Name: Implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Poznaj implantację rusztowania kolagenowego w wątrobę szczura w celu regeneracji tkanki wątrobowej. Ta metoda inżynierii tkankowej oferuje obiecującą alternatywę dla transplantacji w leczeniu chorób wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować personelowi Zakładu Zwierząt Laboratoryjnych Jednostki Medycyny Doświadczalnej, pielęgniarce Carolinie Baños G. za wsparcie techniczne i chirurgiczne, Marco E. Gudiño Z. za wsparcie w mikrofotografiach oraz Erickowi Apo za wsparcie w histologii wątroby. Krajowa Rada wsparła te badania dla nauki i technologii (CONACyT), grant nr SALUD-2016-272579 oraz PAPIIT-UNAM TA200515.

Obecne badania zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Szkoły Medycznej (DI/115/2015) na Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) oraz komisję etyki Szpitala General de Mexico (CI/314/15). Instytucja spełnia wszystkie specyfikacje techniczne dotyczące produkcji, opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i jest prawnie certyfikowana przez prawo krajowe (NOM-062-ZOO-1999). Samce szczurów rasy Wistar o wadze 150-250 g (w wieku 6-8 tygodni) uzyskano do tego badania z Zakładu Zwierząt Laboratoryjnych Szkoły Medycznej UNAM.
1. Pozyskiwanie rusztowań macierzy kolagenowej z kości udowej bydła
<ol>
	<li>Kłykiet należy pozyskać z kości udowej bydła z rzeźni certyfikowanej przez meksykańskie organy ds. zdrowia i rolnictwa.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wypreparuj tłuszcz kłykci, mięśnie i chrząstki za pomocą narzędzia chirurgicznego. Pokrój fragmenty kłykcia na fragmenty o wymiarach 3 cm x 3 cm za pomocą noża piły i oczyść tłuszcz i krew ręcznikiem. Umyj fragmenty kłykcia wodą.</li>
		<li>Gotować (92 °C) fragmenty w 1 l anionowego detergentu (10 g/l) przez 30 minut. Dwukrotnie umyć fragmenty kłykci, aby usunąć wszelkie pozostałości anionowego detergentu.</li>
		<li>Suszyć fragmenty kłykci przez 3 godziny za pomocą bibuły filtracyjnej (0,5 mm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj trójkątny (1 cm x1 cm x1 cm) CMS o grubości 0,5 cm z fragmentów wymienionych w kroku 1.1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Demineralizować fragmenty w 100 ml 0,5 M HCl przez 10 minut przy ciągłym mieszaniu. Usuń HCl. 
		UWAGA: Zneutralizować HCl wodorotlenkiem sodu (10 M).</li>
		<li>Spłucz fragmenty trzy razy 100 ml wody destylowanej, za każdym razem 15 minut, ciągle mieszając. Osuszyć CMS bibułą filtracyjną (0,5 mm) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Użyj stereomikroskopu15, aby przeanalizować właściwości strukturalne CMS (wielkość porów, tworzenie porów i porowate połączenia) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego16, aby przeanalizować szorstką powierzchnię beleczek CMS (Rysunek 1C).</li>
		<li>Użyj przyrządu do rozwarstwiania do mieszania i rozciągania, aby ocenić zmiany mechaniczne (plastyczność i elastyczność) CMS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Zapakuj CMS do woreczka sterylizacyjnego i sterylizuj go plazmą nadtlenku wodoru przez 38 minut. Sterylny CMS należy przechowywać w oryginalnym opakowaniu w suchym miejscu w temperaturze 20-25 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie obszaru operacyjnego oraz obsługa i przygotowanie modelu zwierzęcego
<ol>
	<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny, stół roboczy, mikroskop mikrochirurgiczny i siedzenie 2% roztworem chlorheksydyny. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, gąbkę chirurgiczną, waciki i jednorazową serwetę chirurgiczną poprzez sterylizację termiczną (121 °C/30 min/100 kPa)</li>
	<li>Przypisz szczury (n = 5) do trzech grup po pięć szczurów w grupie: 1. pozorowane, 2. hepatektomia i 3. hepatektomia plus CMS i obserwuj wszystkie grupy w dniach 3, 14 i 21.
	<ol>
		<li>Ketaminę (35 mg/kg) i ksylazynę (2,5 mg/kg) podawać domięśniowo w kończynę tylną. 
		UWAGA: Okres uspokajania trwa zazwyczaj 30-40 minut.</li>
		<li>Ogolić skórę brzucha (5 cm x 2 cm) za pomocą mydła chirurgicznego i ostrza obosiecznego, a następnie zdezynfekować skórę za pomocą miejscowego 10% roztworu jodu powidonu w trzech rundach17.</li>
		<li>Umieść zwierzę na ciepłym talerzu w pozycji grzbietowej odleżyny, z nadmiernie wyprostowaną szyją, aby utrzymać przepuszczalne drogi oddechowe (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
		<li>Oceń głębokość znieczulenia poprzez wzorzec oddechowy i utratę odruchu wycofania w kończynach.</li>
		<li>Umieść jednorazową serwetkę chirurgiczną wokół ogolonej skóry i wykonaj nacięcie (2,5 cm) na linii alboowej za pomocą skalpela, używając wyrostka mieczykowatego jako punktu odniesienia. Omijaj naczynie krwionośne ściany brzucha, aby zapobiec krwawieniu.</li>
