Name: Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego O9-1 przy użyciu hydrogeli poliakrylamidowych o zmiennej sztywności. Protokół umożliwia analizę interakcji mechanicznych i chemicznych sygnałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Ana-Marii Zaske, operatorce Atomic Force Microscope-UT Core w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego, za wkład w ten projekt. Dziękujemy również J. Wangowi za źródła finansowania z National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 i R01HL142704).

1. Przygotowanie hydrożelu
UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane w kapturze do hodowli komórkowych, który został zdezynfekowany etanolem i wysterylizowany ultrafioletem (UV) przed użyciem, aby zachować sterylność. Narzędzia, takie jak pęseta i pipety, należy spryskać etanolem. Roztwory buforowe muszą być również sterylnie przefiltrowane.
<ol>
	<li>Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych aminozelanem
	<ol>
		<li>Umieść żądaną liczbę szklanych szkiełek nakrywkowych na kawałku chusteczki laboratoryjnej. 
		UWAGA: Przygotuj dodatkowe 3-4 szkiełka nakrywkowe, aby zapewnić wystarczającą ilość zapasowych zapasów, ponieważ łatwo się łamią. Różne materiały szklanych szkiełek nakrywkowych zapewnią różną kompatybilność wysiewu i mocowania komórek. Lepiej jest określić, który typ najlepiej pasuje do eksperymentu przed rozpoczęciem eksperymentów (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Użyj palnika alkoholowego lub palnika Bunsena, aby wysterylizować każde szkiełko nakrywkowe, przepuszczając je tam iz powrotem przez płomień (30 s w przypadku eksperymentów z testami białka). Umieść każde szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczce laboratoryjnej, aby ostygło.</li>
		<li>Gdy szklane szkiełka nakrywkowe ostygną, przenieś je na szalkę Petriego wyłożoną parafilmem, aby zapobiec poślizgowi. 
		UWAGA: Jeśli szkiełka nakrywkowe nie są wystarczająco chłodne, ciepło resztkowe stopi parafilm na zrazach, czyniąc je bezużytecznymi.</li>
		<li>Przykryj szkiełka nakrywkowe około 200 μl i 800 μl 0,1 M NaOH na szkiełko nakrywkowe odpowiednio 12 mm i 25 mm i pozostaw na 5 minut. Następnie odessać 0,1 M NaOH i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez kolejne 5 minut, aby utworzyć równomierny film.</li>
		<li>Po wysuszeniu szkiełek nakrywkowych należy odpipetować około 80 μl i 150 μl 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTS) dla szkiełek nakrywkowych o średnicy odpowiednio 12 mm i 25 mm. Należy uważać, aby nie rozlać roztworu na parafilm. Pozostaw roztwór na 5 minut.</li>
		<li>Odessać jak najwięcej APTS i pozostawić resztki APTS do wyschnięcia przez 5 minut. Dobrze wypłukać szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w sterylnym, dejonizowanym (DI)H2Otrzy razy na 5 minut za każdym razem. 
		UWAGA: Jeśli szklane szkiełka nakrywkowe nie zostaną dobrze wypłukane, pozostały APTS powoduje niepożądane reakcje z aldehydem glutarowym, powodując tworzenie się białego osadu i powodując bezużyteczność szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Przenieś szkiełka nakrywkowe na nową szalkę Petriego reaktywną stroną skierowaną do góry. Dodać tyle 0,5% aldehydu glutarowego do szalki Petriego, aby całkowicie pokryć szkiełka nakrywkowe i pozostawić szkiełka nakrywkowe na 30 minut.</li>
		<li>Odessać 0,5% aldehydu glutarowego i ponownie przepłukać szkiełka nakrywkowe w DIH 2O jeden raz przez 3 minuty. Przed użyciem należy ustawić szkiełka nakrywkowe reaktywną stroną do góry na chusteczce laboratoryjnej lub czystej szalce Petriego do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać; szkiełka nakrywkowe należy umieszczać w sterylnym DIH 2O do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie silikonowanych szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Umieścić taką samą liczbę szkiełek nakrywkowych, jak szkiełka nakrywkowe pokryte aminozelanem (etap 1.1.1) na szalce Petriego wyłożonej parafilmem.</li>
		<li>Odpipetować 40 μl lub 150 μl dla szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm i 25 mm odpowiednio z dichlorometylosilanu (DCMS) na jedną stronę szkiełka nakrywkowego i pozostawić roztwór na 5 minut.</li>
		<li>Odessać pozostały roztwór ze szkiełka nakrywkowego, umyć w sterylnym DIH 2O raz przez 1 minutę i umieścić reaktywne szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do góry na chusteczce laboratoryjnej do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przed przejściem do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hydrożeli
	<ol>
		<li>Zmieszać akrylamid, bis-akryloamid i DIH2Ow probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby przygotować 500 μl roztworów o różnej sztywności (patrz tabela 1). Wiruj roztwór przez 30 sekund, aby dokładnie go wymieszać.</li>
		<li>Działając szybko, dodaj 10% roztwór nadsiarczanu amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do probówki i ponownie zwiruj roztwory, aby wymieszać roztwory. 
