Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa
30 czerwca 2021
Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.
Jest to pierwszy protokół wykazujący udaną koinfekcję dróg korowo-rdzeniowych u nowonarodzonych szczurów. Stanowi dokładny plan do zbadania, w jaki sposób poszczególne subpopulacje komórek u młodych ssaków przyczyniają się do powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego. Podobnie jak inne techniki podwójnego wektora wirusowego, metoda ta pozwala użytkownikowi na dokładną transdukcję określonych subpopulacji neuronów, co z kolei pozwala naukowcom zidentyfikować skuteczność różnych technik chemogenetycznych w promowaniu powrotu do zdrowia.
Spodziewalibyśmy się, że badacze, którzy nie są zaznajomieni z tą techniką, będą mieli trudności ze znalezieniem właściwej anatomii kręgosłupa. Dlatego zachęcamy do ciągłego liczenia segmentów kręgów i zawsze wracania do swoich punktów orientacyjnych. Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia u noworodka Sprague Dawley zidentyfikuj obszar, w którym zostanie wykonane nacięcie, naciskając kleszcze w linii środkowej na górze skóry głowy, wyczuwając szew strzałkowy.
Trzymając skórę napiętą, aby zapewnić czyste, proste i precyzyjne nacięcie, wykonaj jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż płaszczyzny szwu strzałkowego, zaczynając bezpośrednio nad linią I. Następnie zidentyfikuj bregmę, delikatnie badając kleszcze wzdłuż powierzchni czaszki, zwracając szczególną uwagę na linie szwów i wgłębienie spowodowane przez kleszcze biegnące wzdłuż kości ciemieniowej i czołowej. Utrzymuj otwór, stosując obciążone haki po stronie zainteresowania.
Oczyść rozcięgno za pomocą kombinacji bawełnianych końcówek i mikronożyczek, aby zmaksymalizować ekspozycję rozcięgna w celu zwiększenia dokładności. Upewnij się, że szew koronalny jest dobrze widoczny wystarczająco daleko z boku, aby zapewnić szorstki szablon do kolejnych wstrzyknięć. Za pomocą mikronożyczek wytnij około trzyxdwumilimetrowy fragment lewej przedniej kości czaszki bezpośrednio przylegającej do bregmy.
Usuń wszelkie zanieczyszczenia, płyn mózgowo-rdzeniowy i krew za pomocą bawełnianych końcówek. Aby wstrzyknąć wirusa, umieść igłę na miejscu i zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał jeden mikrolitr z szybkością 250 nanolitrów na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę na odpoczynek w korze mózgowej na trzy minuty.
Powtórz iniekcje na pozostałych współrzędnych, w sumie trzy wstrzyknięcia wzdłuż kory mózgowej w stosunku do bregmy, wszystkie na głębokości 0,6 milimetra. Po zakończeniu iniekcji należy zszyć skórę głowy i przenieść zwierzę na drugi stół operacyjny w celu laminektomii szyjki macicy. Zbadaj palpacyjnie podstawę czaszki palcami, aby zidentyfikować miejsce nacięcia.
Utrzymuj napiętą skórę, napinając kciukiem i palcem wskazującym. Używając ostrza numer 11, rozpocznij nacięcie na linii środkowej od jednego do dwóch milimetrów za podstawą czaszki i przedłuż nacięcie o jeden centymetr do tyłu, aby odsłonić mięsień powierzchowny. Używając ostrego czubka ostrza, delikatnie wykonaj serię nacięć wzdłuż linii środkowej mięśnia powierzchownego, aby odsłonić jamę rdzeniową i głębokie mięśnie kręgosłupa.
Następnie użyj kleszczy, aby rozłożyć mięsień i uwidocznić okno operacyjne. Po odsłonięciu głębokich mięśni kręgosłupa włóż retraktory do okna operacyjnego i cofnij okno operacyjne do szerokości od siedmiu do ośmiu milimetrów, umożliwiając niezakłócony widok kręgosłupa. Zidentyfikuj drugi kręg szyjny po jego wydatnym wyrostku kolczystym, który wystaje grzbietowo i otacza duży mięsień w kształcie kopuły.
Używając płaskiej krawędzi skrobaka do kości, delikatnie zeskrob głęboki mięsień rdzeniowy na boki, aby odsłonić kręgi od C3 do C7. Zacznij przyśrodkowo i skrob bocznie wzdłuż kierunku równoległego do blaszek kręgowych, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję, umożliwiając wyraźne rozróżnienie blaszek kręgowych. Zatamuj krwawienie za pomocą bawełnianych końcówek.