		<li>Umieść retraktor brzuszny na miejscu i obserwuj jamę brzuszną. Za pomocą kleszczy preparacyjnych wyciągnij lewy płat wątroby i umieść go na metalowej płytce (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
		UWAGA: W grupie pozorowanej należy usunąć tylko lewy płat wątroby, a następnie przywrócić wątrobę do jamy brzusznej. Zszyj ścianę brzucha i skórę nylonowym szwem 3-0.</li>
		<li>W grupach eksperymentalnych z CMS i bez CMS użyj ostrza skalpela i sterylnego ostrza skalpela (#15) do wykonania hepatektomii (około 40%) z dwoma cięciami. Użyj trójkątnego metalowego szablonu (1 cm x 1 cm x 1 cm) do wykonania hepatektomii (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Aby zapobiec krwawieniu z wątroby, utrzymuj ucisk chirurgiczny za pomocą wacika na krawędzi wątroby przez 5 minut.</li>
		<li>Nawilżaj CMS w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez 20 minut przed zabiegiem chirurgicznym. Wszczepić CMS w miejsce hepatektomii za pomocą czterech szwów szwów między tkanką wątroby a CMS, aby zapobiec przemieszczeniu biomateriału. Użyj niewchłanialnych szwów polipropylenowych 7-0 (<klasa mocna="xfig">Rysunek 3C). 
		UWAGA: Nie usuwaj szwów podczas drugiej operacji; szwy mogą być używane jako odniesienie do identyfikacji miejsca implantacji CMS.</li>
		<li>Wróć wątrobę do jamy brzusznej i zszyj ścianę brzucha i skórę nylonowym szwem 3-0. Oczyść nacięcie chirurgiczne gąbką chirurgiczną nasączoną jodem w dwóch rundach. Obserwuj i monitoruj parametry życiowe zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Megluminę fluniksynę (2,5 mg/kg) należy podawać domięśniowo w kończynę tylną. Podawać leki przeciwbólowe zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.</li>
	<li>W celu odzyskania znieczulenia należy umieścić zwierzęta w indywidualnych pudełkach z poliwęglanu z laboratoryjną ściółką dla zwierząt w miejscu wolnym od hałasu z regulacją temperatury (23 °C).</li>
	<li>Obserwuj powrót zwierząt do zdrowia i monitoruj ich spożycie wody i pokarmu przez 2 godziny. Monitoruj zwierzęta po operacji, zgodnie z zaleceniami instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.</li>
</ol>
4. Ocena czynności wątroby w surowicy
<ol>
	<li>Pobrać próbki krwi (500 μl) z bocznych żył ogonowych znieczulonych zwierząt przed zabiegiem chirurgicznym (wartości wyjściowe) oraz w 3, 14 i 21 dniu oceny.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi w temperaturze pokojowej (23 °C) w temperaturze 850 × g/10 min; oddzielić surowicę i przechowywać ją w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
	<li>Wykonaj panel testów czynnościowych wątroby: albumina surowicy (ALB), fosfataza alkaliczna (ALP), aminotransferaza alaninowa (ALT), aminotransferaza asparaginianowa (AST), bilirubina całkowita (TB) i bilirubina bezpośrednia (DB) (Tabela 1).</li>
</ol>
5. Eutanazja i zarządzanie tkankami
<ol>
	<li>Znieczulaj zwierzęta do każdej oceny (dni 3, 14 i 21), postępując zgodnie z protokołem opisanym powyżej.</li>
	<li>Eutanazja za pomocą metod zatwierdzonych przez instytucjonalny komitet ds. opieki i wykorzystywania zwierząt.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie (5-6 cm) na linii albou za pomocą skalpela, aby obserwować narządy jamy brzusznej i zrobić zdjęcia obszaru hepatektomii pozorowanej i grup eksperymentalnych, z CMS i bez niego.</li>
	<li>Pobrać próbki wątroby (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) od wszystkich zwierząt z grupy badanej i umieścić je w 4% roztworze formaldehydu na 24 godziny w celu późniejszej oceny histologicznej.</li>
</ol>
6. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Zachowaj tkanki wątroby w 4% formaldehydzie i odwodnij tkankę za pomocą serii stężeń alkoholu (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); umieść je w ksylenie (1h) i zanurz w parafinie16.</li>
	<li>Pokrój bloki parafiny za pomocą mikrotomu na sekcje o grubości 4 μm w celu przygotowania ośmiu szkiełek.</li>
	<li>Wykonaj barwienie trichromowe H&E i Massona 16.</li>
	<li>Obserwuj wybarwione skrawki pod mikroskopem świetlnym, aby wybrać reprezentatywne obszary wątroby, z CMS i bez niego. Uzyskaj mikrofotografie w powiększeniu 4x, 10x i 40x i przetwórz obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania18 (patrz Tabela Materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Li, N., Hua, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Immune cells in liver regeneration.</a> Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).</li>
<li>Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering.</a> Science. 260 (5110), 920-926 (1993).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Shafiee, A., Atla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Toward+a+new+era+of+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Toward a new era of medicine.</a> Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).</li>