		UWAGA: Przygotuj świeży 10% APS i pozostaw go na lodzie lub zamroź do jednorazowych porcji ze względu na wrażliwy cykl zamrażania/rozmrażania.</li>
		<li>Pobrać pipetą około 33 μl lub 100 μl roztworu na wysuszone szkiełka nakrywkowe pokryte aminozylanem o średnicy 12 mm lub 25 mm (sekcja 1.1).</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionej pęsety natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe nasączone DCMS na wierzchu roztworu żelu, tak aby strona poddana działaniu środka dotykała roztworu żelu, umieszczając w ten sposób roztwór żelu między szkiełkiem nakrywkowym poddanym działaniu DCMS a szkiełkiem nakrywkowym pokrytym aminozelanem.</li>
		<li>Pozostawić roztwór żelu do polimeryzacji przez 5-15 minut, aktywnie monitorując polimeryzację żelu pozostałego roztworu w probówce.</li>
		<li>Po polimeryzacji żelu oddziel szkiełko nakrywkowe nasączone DCMS zakrzywioną pęsetą lub żyletką, pozostawiając żel przymocowany do oryginalnego szkiełka nakrywkowego pokrytego aminozelanem.</li>
		<li>Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe z dołączonym hydrożelem w przeznaczonej do tego celu płytce 4-dołkowej/24-dołkowej i 6-dołkowej pokrytej 500 μl i 2 ml sterylnego PBS lub DI H2O dla szkiełek nakrywkowych odpowiednio 12 mm i 25 mm, aby zapobiec wysychaniu żelu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.3.4–1.3.7 dla wszystkich szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Zanurz hydrożele w sterylnym PBS lub DIH2O na 30 minut, aby usunąć nadmiar roztworu akrylamidu. Przechowywać hydrożele w sterylnym PBS lub DIH 2O w temperaturze 4 °C do zatrzymania zabiegu w tym miejscu.</li>
		<li>W ciemnym pomieszczeniu przygotować mieszaninę 6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanianu sulfosukcynimidylu (sulfo-SANPAH), mieszając 2,5 ml 50 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowego(HEPES) (pH = 8,5) z 25 μl 50 μg/ml sulfo-SANPAH w stożkowej probówce, owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Użyj pipety, aby dobrze wymieszać roztwór przed użyciem. 
		UWAGA: objętość 2,5 ml roztworu sulfo-SANPAH wystarcza na około dwadzieścia pięć hydrożeli o średnicy 12 mm lub pięć hydrożeli o średnicy 25 mm.</li>
		<li>Odessać PBS lub DIH2O z płytki studzienki. Dodać około 100 μl lub 500 μl dla szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm i 25 mm roztworu sulfo-SANPAH (etap 1.3.10) w celu przykrycia żelu. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa żel. 
		UWAGA: Dostosuj siłę ssania podciśnienia, aby zapobiec rozerwaniu lub zakłóceniu hydrożeli przez dużą siłę.</li>
		<li>Umieść żele z roztworem pod światłem UV o mocy 15 W, 365 nm na 10 minut, bez przykrycia, aby zminimalizować zakłócenia światła UV reagującego z sulfo-SANPAH.</li>
		<li>Odessać nadmiar sulfo-SANPAH, przechylając płytkę, aby zebrać jak najwięcej roztworu. Umyj żel za pomocą 50 mM HEPES dwa do trzech razy.</li>
		<li>Dodać 500 μl i 2 ml dla żeli 12 mm i 25 mm odpowiednio 50 mg/ml kolagenu I rozcieńczonego w 0,2% kwasie octowym do każdej studzienki zawierającej hydrożel. Pozostawić żele do inkubacji przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2. 
		UWAGA: Rozcieńczyć kolagen I w 0,2% kwasie octowym zamiast 50 mM HEPES, aby promować jednorodne rozmieszczenie i przyleganie kolagenu I.</li>
		<li>Odessać kolagen I i umyć żele sterylnym PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar kolagenu I przez 5 minut przy każdym myciu. Hydrożele inkubować w PBS z 10% surowicą końską, 5% FBS przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . 
