjąć trzy różne trajektorie podczas swojej migracji, a różne organelle regulują te trajektorie w oocycie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę obserwacji migracji jądra oocyta u Drosophila za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo. Technika ta pozwala na utrzymanie wypreparowanych komór jajowych przez 12 godzin, co umożliwia rejestrację wielopozycyjnych trójwymiarowych filmów time-lapse.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- biologia rozwoju
Wstęp
- Muszka owocowa Drosophila służy jako organizm modelowy do badania oogenezy.
- Migracja zależna od mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla rozwoju oocytu.
- Techniki obrazowania na żywo pozwalają na lepsze zrozumienie dynamicznych procesów komórkowych.
- Utrzymanie żywotności komór jajowych jest niezbędne do długoterminowego obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie protokołu obrazowania na żywo migracji jądra oocytu.
- Utrzymanie żywotności komór jajowych przez dłuższy czas podczas obserwacji.
- Wykorzystanie konfokalnej mikroskopii z dyskiem rotującym do szczegółowego obrazowania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki Schneidera uzupełnionej o insulinę i płodową surowicę cielęcą.
- Nałożenie smaru silikonowego w celu stworzenia stabilnego środowiska do obrazowania.
- Disekcja samic much w celu pozyskania komór jajowych do obrazowania.
- Wykorzystanie konfokalnej mikroskopii dyskowej (spinning-disk) do rejestracji filmów poklatkowych.
Główne wyniki
- Skuteczne utrzymanie komór jajowych przez 12 godzin podczas obrazowania.
- Wyraźna wizualizacja procesów migracji jądra oocytu.
- Wykazanie skuteczności technik obrazowania na żywo.
- Wkład w zrozumienie biologii rozwoju Drosophila.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szczegółową obserwację dynamiki oocytów.
- Obrazowanie na żywo dostarcza wiedzy na temat mechanizmów migracji komórkowej.
- Metodę tę można zastosować do innych procesów biologicznych u Drosophila.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie dynamiki migracji jądra w systemach modelowych, takich jak oocyty Drosophila, dostarcza fundamentalnych informacji na temat regulacji cytoszkieletu i mechanizmów transportu wewnątrzkomórkowego, które są istotne dla walidacji celów w testach opartych na komórkach. Obrazowanie na żywo trójwymiarowego ruchu organelli umożliwia mechanistyczną weryfikację hipotez dotyczących białek motorowych, stabilności mikrotubul lub ustanawiania polarności — kluczowych kwestii we wczesnych etapach odkrywania leków, gdzie przesiewy fenotypowe opierają się na odczytach subkomórkowych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną poprzez powiązanie perturbacji molekularnych z obserwowalnymi, mierzalnymi zachowaniami komórkowymi w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących regulatorów cytoszkieletu i białek odpowiedzialnych za pozycjonowanie jądra poprzez bezpośrednią wizualizację trajektorii migracji.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych ze zmianami w wzorcach ruchu jądra w 3D.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia standaryzację testu poprzez zapewnienie ilościowych, rozdzielczych w czasie odczytów pozycji jąder oraz kinetyki migracji w kontrolowanym środowisku obrazowania długoterminowego.
- Wartość operacyjna: Poprawia gotowość do przesiewu dzięki powtarzalnemu przygotowaniu komór jajowych i stabilnej żywotności komór jajowych *Drosophila* do 12 godzin, co umożliwia porównania w wielu warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje system istotny z punktu widzenia jednostek chorobowych do badania defektów polaryzacji związanych z zaburzeniami rozwojowymi, wspierając translacyjne poszukiwania biomarkerów poprzez korelację błędnej lokalizacji jądra z efektami fenotypowymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną, umożliwiając walidację wyników z fazy odkrywczej w modelu genetycznie podatnym i kompatybilnym z obrazowaniem na żywo przed przejściem do systemów ssaków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celu, przez optymalizację testów, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadkach, gdy dynamika jądra komórkowego lub funkcja cytoszkieletu są kluczowe dla mechanizmu działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym tego, jak specyficzne wyciszanie genów lub traktowanie związkami modyfikuje migrację jąder komórkowych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzacji konfiguracji komór oraz ilościowemu śledzeniu 3D pozycji jądra jako funkcjonalnego odczytu efektów działania związków.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, takie jak prędkość migracji, wybór trajektorii i końcowe rozmieszczenie jąder, które mogą być porównywane statystycznie pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączą się z pracami przedklinicznymi poprzez ustanowienie związku przyczynowego między defektami rozmieszczenia jąder a fenotypami rozwojowymi, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę obrazowania z możliwością ponownego wykorzystania do badania transportu wewnątrzkomórkowego, rozmieszczenia organelli lub ustanawiania polaryzacji w wielu projektach z zakresu biologii rozwoju i biologii komórki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do mechanizmów docelowych poprzez redukcję niejednoznaczności w sposobie, w jaki interwencje molekularne wpływają na organizację i dynamikę subkomórkową.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zwalidowanemu protokołowi przygotowania komory, który utrzymuje żywotność tkanki podczas przedłużonego obrazowania na żywo.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych, obserwowalnych punktów odniesienia fenotypowych dla celów zaangażowanych w regulację cytoszkieletu lub transport wewnątrzkomórkowy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich udowodnionego wpływu na migrację jądra komórkowego, proces powiązany z losem komórki i integralnością rozwojową.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji Drosophila, mikroskopii obrazowania na żywo oraz przygotowywaniu próbek fluorescencyjnych.
- Zależy od dostępu do konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym lub równoważnych systemów obrazowania 3D długoterminowego z kontrolą parametrów środowiskowych.
- Konieczna jest standaryzacja uszczelniania komory oraz składu medium pomiędzy zespołami, aby zapewnić spójną przeżywalność komór jajowych.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy stosowaniu systemu komory do innych typów tkanek lub stadiów rozwojowych poza okresem środkowej oogenezy.
- Ograniczone przez istotność fizjologiczną Drosophila w kontekście chorób ludzkich, co wymaga ortogonalnej walidacji w systemach ssaczych dla celów translacyjnych.
