Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Metoda pomaga w badaniu sygnalizacji mechanicznej komórek grzebienia nerwowego i jej interakcji z sygnałami chemicznymi. Może również pomóc w molekularnych i genetycznych mechanizmach rozwoju grzebienia nerwowego w chorobach. Przenoszenie szkiełek nakrywkowych jest najtrudniejsze, dlatego przenoś je powoli i uważnie, aby zapobiec ich stłuczeniu i upuszczeniu.

Procedurę zademonstrujemy ja i dr Sherry Zhao, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia żądanej liczby szkiełek szklanych na kawałku chusteczki laboratoryjnej. Następnie wysterylizuj każde szkiełko nakrywkowe, przepuszczając je tam iz powrotem przez płomień palnika alkoholowego.

Gdy szkiełko nakrywkowe ostygnie, przykryj 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe około 200 mikrolitrami, a 25-milimetrowe szkiełko nakrywkowe 800 mikrolitrami 0,1-molowego wodorotlenku sodu. Po pięciu minutach odessać wodorotlenek sodu i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut, aby utworzyć równomierny film. Po wysuszeniu szkiełek nakrywkowych dodać około 18 mikrolitrów aminopropylotrietoksysilanu lub APTS na 12-milimetrowym szkiełku nakrywkowym i 150 mikrolitrów APTS na 25-milimetrowym szkiełku nakrywkowym.

Zassać APTS dostępowy, aby pozostałe APTS wyschły przez pięć minut. Później spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie, zanurzając je za każdym razem w sterylnej wodzie dejonizowanej na pięć minut. Przenieś umyte szkiełka nakrywkowe na świeżą szalkę Petriego reaktywną stroną skierowaną do góry.

I potraktuj szkiełka nakrywkowe, mocząc je w wystarczającej ilości 0,5% aldehydu glutarowego przez 30 minut. Po zassaniu aldehydu glutarowego należy raz spłukać szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną przez trzy minuty i wysuszyć szkiełka nakrywkowe na powietrzu stroną reaktywną do góry. Aby przygotować silikonowane szkiełka nakrywkowe, należy umieścić taką samą liczbę szkiełek nakrywkowych jak szkiełka nakrywkowe pokryte aminozelanem na szalce Petriego wyłożonej folią para.

Następnie 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe należy traktować 40 mikrolitrami, a 25-milimetrowe szkiełka nakrywkowe 150 mikrolitrami dichlorometanu silanu lub DCMS przez pięć minut. Umyj szkiełka nakrywkowe sterylną wodą dejonizowaną raz przez jedną minutę przed umieszczeniem reaktywnych szkiełek nakrywkowych stroną zadrukowaną do góry na chusteczce laboratoryjnej. Aby przygotować hydrożele, należy odpipetować świeżo przygotowany roztwór żelu akrylowoamidowego na wysuszone szkiełka nakrywkowe pokryte aminozelanem.

Za pomocą zakrzywionej pęsety natychmiast przenieś szkiełko nakrywkowe nasączone DCMS na wierzch roztworu żelu, tak aby strona poddana działaniu środka dotykała roztworu żelu, a tym samym przekładką wymieniać roztwór żelu między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Po polimeryzacji żelu należy oddzielić szkiełko nakrywkowe poddane działaniu DCMS za pomocą zakrzywionej pęsety, pozostawiając żel przymocowany do szkiełka nakrywkowego pokrytego aminozelanem. Następnie zanurz 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe z dołączonym hydrożelem w określonej 4-dołkowej lub 24-dołkowej płytce pokrytej 500 mikrolitrami sterylnego PBS lub dejonizowanej wody, a 25-milimetrową szkiełko nakrywkowe w 6-dołkowej płytce pokrytej dwoma mililitrami sterylnego PBS lub dejonizowanej wody na 30 minut.

Po usunięciu nadmiaru roztworu akrylamidu należy przechowywać hydrożele w sterylnym PBS lub dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej przez 30 minut. Później odessać PBS lub wodę dejonizowaną z płytki studziennej przed dodaniem roztworu sulfo-sukcynimydylu lub Sulfo-SUNPAH, aby całkowicie pokryć żel. I umieść żele z roztworem pod 15-watowym światłem ultrafioletowym o długości 365 nanometrów na 10 minut.