		UWAGA: Dodatek 10% surowicy końskiej sprzyja większej proliferacji w porównaniu do stosowania tylko FBS, jak to miało miejsce w poprzedniej publikacji.</li>
		<li>Zassać pożywkę. Do każdej studzienki dodać 500 ml sterylnie przefiltrowanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S). Żele należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do czasu, gdy będą gotowe do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Po przygotowaniu rozłóż około 1,5 × 104 komórek O9-1/cm2 w pożywce podstawowej w szalkach hodowlanych. Inkubować komórki przez 2 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Sprawdź komórki pod kątem zbieżności, aby upewnić się, że komórki są wystarczająco połączone z żelami i że liczba komórek jest wystarczająca przed pobraniem do analizy. 
		UWAGA: Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem, aby zapoznać się z krokami odzyskiwania, przechodzenia i zbierania komórek O9-120.</li>
		<li>Przejdź do sekcji 2, 3 lub 4 w celu dalszej analizy hydrożeli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ilościowa analiza sztywności za pomocą AFM
<ol>
	<li>Uruchom komputer systemu AFM, a następnie sterownik AFM (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zamontuj wspornik AFM na uchwycie sondy AFM. Użyj kulistego wspornika z kulką krzemionkową 0,5 μm zamontowaną na końcu wspornika (wspornik ze sferyczną kulistą kulą). 
	UWAGA: W przypadku sztywniejszych hydrożeli, takich jak 10 kPa, 20 kPa i 40 kPa, zastosowano sztywniejszą sondę o stałej sprężystości 0,24 N/m. Do bardziej miękkich hydrożeli, takich jak 0,5 kPa i 1 kPa, zastosowano bardziej miękką sondę o stałej sprężystości 0,059 N/m.</li>
	<li>Ustaw oprogramowanie AFM w trybie kontaktowym.</li>
	<li>Zamontuj płytkę krzemową na stoliku na próbkę AFM, aby zebrać krzywe siły, klikając przycisk Zaangażuj, aby wspornik dotknął podłoża krzemowego, generując w ten sposób krzywe siły.</li>
	<li>Użyj powyższych krzywych siły (2.4) do kalibracji, kliknij Kalibruj w oprogramowaniu sterującym, aby uzyskać średnią stałą sprężystości wspornika w warunkach strojenia termicznego i zapisz skalibrowane wartości w oprogramowaniu sterującym.</li>
	<li>Zamontuj próbki, umieszczając szkiełko nakrywkowe z dołączonym hydrożelem na szalce Petriego o średnicy 60 mm na stoliku skanującym AFM. Dodaj 3 ml PBS do naczynia przed przeprowadzeniem pomiarów, aby zapobiec wysychaniu żelu.</li>
	<li>Ustaw AFM tak, aby działał w trybie kontaktowym (płyn), aby rozpocząć pomiar. Zaczepić kulkę kulistą, aby w sposób ciągły dotykać i podnosić z próbki żelu.</li>
	<li>Ustawić wspornik tak, aby jego próg ugięcia pozostał na poziomie 10 nm. Utrzymuj rozmiar zagłębiania skośnego sondy na poziomie 10 μm. Następnie zapisz krzywe siły jak w kroku 2.4.</li>
	<li>Uzyskaj co najmniej 20 krzywych siły z co najmniej 3 do 10 różnych miejsc na powierzchni hydrożelu.</li>
	<li>Oblicz średni moduł Younga wynoszący ~20 krzywych siły dla każdego miejsca za pomocą oprogramowania do obrazowania i analizy AFM. Użyj wydłużonych krzywych siły rampy i modelu zlinearyzowanego (sferycznego). Obliczyć średnią ze wszystkich plamek dla każdej próbki, aby uzyskać końcową sztywność. 
	UWAGA: Moduł Younga i powiązane dane (tj. odchylenia standardowe) są automatycznie zapisywane jako arkusz kalkulacyjny.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.6-2.10 dla wszystkich próbek.</li>
</ol>
3. Molekularna analiza sztywności za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Użyj pęsety, aby przetransportować szkiełko nakrywkowe na nową płytkę, aby zminimalizować fałszywe sygnały z komórek wyhodowanych bezpośrednio na płytce. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl sterylnego PBS w celu usunięcia martwych komórek i pozostałej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, bez zakłóceń. Następnie ponownie umyj komórki trzy razy, używając 500 μl PBS/studzienkę przez 2 minuty każda. 
	UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu zatrzymania zabiegowego.</li>
	<li>Potraktuj komórki 500 μl 0,1% Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki trzykrotnie 500 μl PBS/studzienkę.</li>
	<li>Zablokuj komórki 250 μl 10% surowicy osła (rozcieńczonej w PBS i 0,1% Tween 20) na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować komórki z 250 μl przeciwciał pierwszorzędowych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przemyj komórki trzykrotnie 500 μl PBS/studzienkę przez 5 minut każda. 
	UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano anty-winkulinę (Vcl) (1:250) i anty-AP2 alfa (1:250) i rozcieńczono je w 10% surowicy osła.</li>
	<li>Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi i / lub falloidyną używaną do barwienia F-aktyny w rozcieńczeniu 1:400 w 250 μl 10% surowicy osła przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każda. 
	UWAGA: Falloidyna o długości fali 568 nm może być inkubowana z przeciwciałami drugorzędowymi o długości fali 488 nm lub 647 nm lub samodzielnie.</li>
	<li>Inkubować komórki z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, rozcieńczenie 1:1000) w 250 μl PBS przez 10 minut, a następnie ponownie przemywać PBS przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem, aby upewnić się, że podłoże mocujące jest prawidłowo ustawione.</li>
	<li>Uchwyć obrazy co najmniej 3 losowych ramek na próbkę hydrożelu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, tworząc pojedyncze i połączone kanały.</li>
</ol>
4. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
<ol>
	<li>Przenieś hydrożele z przylegającymi komórkami w celu zebrania RNA na nową płytkę, aby zminimalizować niepożądane RNA z komórek przyczepionych do płytki komórkowej. Przemyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć martwe komórki i pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Wyodrębnij całkowite mRNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Wykonaj odwrotną transkrypcję RNA do cDNA za pomocą supermiksu z odwrotną transkrypcją, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonać RT-qPCR ze starterami dla Vcl jako markera sztywności do wyboru i przeanalizować metodą 2-ΔΔCT. 
	UWAGA: Sekwencja startera Vcl: Naprzód 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; rewers 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Celem obecnego badania jest dostarczenie skutecznego i wydajnego systemu in vitro , aby lepiej zrozumieć wpływ sygnałów mechanicznych na NCC. Oprócz postępowania zgodnie z wyżej wymienionym protokołem krok po kroku, naukowcy muszą pamiętać, że na hodowlę komórkową NCC O9-1 ma wpływ rodzaj szklanych szkiełek nakrywkowych używanych do przygotowania hydrożeli. Na przykład zauważono, że komórki wysiane na określonym typie szklanego szkiełka nakrywkowego (patrz Tabela materiałów) przetrwały i dobrze ...

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to grupa komórek macierzystych podczas embriogenezy kręgowców o niezwykłej zdolności do migracji i przyczyniania się do rozwoju różnych organów i tkanek. NCC mogą różnicować się w różne typy komórek, w tym neurony czuciowe, chrząstki, kości, melanocyty i komórki mięśni gładkich, w zależności od lokalizacji pochodzenia osiowego i lokalnych wytycznych środowiskowych NCC1,2. Dzięki zdolności do różnicowania się w szeroki wachlarz typów komórek, nieprawidłowości genetyczne, które powodują rozregulowanie na dowolnym etapie rozwoju grzebienia nerwowego (NC), mogą prowadzić do wielu chorób wrodzonych2. Na przykład zaburzenia podczas powstawania, migracji i rozwoju NCC prowadzą do zaburzeń rozwojowych znanych zbiorczo jako neurokrystopatie1,3. Choroby te obejmują zarówno wady twarzoczaszki spowodowane niepowodzeniem w tworzeniu NCC, takie jak zespół Treachera Collinsa, jak i rozwój różnych nowotworów spowodowanych zdolnością migracji przerzutowej NCC, jak widać w czerniaku3,4,5,6. W ciągu ostatnich kilku dekad naukowcy dokonali niezwykłych odkryć na temat roli i mechanizmów NCC w rozwoju i chorobach, przy czym większość ustaleń koncentruje się na sygnałach chemicznych7,8. Ostatnio wykazano, że sygnały mechaniczne odgrywają krytyczną, ale słabo poznaną rolę w rozwoju NCC9,10.