<li>Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+derivatives+effectively+promotes+liver+regeneration+to+attenuate+acetaminophen-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).</li>
<li>Sancho-Bru, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+possibilities+of+stem+cells+in+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterologia+y+Hepatologia%22%5BJournal%5D)">Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases.</a> Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).</li>
<li>Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Identification%2C+phenotypic+characterization%2C+biological+properties+and+potential+for+regenerative+medicine+through+biomaterial+micro-engineering+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche.</a> Methods. 99, 62-68 (2016).</li>
<li>Freedman, B. R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+to+mimic+and+heal+connective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials to mimic and heal connective tissues.</a> Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+collagen+based+biomaterials+and+the+resulting+materials+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties.</a> Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).</li>
<li>El Baz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplant+of+hepatocytes%2C+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%2C+and+in+vitro+hepatocyte-differentiated+mesenchymal+stem+cells+in+a+chronic+lver+failure+experimental+model%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).</li>
<li>Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+multiple+osteogenic+differentiation+pathways+of+mesenchymal+stem+cells+through+different+scaffold+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).</li>
<li>Chan, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+collagen+scaffold+promotes+intrinsic+vascularisation+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications.</a> PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).</li>
<li>Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+for+whole+organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularization for whole organ bioengineering.</a> Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).</li>
<li>Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+decellularized+extracellular+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).</li>
<li>Gacek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+microscope%2C+neglected+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochemii%22%5BJournal%5D)">Stereo microscope, neglected tool.</a> Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).</li>
<li>Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+survivable+liver+biopsy+procedure+in+mice+to+assess+non-alcoholic+steatohepatitis+%28NASH%29+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).</li>
<li>The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Use+of+Chemical+Depilatory+Agents+on+Laboratory+Animals%22">Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://research.utexas.edu">https://research.utexas.edu</a> (2021).</li>
<li>Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+learning+in+neural+net+models+with+Poisson+and+Gauss+connectivities%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%22%5BJournal%5D)">The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities.</a> Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).</li>
<li>León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterization+of+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).</li>
<li>León, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematological+and+biochemical+parameters+in+Sprague+Dawley+laboratory+rats+breed+in+CENPALAB%2C+Cenp%3ASPRD%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Electronica+de+Veterinaria%22%5BJournal%5D)">Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD.</a> Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapies+for+liver+cirrhosis%3A+MSCs+as+%22conducting+cells%22+for+improvement+of+liver+fibrosis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Universidad+Nacional+Aut%C3%B3noma+de+M%C3%A9xico%22">Universidad Nacional Autónoma de México</a>. , Specialty of Urology thesis (2011).</li>
<li>Montalvo-Jave, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+bioprosthesis+for+the+treatment+of+bile+duct+injury+in+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model.</a> International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Benjamín León-Mancilla jest doktorantem w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) i otrzymał stypendium DGAPA-UNAM.