Zebrać jak najwięcej sulfo-SANPAH w roztworze, przechylając płytkę. A następnie umyj żel dwa do trzech razy 15 milimolowymi HEPES. Dodaj 15 miligramów na mililitr kolagenu 1 rozcieńczonego w 0,2% kwasie octowym do każdej studzienki zawierającej hydrożel.

I inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia wykonaj płukanie zgodnie z opisem w rękopisie przed inkubacją hydrożeli z PBS zawierającym 10% surowicy końskiej i 5% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po dwóch godzinach inkubacji dodaj 500 mikrolitrów sterylnego, przefiltrowanego DMEM z 10% FBS i 1% streptomycyną penicyliny do każdej studzienki i przechowuj żele w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Gdy hodowla komórkowa jest gotowa, rozłóż na płytce około 1,5 razy 10 do czwartej 09-1 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce bazell. Użyj pęsety, aby przetransportować szkiełka nakrywkowe na nową płytkę, aby zminimalizować fałszywe sygnały z komórek wyhodowanych bezpośrednio na płytce. Następnie utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu przez 10 minut, a następnie potraktuj komórki 500 mikrolitrami 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej.

Po 15 minutach przejdź się po komórkach z 250 mikrolitrami 10% surowicy osła. Wybarwić komórki na obecność F-aktyny felodypiną w rozcieńczeniu od 1 do 400 w 250 mikrolitrach 10% surowicy osła, a następnie inkubować z DAPI przez 10 minut. Umyj komórki PBS przez dwie minuty przed dodaniem trzech do czterech kropli pożywki montażowej do każdej studzienki.

Na mikroskopie fluorescencyjnym uchwyć obrazy co najmniej trzech losowych ramek na próbkę hydrożelu, tworząc pojedyncze i połączone kanały. W ocenie sztywności hydrożelu za pomocą mikroskopii sił atomowych lub AFM, nachylenie krzywej siły było łagodne dla miękkich hydrożeli, ponieważ wymagana siła z sondy AFM była mniejsza. Jednak na sztywnych hydrożelach wygenerowane nachylenie było znacznie bardziej strome.

Pomiary AFM wykorzystano następnie do obliczenia średniej sztywności hydrożeli na podstawie modułu sprężystości Younga w kilopaskalach. Charakterystykę wzrostu komórek P19 i 09-1 obserwowano w hydrożelach o pojemności jednego kilopaskali i 40 kilopaskali w kontrolnych i zmodyfikowanych układach żelowych. Komórki 09-1 wyhodowane na oryginalnych systemach żelowych skutkowały większą liczbą martwych komórek.

W przeciwieństwie do tego, komórki 09-1 wyhodowane na zmodyfikowanych systemach żelowych wykazywały zdrowy wzrost komórek i wystarczające przywiązanie do substratu hydrożeli z niewielką ilością komórek, na co wskazuje minimalna liczba okrągłych komórek. Komórki P19 pokryte na obu układach hydrożelowych wykazywały nadmiar okrągłych pływających komórek i brak przyłączeń substratów komórkowych. Kompatybilność komórek grzebienia nerwowego lub NCC ze zmodyfikowanym systemem hydrożelowym oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla AP-2.

Zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji AP-2 w komórkach 09-1 posianych na zmodyfikowanym układzie hydrożelowym. Dodatkowo, komórki 09-1 wykazywały różne morfologie w oparciu o hydrożele o niskiej lub wysokiej sztywności w różnych ilościach włókien naprężeniowych. Ekspresja anty-winkuliny w komórkach 09-1 wyhodowanych na hydrożelu o mocy 40 kilopaskali była wyższa niż w komórkach wyhodowanych na hydrożelu o grubości jednego kilopaskala, co odzwierciedla, że komórki wyhodowane na bardziej miękkich podłożach tworzą minimalne ogniskowe kompleksy addycyjne niż sztywne podłoże.

Odpowiedni czas oczekiwania ma kluczowe znaczenie dla polimeryzacji hydrożeli, ponieważ akrylamidy są toksyczne dla komórek. Zanurz hydrożele w PBS lub wodzie dejonizowanej na co najmniej 30 minut, aby zapewnić lepsze rezultaty.