Sygnały środowiskowe NCC odgrywają kluczową rolę podczas ich rozwoju, w tym regulację różnicowania NCC na różne typy komórek. Sygnały środowiskowe, np. wskazówki fizyczne, wpływają na kluczowe zachowania i reakcje komórkowe, takie jak dywersyfikacja funkcjonalna. Mechanotransdukcja pozwala komórkom wyczuwać i reagować na te sygnały w celu utrzymania różnych procesów biologicznych2. NCC są otoczone przez sąsiednie komórki i różne substraty, takie jak macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), która może powodować bodźce mechaniczne w celu utrzymania homeostazy i przystosowania się do zmian poprzez determinację losu, proliferację i apoptozę11. Mechanotransdukcja rozpoczyna się w błonie plazmatycznej, gdzie występuje komponent czuciowy mechanicznych bodźców zewnątrzkomórkowych, co skutkuje wewnątrzkomórkową regulacją komórki12. Integryny, zrosty ogniskowe i połączenia błony plazmatycznej przekazują sygnały mechaniczne, takie jak siły ścinające, naprężenia i sztywność otaczających substratów, na sygnały chemiczne w celu wytworzenia odpowiedzi komórkowych12. Przekazywanie sygnałów chemicznych z błony komórkowej do końcowej regulacji komórkowej odbywa się za pośrednictwem różnych szlaków sygnałowych w celu sfinalizowania procesów niezbędnych dla organizmu, takich jak różnicowanie.
Kilka badań sugeruje, że mechaniczna sygnalizacja ze sztywności podłoża odgrywa rolę w różnicowaniu komórek13,14. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) hodowane na miękkich podłożach o sztywności podobnej do tkanki mózgowej (w zakresie 0,1-1,0 kPa) powodowały różnicowanie komórek neuronalnych15,16. Jednak więcej MSCs różnicuje się w komórki podobne do miocytów, gdy są hodowane na podłożach o natężeniu 8-17 kPa, naśladując sztywność mięśni, podczas gdy różnicowanie podobne do osteoblastów zaobserwowano, gdy MSCs hodowano na sztywnych podłożach (25-40 kPa)15,16. Znaczenie mechanotransdukcji podkreślają nieprawidłowości i nieprawidłowości w mechanicznym szlaku sygnałowym, które potencjalnie prowadzą do poważnych wad rozwojowych i chorób, w tym raka, chorób układu krążenia i osteoporozy17,18,19. W nowotworach normalna tkanka piersi jest miękka, a ryzyko raka piersi wzrasta w sztywnej i gęstej tkance piersi, środowisku bardziej zbliżonym do guzów piersi15. Dzięki tej wiedzy wpływ sygnalizacji mechanicznej na rozwój NCC można badać poprzez prostą manipulację sztywnością substratu za pomocą systemu in vitro, co zapewnia dalsze korzyści i możliwości w zrozumieniu podstaw progresji i etiologii choroby związanej z NC.
Aby zbadać wpływ sygnałów mechanicznych na NCC, stworzyliśmy efektywny system in vitro dla NCC oparty na optymalizacji wcześniej opublikowanych metod i ocenie reakcji NCC na różne sygnały mechaniczne20,21. Opracowano szczegółowy protokół przygotowania różnej sztywności hydrożelu i oceny wpływu sygnalizacji mechanicznej w NCC. Aby to osiągnąć, NCC O9-1 są wykorzystywane jako model NC do badania efektów i zmian w odpowiedzi na sztywne i miękkie hydrożele. NCC O9-1 to stabilna linia komórkowa NC wyizolowana z zarodka myszy (E) w 8,5 dniu. O9-1 NCC naśladują NCC in vivo, ponieważ mogą różnicować się w różne typy komórek pochodzących z NC w zdefiniowanych mediach różnicujących22. Aby zbadać sygnalizację mechaniczną NCC, wyprodukowano podłoże matrycowe o regulowanej elastyczności z różnych stężeń roztworów akrylamidu i bis-akrylamidu, aby osiągnąć pożądaną sztywność, skorelowaną ze sztywnością podłoża biologicznego20,21,23. Aby zoptymalizować warunki podłoża matrycowego dla NCC, w szczególności komórek O9-1, dokonano modyfikacji na podstawie wcześniej opublikowanego protokołu20. Jedną ze zmian wprowadzonych w tym protokole była inkubacja hydrożeli w kolagenie I, rozcieńczonych w 0,2% kwasie octowym zamiast 50 mM HEPES, w temperaturze 37 °C przez noc. Niskie pH kwasu octowego prowadzi do jednorodnego rozmieszczenia i większej inkorporacji kolagenu I, co pozwala na bardziej równomierne przyłączanie białka ECM24. Ponadto przed przechowywaniem hydrożeli w inkubatorze zastosowano kombinację surowicy końskiej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stężeniach odpowiednio 10% i 5% w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS). Surowica końska była stosowana jako dodatkowy suplement do FBS ze względu na jej zdolność do promowania proliferacji i różnicowania komórek w stężeniu 10%25.