Przeszczepienie narządów jest podstawą leczenia pacjentów ze zwłóknieniem wątroby lub marskością wątroby. Kilku pacjentów odnosi korzyści z tej procedury, co sprawia, że konieczne jest zapewnienie alternatyw terapeutycznych dla pacjentów znajdujących się na liście oczekujących. Inżynieria tkankowa to obiecująca strategia, która wykorzystuje rusztowania i komórki o potencjale regeneracyjnym 2,4,13. Usunięcie części wątroby jest k...

Wątroba jest jednym z najważniejszych organów biorących udział w utrzymaniu homeostazy i produkcji białek1. Niestety, choroby wątroby są główną przyczyną zgonów na całym świecie. W zaawansowanych stadiach uszkodzenia wątroby, do których należy marskość wątroby i rak wątrobowokomórkowy, klinicznie zalecaną procedurą jest przeszczep wątroby. Jednak ze względu na niedobór dawców i niski odsetek udanych przeszczepów, opracowano nowe techniki w inżynierii tkankowej (TE) i medycynie regeneracyjnej (RM)2,3.
TE obejmuje wykorzystanie komórek macierzystych, rusztowań i czynników wzrostu4 w celu promowania odbudowy narządów i tkanek w stanie zapalnym, zwłóknieniu i obrzęku1,5,6. Biomateriały używane w rusztowaniach naśladują natywny ECM, dostarczając fizycznych, chemicznych i biologicznych wskazówek do kierowanej przebudowy komórkowej7. Kolagen jest jednym z najobficiej występujących białek pozyskiwanych ze skóry właściwej, ścięgien, jelit i osierdzia8,9. Ponadto kolagen można uzyskać jako biopolimer do produkcji dwu- i trójwymiarowych rusztowań poprzez biodruk lub elektroprzędzenie10,11. Ta grupa jest pierwszą, która poinformowała o zastosowaniu kolagenu ze źródła kostnego do regeneracji tkanki wątroby. Inne badanie donosi o użyciu rusztowań syntetyzowanych z kolagenu bydlęcego, który został uzyskany ze skóry, z jednorodnymi i ściśle położonymi porami, bez żadnej komunikacji między nimi12.
Decelularyzacja zachowuje natywny ECM, umożliwiając późniejsze włączenie komórek o potencjale komórek macierzystych13,14. Jednak ta procedura jest nadal w fazie eksperymentalnej w wątrobie, sercu, nerkach, jelicie cienkim i pęcherzu moczowym myszy, szczurów, królików, świń, owiec, bydła i koni3,14. Obecnie objętość wyciętej masy wątroby nie jest zastępowana w żadnym z modeli hepatektomii u zwierząt. Jednak zastosowanie dodatkowego wsparcia lub sieci (biomateriałów), które umożliwiają proliferację komórek i angiogenezę, może być niezbędne do szybkiego przywrócenia funkcji miąższu wątroby. W związku z tym rusztowania mogą być stosowane jako alternatywne podejścia do regeneracji lub naprawy tkanek w przewlekłych chorobach wątroby, co z kolei eliminuje ograniczenia wynikające z dawstwa i klinicznych powikłań przeszczepu wątroby.