Dzięki tej metodzie, środowisko biologiczne zostało naśladowane przez powłokę białkową ECM (np. Kolagen I), aby stworzyć dokładne środowisko in vitro dla NCC do wzrostu i przetrwania20,21. Sztywność przygotowanych hydrożeli analizowano ilościowo za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), dobrze znanej techniki obrazowania modułu sprężystości26. Aby zbadać wpływ różnych poziomów sztywności na NCC, komórki O9-1 typu dzikiego hodowano i przygotowywano na hydrożelach do barwienia immunofluorescencyjnego (IF) aktyną nitkowatą (F-aktyna), aby pokazać różnice w adhezji komórek i morfologii w odpowiedzi na zmiany sztywności substratu. Korzystając z tego systemu in vitro, naukowcy będą mogli badać rolę sygnalizacji mechanicznej w NCC i jej interakcję z innymi sygnałami chemicznymi, aby lepiej zrozumieć związek między NCC a sygnalizacją mechaniczną.

<table><tbody><tr><td>12 mm #1 Corning 0211 Szkiełko nakrywkowe</td><td>Chemglass Nauki</td><td>przyrodnicze CLS-1763-012</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-Akrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662165</td><td></td></tr><tr><td>25 mm #1 Corning 0211 Szkiełko nakrywkowe</td><td>Chemglass Nauki przyrodnicze</td><td>CLS-1763-025</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>J61899-AP</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>50% aldehyd glutarowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik AFM (kulista kula)</td><td>Oprogramowanie Novascan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>Katalizator NanoScope</td><td></td><td>Model: 8.15 SR3R1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>anty-AP-2 i alfa; Przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-12726</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Winkuliny</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia sił atomowych (AFM) Bioskop Katalizator</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I (100mg)</td> <td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethylsilan (DCMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440272</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td></td><td>Model DMi8</td></tr><tr><td>Montaż Fluoromount-G średni</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-35</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Corning</td><td>35-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>iScript Odwrotna transkrypcja Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk penicylinowo-streptomycynowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny 1x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda dejonizowana</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>U284</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>SYBR zielony</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472908</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany system o9-1/hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to embrionalne komórki multipotencjalne kręgowców, które mogą migrować i różnicować się w szeroki wachlarz typów komórek, które dają początek różnym organom i tkankom. Sztywność tkanki wytwarza siłę mechaniczną, fizyczną wskazówkę, która odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu NCC; Mechanizm ten pozostaje jednak niejasny. Opisana tutaj metoda dostarcza szczegółowych informacji na temat zoptymalizowanej generacji hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności, dokładnego pomiaru takiej sztywności oraz oceny wpływu sygnałów mechanicznych w komórkach O9-1, linii NCC, która naśladuje NCC in vivo.
Sztywność hydrożelu została zmierzona za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) i wskazała różne poziomy sztywności. NCC O9-1 hodowane na hydrożelach o różnej sztywności wykazywały różną morfologię komórek i ekspresję genów włókien stresowych, co wskazywało na różne efekty biologiczne spowodowane mechanicznymi zmianami sygnału. Co więcej, ustalono, że zmiana sztywności hydrożelu zaowocowała skutecznym systemem in vitro do manipulowania sygnalizacją mechaniczną poprzez zmianę sztywności żelu i analizę regulacji molekularnej i genetycznej w NCC. NCC O9-1 mogą różnicować się w szeroki zakres typów komórek pod wpływem odpowiednich pożywek różnicujących, a manipulowanie sygnałami chemicznymi in vitro jest wygodne. Dlatego ten system in vitro jest potężnym narzędziem do badania roli sygnalizacji mechanicznej w NCC i jej interakcji z sygnałami chemicznymi, co pomoże naukowcom lepiej zrozumieć molekularne i genetyczne mechanizmy rozwoju grzebieni nerwowych i chorób.

Przygotowanie hydrożelu i ocena sztywności za pomocą AFM i modelu Hertza 
W niniejszym dokumencie przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności poprzez regulację stosunku akryloamidu do bis-akryloamidu. Hydrożele poliakrylamidowe nie są jednak gotowe do adhezji komórek ze względu na brak białek ECM. W związku z tym sulfo-SANPAH, działając jako łącznik, wiąże się kowalencyjnie z hydrożelami i reaguje z aminami pierwszorzędowymi białek ECM, co umożliwia ...