<table><tbody><tr><td>Anionowy detergent</td><td>Alconox</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do biopsji</td><td>Leica</td><td>3802453</td><td></td></tr><tr><td>Camera DMX</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Glukonian chlorheksydyny 4%</td><td>BD</td><td>372412</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe 25 mm x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-224</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200-M</td><td>CAS 17372-87-1</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>CAS 64-17-5</td></tr><tr><td>Meglumid fluniksyny</td><td>MSD</td><td>Q-0273-035</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe 75 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>101081022</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Merck</td><td>H9627</td><td>CAS 571-28-2</td></tr><tr><td>Kwas solny 37%</td><td>Merck</td><td>339253</td><td>CAS 7647-01-0</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pisa agropecuaria</td><td>Q-7833-028</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td>Microphoto-FXA</td><td></td></tr><tr><td>Mikromikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>OPMI F170</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer żółta peleryna</td><td>Beckton Dickinson</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2125</td><td></td></tr><tr><td>Model zwierzęcia: szczury Wistar</td><td>Universidad Nacional Aut&oacute; noma de M&eacute; xico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon 3-0 (Dermalon)</td><td>Covidien</td><td>1750-41</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen 7-0</td><td>Atramat</td><td>SE867/2-60</td><td></td></tr><tr><td>Powidon-jod 10% roztwór skórny</td><td>Diafra SA de CV</td><td>1.37E+86</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>DSM-950</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki</td><td>J. T. Baker</td><td>3722-01</td><td>CAS 1310-73-2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ACT-1</td><td>Nikon</td><td>Ver 2.70</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>EZ4Stereo 8X-35X</td><td></td></tr><tr><td>Sterrad 100S</td><td>Johnson and Johnson</td><td>99970</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Synringe 1 ml z igłą (27G x 13 mm)</td><td>SensiMedical</td><td>LAN-078-077</td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkanek ( Histokinette)</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 (Urządzenie do zatapiania tkanek)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw bejc Trichrome</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15</td><td></td></tr><tr><td>Unicell DxC600 Analizator</td><td>Beckman Coulter</td><td>BC 200-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Pisa agropecuaria</td><td>Q-7833-099</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>CAS 1330-20-7</td></tr></tbody></table>

implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Choroby wątroby są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Nadmierne spożycie alkoholu, dieta wysokotłuszczowa i zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C sprzyjają zwłóknieniu, marskości wątroby i/lub rakowi wątrobowokomórkowemu. Przeszczep wątroby jest klinicznie zalecaną procedurą w celu poprawy i wydłużenia życia pacjentów w zaawansowanych stadiach choroby. Jednak tylko 10% przeszczepów kończy się sukcesem, a dostępność narządów, zabiegi przedoperacyjne i pooperacyjne oraz podwyższone koszty są bezpośrednio skorelowane z tym wynikiem. Rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) pojawiły się jako alternatywa dla odbudowy tkanek. Biokompatybilność i akceptacja przeszczepów to główne korzystne cechy tych biomateriałów. Chociaż zdolność do przywrócenia wielkości i prawidłowej funkcji wątroby została oceniona w modelach hepatektomii wątroby, nie oceniono zastosowania rusztowań lub pewnego rodzaju podparcia w celu zastąpienia objętości wygaszonej masy wątroby.
Częściowa hepatektomia została przeprowadzona w wątrobie szczura z ksenoimplantacją rusztowania macierzy kolagenowej (CMS) z kłykcia bydlęcego. Usunięto tkankę lewego płata wątroby (około 40%), a równą część CMS wszczepiono chirurgicznie. Oceniano wyniki testów czynnościowych wątroby przed i po zabiegu chirurgicznym. Po 3, 14 i 21 dniach zwierzęta poddano eutanazji i przeprowadzono oceny makroskopowe i histologiczne. W dniach 3 i 14 zaobserwowano tkankę tłuszczową otaczającą CMS, bez klinicznych dowodów na odrzucenie lub zakażenie, podobnie jak nowotwór naczynia i reabsorpcja CMS w dniu 21. Stwierdzono histologiczne dowody na nieistotny proces zapalny i migrację sąsiednich komórek do CMS, obserwowane za pomocą hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz barwienia trichromem Massona. Wykazano, że CMS dobrze sprawdza się w tkance wątroby i może być użyteczną alternatywą do badania regeneracji i naprawy tkanek w przewlekłych chorobach wątroby.

Demineralizacja kości wpływa na właściwości mechaniczne CMS, nie zmieniając pierwotnego kształtu ani wzajemnych połączeń jego porów. CMS może mieć dowolny kształt, a zatem może zostać dostosowany do rozmiaru i formy wybranego organu lub tkanki19. W niniejszym protokole zastosowano trójkątny CMS (Rycina 1A-D). Do oceny zdolności regeneracyjnej ksenoimplantu CMS w wątrobie wykorzystano model szczura. Pomimo że wątroba j...

Choroby wątroby są wywoływane przez wiele przyczyn, które sprzyjają zwłóknieniu lub marskości wątroby. Przeszczep to jedyna opcja na odzyskanie zdrowia. Biorąc jednak pod uwagę niedobór narządów nadających się do przeszczepu, należy zbadać alternatywne rozwiązania. Nasze badania proponują wszczepienie rusztowań kolagenowych w tkance wątroby z modelu zwierzęcego.

Implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Metoda ta polega na umieszczeniu implantu macierzy kolagenowej jako rusztowania w wątrobie w celu wspomagania regeneracji wątroby. Ta metoda implantacji otworzyła drzwi strategowi badającemu przywrócenie kształtu i balonu wyciętych tkanek, skracając w ten sposób znieczulenie, czas trwania operacji i czas rekonwalescencji. Metoda ta może być stosowana do wspomagania regeneracji z wykorzystaniem modeli zwłóknienia wątroby, a także innych gatunków ssaków.Metoda ta opiera się na inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej w celu wspomagania odbudowy uszkodzonej tkanki. Rozpocznij od odkażenia stołu roboczego obszaru operacyjnego, mikroskopu mikrochirurgicznego i siedziska 2% roztworem chlorheksydyny, a następnie nawodnij rusztowanie macierzy kolagenowej uzyskane z kłykcia bydlęcego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez 20 minut. Następnie, za pomocą mydła chirurgicznego i obosiecznego ostrza, ogol skórę brzucha znieczulonego sześcio- do ośmiotygodniowego samca szczura rasy Wistar, a następnie trzykrotnie zdezynfekuj skórę za pomocą 10% roztworu jodu powidonu.Umieść zwierzę na ciepłym talerzu w pozycji grzbietowej odleżyny z nadmiernie wyprostowaną szyją, aby utrzymać przepuszczalne drogi oddechowe. Oceń głębokość znieczulenia poprzez wzorzec oddechowy i utratę odruchu wycofania w kończynach. Następnie umieść jednorazową serwetę chirurgiczną wokół ogolonej skóry i używając wyrostka mieczykowatego jako punktu odniesienia, wykonaj 2,5-centymetrowe nacięcie na linii alpis za pomocą kleszczy preparacyjnych, uważając, aby ominąć naczynie krwionośne ściany brzucha, aby zapobiec krwawieniu.Po umieszczeniu retraktora brzusznego obserwuj jamę brzuszną. Za pomocą kleszczy preparacyjnych wyciągnij lewy płat wątroby i umieść go na metalowej płytce. Używając sterylnego trójkątnego metalowego szablonu jeden po drugim, wykonaj hepatektomię.Aby zapobiec krwawieniu z wątroby, utrzymuj chirurgiczny ucisk za pomocą wacika na krawędzi wątroby przez pięć minut. Następnie, za pomocą niewchłanialnych szwów polipropylenowych 7-O, wszczepić uwodnione rusztowanie macierzy kolagenowej w miejscu hepatektomii z czterema szwami między tkanką wątroby a rusztowaniem, aby zapobiec przemieszczeniu biomateriału. Wróć wątrobę do jamy brzusznej i zszyj ścianę brzucha i skórę nylonowym szwem 3-O.Oczyść