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Metoda pomaga w badaniu sygnalizacji mechanicznej komórek grzebienia nerwowego i jej interakcji z sygnałami chemicznymi. Może również pomóc w molekularnych i genetycznych mechanizmach rozwoju grzebienia nerwowego w chorobach. Przenoszenie szkiełek nakrywkowych jest najtrudniejsze, dlatego przenoś je powoli i uważnie, aby zapobiec ich stłuczeniu i upuszczeniu.Procedurę zademonstrujemy ja i dr Sherry Zhao, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia żądanej liczby szkiełek szklanych na kawałku chusteczki laboratoryjnej. Następnie wysterylizuj każde szkiełko nakrywkowe, przepuszczając je tam iz powrotem przez płomień palnika alkoholowego.Gdy szkiełko nakrywkowe ostygnie, przykryj 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe około 200 mikrolitrami, a 25-milimetrowe szkiełko nakrywkowe 800 mikrolitrami 0,1-molowego wodorotlenku sodu. Po pięciu minutach odessać wodorotlenek sodu i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut, aby utworzyć równomierny film. Po wysuszeniu szkiełek nakrywkowych dodać około 18 mikrolitrów aminopropylotrietoksysilanu lub APTS na 12-milimetrowym szkiełku nakrywkowym i 150 mikrolitrów APTS na 25-milimetrowym szkiełku nakrywkowym.Zassać APTS dostępowy, aby pozostałe APTS wyschły przez pięć minut. Później spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie, zanurzając je za każdym razem w sterylnej wodzie dejonizowanej na pięć minut. Przenieś umyte szkiełka nakrywkowe na świeżą szalkę Petriego reaktywną stroną skierowaną do góry.I potraktuj szkiełka nakrywkowe, mocząc je w wystarczającej ilości 0,5% aldehydu glutarowego przez 30 minut. Po zassaniu aldehydu glutarowego należy raz spłukać szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną przez trzy minuty i wysuszyć szkiełka nakrywkowe na powietrzu stroną reaktywną do góry. Aby przygotować silikonowane szkiełka nakrywkowe, należy umieścić taką samą liczbę szkiełek nakrywkowych jak szkiełka nakrywkowe pokryte aminozelanem na szalce Petriego wyłożonej folią para.Następnie 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe należy traktować 40 mikrolitrami, a 25-milimetrowe szkiełka nakrywkowe 150 mikrolitrami dichlorometanu silanu lub DCMS przez pięć minut. Umyj szkiełka nakrywkowe sterylną wodą dejonizowaną raz przez jedną minutę przed umieszczeniem reaktywnych szkiełek nakrywkowych stroną zadrukowaną do góry na chusteczce laboratoryjnej. Aby przygotować hydrożele, należy odpipetować świeżo przygotowany roztwór żelu akrylowoamidowego na wysuszone szkiełka nakrywkowe pokryte aminozelanem.Za pomocą zakrzywionej pęsety natychmiast przenieś szkiełko nakrywkowe nasączone DCMS na wierzch roztworu żelu, tak aby strona poddana działaniu środka dotykała roztworu żelu, a tym samym przekładką wymieniać roztwór żelu między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Po polimeryzacji żelu należy oddzielić szkiełko nakrywkowe poddane działaniu DCMS za pomocą zakrzywionej pęsety, pozostawiając żel przymocowany do szkiełka nakrywkowego pokrytego aminozelanem. Następnie zanurz 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe z dołączonym hydrożelem w określonej 4-dołkowej lub 24-dołkowej płytce pokrytej 500 mikrolitrami sterylnego PBS lub dejonizowanej wody, a 25-milimetrową szkiełko nakrywkowe w 6-dołkowej płytce pokrytej dwoma mililitrami sterylnego PBS lub dejonizowanej wody na 30 minut.Po usunięciu nadmiaru roztworu akrylamidu należy przechowywać hydrożele w sterylnym PBS lub dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej przez 30 minut. Później odessać PBS lub wodę dejonizowaną z płytki studziennej przed dodaniem roztworu sulfo-sukcynimydylu lub Sulfo-SUNPAH, aby całkowicie pokryć żel. I umieść żele z roztworem pod 15-watowym światłem ultrafioletowym o długości 365 nanometrów na 10 minut.Zebrać jak najwięcej sulfo-SANPAH w roztworze, przechylając płytkę. A następnie umyj żel dwa do trzech razy 15 milimolowymi HEPES. Dodaj 15 miligramów na mililitr kolagenu 1 rozcieńczonego w 0,2% kwasie octowym do każdej studzienki zawierającej hydrożel.I inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia wykonaj płukanie zgodnie z opisem w rękopisie przed inkubacją hydrożeli z PBS zawierającym 10% surowicy końskiej i 5% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po dwóch godzinach inkubacji dodaj 500 mikrolitrów sterylnego, przefiltrowanego DMEM z 10% FBS i 1% streptomycyną penicyliny do każdej studzienki i przechowuj żele