nacięcie chirurgiczne dwukrotnie gąbką chirurgiczną nasączoną jodem i monitoruj parametry życiowe zwierzęcia. Następnie ułóż zwierzę w bocznej pozycji odleżynowej. Po podaniu środka przeciwbólowego umieść zwierzę w indywidualnym pudełku z poliwęglanu z legowiskiem dla zwierząt laboratoryjnych w miejscu wolnym od hałasu z kontrolą temperatury.Obserwuj rekonwalescencję po znieczuleniu i monitoruj spożycie wody i jedzenia przez dwie godziny. Nie stwierdzono różnicy w funkcjonowaniu wątroby między grupą SHAM a grupami eksperymentalnymi z rusztowaniem macierzy kolagenowej i bez niego po trzech, 14 i 21 dniach, co wskazuje, że rusztowanie macierzy kolagenowej nie zakłóca funkcji wątroby. Analiza histologiczna w trzecim dniu pokazuje, że obecność rusztowania macierzy kolagenowej w wątrobie nie sprzyjała reakcji na ciało obce i obserwuje się wyraźną obecność luźnej tkanki łącznej.W dniach 14 i 21 luźna tkanka łączna jest bardziej obfita w beleczki rusztowania macierzy kolagenowej otoczone hepatocytami, co sugeruje, że hepatocyty migrowały do rusztowania macierzy kolagenowej. Można zobaczyć obszary hepatocytów nawadniane przez naczynie, a hepatocyty przylegające do beleczków rusztowania macierzy kolagenowej są czasami otoczone luźną tkanką łączną. Podczas wykonywania hepatektomii należy stosować technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji, a następnie stosować ucisk, aby zapobiec krwawieniu z wątroby.Używaj również szwów 7-O do implantacji rusztowania macierzy kolagenowej, aby uniknąć rozerwania. Po wszczepieniu rusztowania macierzy kolagenowej w zwłókniały model zwierzęcy można ocenić zalety implantacji sinogennej dla regeneracji wątroby. Zastosowanie rusztowania macierzy kolagenowej w celu zastąpienia ekstubowanej masy wątroby nie było do tej pory oceniane.Te genogenne materiały torują drogę jako kolejna opcja terapeutyczna w dziedzinie przewlekłych chorób wątroby.

three-dimensional-collagen-matrix-scaffold-implantation-as-liver

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Inżynieria tkankowa często obejmuje ekspansję in vitro w celu stworzenia autoprzeszczepów do regeneracji tkanek. W tym badaniu opracowano metodę rozbudowy, regeneracji i rekonstrukcji tkanek in vivo w celu zminimalizowania przetwarzania komórek i materiałów biologicznych poza organizmem.

Tkanka mielona w skompresowanym kolagenie: bioprzeszczep zawierający komórki do jednoetapowej naprawy rekonstrukcyjnej

Innowacyjna technika biofabrykacji została opracowana w celu inżynierii trójwymiarowych konstrukcji, które przypominają cechy architektoniczne, komponenty i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Technika ta wykorzystuje nowo opracowany materiał protektorowy, kauczuk BSA, który przenosi szczegółowe cechy przestrzenne, odtwarzając architekturę in vivo szerokiej gamy tkanek.

Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Poznaj implantację rusztowania kolagenowego w wątrobę szczura w celu regeneracji tkanki wątrobowej. Ta metoda inżynierii tkankowej oferuje obiecującą alternatywę dla transplantacji w leczeniu chorób wątroby.

Implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby

Przeglądaj więcej filmów