w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Gdy hodowla komórkowa jest gotowa, rozłóż na płytce około 1,5 razy 10 do czwartej 09-1 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce bazell. Użyj pęsety, aby przetransportować szkiełka nakrywkowe na nową płytkę, aby zminimalizować fałszywe sygnały z komórek wyhodowanych bezpośrednio na płytce. Następnie utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez 10 minut, a następnie potraktuj komórki 500 mikrolitrami 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej.Po 15 minutach przejdź się po komórkach z 250 mikrolitrami 10% surowicy osła. Wybarwić komórki na obecność F-aktyny felodypiną w rozcieńczeniu od 1 do 400 w 250 mikrolitrach 10% surowicy osła, a następnie inkubować z DAPI przez 10 minut. Umyj komórki PBS przez dwie minuty przed dodaniem trzech do czterech kropli pożywki montażowej do każdej studzienki.Na mikroskopie fluorescencyjnym uchwyć obrazy co najmniej trzech losowych ramek na próbkę hydrożelu, tworząc pojedyncze i połączone kanały. W ocenie sztywności hydrożelu za pomocą mikroskopii sił atomowych lub AFM, nachylenie krzywej siły było łagodne dla miękkich hydrożeli, ponieważ wymagana siła z sondy AFM była mniejsza. Jednak na sztywnych hydrożelach wygenerowane nachylenie było znacznie bardziej strome.Pomiary AFM wykorzystano następnie do obliczenia średniej sztywności hydrożeli na podstawie modułu sprężystości Younga w kilopaskalach. Charakterystykę wzrostu komórek P19 i 09-1 obserwowano w hydrożelach o pojemności jednego kilopaskali i 40 kilopaskali w kontrolnych i zmodyfikowanych układach żelowych. Komórki 09-1 wyhodowane na oryginalnych systemach żelowych skutkowały większą liczbą martwych komórek.W przeciwieństwie do tego, komórki 09-1 wyhodowane na zmodyfikowanych systemach żelowych wykazywały zdrowy wzrost komórek i wystarczające przywiązanie do substratu hydrożeli z niewielką ilością komórek, na co wskazuje minimalna liczba okrągłych komórek. Komórki P19 pokryte na obu układach hydrożelowych wykazywały nadmiar okrągłych pływających komórek i brak przyłączeń substratów komórkowych. Kompatybilność komórek grzebienia nerwowego lub NCC ze zmodyfikowanym systemem hydrożelowym oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla AP-2.Zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji AP-2 w komórkach 09-1 posianych na zmodyfikowanym układzie hydrożelowym. Dodatkowo, komórki 09-1 wykazywały różne morfologie w oparciu o hydrożele o niskiej lub wysokiej sztywności w różnych ilościach włókien naprężeniowych. Ekspresja anty-winkuliny w komórkach 09-1 wyhodowanych na hydrożelu o mocy 40 kilopaskali była wyższa niż w komórkach wyhodowanych na hydrożelu o grubości jednego kilopaskala, co odzwierciedla, że komórki wyhodowane na bardziej miękkich podłożach tworzą minimalne ogniskowe kompleksy addycyjne niż sztywne podłoże.Odpowiedni czas oczekiwania ma kluczowe znaczenie dla polimeryzacji hydrożeli, ponieważ akrylamidy są toksyczne dla komórek. Zanurz hydrożele w PBS lub wodzie dejonizowanej na co najmniej 30 minut, aby zapewnić lepsze rezultaty.

an-optimized-o9-1hydrogel-system-for-studying-mechanical-signals

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia fluorescencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w celu zademonstrowania barwienia falloidyną komórek grzebienia nerwowego hodowanych na hydrożelach o różnej sztywności w celu wizualizacji i analizy organizacji cytoszkieletu.

Barwienie fluorescencyjne komórek grzebienia nerwowego hodowanych na hydrożelach o różnej sztywności

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Ten protokół opisuje fizjologicznie istotne, ciśnieniowe podejście do szybkiego i odwracalnego wywoływania żylaków w neuronach.

System mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych

O9-1 to multipotencjalna linia komórek grzebienia nerwowego myszy. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły krok po kroku dotyczące hodowli komórek O9-1, różnicowania komórek O9-1 w określone typy komórek i genetycznego manipulowania komórkami O9-1 za pomocą knockdownu za pośrednictwem siRNA lub edycji genomu CRISPR-Cas9.

Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Poznaj metodę badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego O9-1 przy użyciu hydrogeli poliakrylamidowych o zmiennej sztywności. Protokół umożliwia analizę interakcji mechanicznych i chemicznych sygnałów.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Przeglądaj więcej filmów