Używając C2 jako przewodnika podczas liczenia poziomów kręgów, ostrożnie przytnij boczne krawędzie blaszek chrzęstnych w C6 i C7 za pomocą pary mikronożyczek. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie usuń wypreparowaną część blaszki, aby odsłonić rdzeń kręgowy, upewniając się, że okno kręgosłupa jest wystarczająco duże, aby pomieścić pożądane miejsce wstrzyknięcia. Umieść zwierzę w stereotaktycznym uchwycie czaszkowym i umieść zwinięty kawałek gazy pod tułowiem zwierzęcia, aby podnieść jego tylne ćwiartki.
Przed rozpoczęciem wstrzykiwań należy oczyścić okno rdzeniowe z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, delikatnie nakładając bawełniane końcówki i trójkąty Sugi na ten obszar, uważając, aby nie urazić rdzenia kręgowego. Ponadto należy utworzyć barierę na obwodzie okna, umieszczając mały kawałek wchłanialnej bawełny w bocznych częściach okna kręgosłupa, aby zapobiec niedrożności miejsca wstrzyknięcia przez ciągłe krwawienie lub wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego. W przypadku bezpośrednich wstrzyknięć do rdzenia kręgowego należy użyć końcówki szklanej igły do wstrzykiwań, aby przybliżyć linię środkową rdzenia kręgowego poprzez identyfikację tętnicy kręgowej.
Następnie umieść igłę tuż za blaszką C5 na przybliżonej linii środkowej i użyj jej jako punktu odniesienia. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, przesuń igłę w bok w prawo o 0,3 milimetra i opuść igłę, aż dotknie powierzchni rdzenia kręgowego. Z tej głębokości zanurz igłę.
0,6 milimetra do rdzenia kręgowego. Wstrzyknąć jeden mikrolitr wirusa związanego z retro adeno, dwa zawierające gen rekombinazy Cre w ilości 250 nanolitrów na minutę. Następnie odczekaj dwie minuty, aż wirus dyfunduje do rdzenia kręgowego, zanim powoli wycofasz igłę.
Pokazano tutaj znakowanie neuronów warstwy piątej dróg korowo-rdzeniowych w korze ruchowej odcinka koronalnego mózgu wyrażającego DREADDs zależne od Cre mCherry wstrzyknięte jednocześnie z przeciwległym wstrzyknięciem do kręgosłupa retro Cre. Możliwość celowania w określone populacje neuronów pomoże określić niuanse napędzające powrót do zdrowia i zapewni większą dokładność w leczeniu podstawowego urazu rdzenia kręgowego w rozwijającym się układzie nerwowym. Ta metoda utorowała nam drogę do zbadania opłacalności stosowania pobudzających DREADD jako środka do leczenia urazów rdzenia kręgowego u młodych szczurów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje nową metodę stosowania terapii genowych w specyficznych subpopulacjach neuronów u noworodków szczurów z wykorzystaniem modyfikatorów chemogenetycznych. Badanie analizuje wkład tych neuronów w rekonwalescencję po urazie rdzenia kręgowego, dostarczając informacji na temat skuteczności różnych technik w promowaniu powrotu do sprawności w rozwijającym się układzie nerwowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurobiologia
- Terapia genowa
Wstęp
- Badanie roli subpopulacji neuronów w procesie regeneracji po urazie rdzenia kręgowego.
- Skupienie na modelach noworodkowych szczurów w celu zrozumienia neuronauki rozwojowej.
- Szczegółowy opis techniki podwójnego wektora wirusowego do celowanej transdukcji neuronów.
Cel badania
- Opracowanie metody terapii genowej celowanej w konkretne populacje neuronalne.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów napędzających regenerację po urazach rdzenia kręgowego.
- Rozwiązanie problemów związanych z precyzyjną lokalizacją anatomii rdzenia kręgowego podczas procedury.
Zastosowane metody
- W badaniu tym zastosowano procedury chirurgiczne obejmujące wstrzyknięcia wektorów wirusowych do kory mózgowiej i rdzenia kręgowego.
- Noworodki szczurów rasy Sprague Dawley służą jako model biologiczny do testowania terapii genowych.
- Przedstawiono instrukcje krok po kroku dotyczące wstrzykiwania wektorów wirusowych do drogi korowo-rdzeniowej.
- Kluczowe etapy obejmują identyfikację punktów orientacyjnych anatomii oraz precyzyjne techniki chirurgiczne.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne celowanie i transdukcję subpopulacji neuronów na potrzeby badawcze.
- Wyniki wspierają zastosowanie pobudzających DREADD w celu wspomagania regeneracji po urazie rdzenia kręgowego.
- Podkreślono znaczenie precyzyjnej manipulacji anatomicznej oraz metodologii wstrzykiwania dla uzyskania skutecznych rezultatów.
Wnioski
- Ta innowacyjna technika umożliwia precyzyjne celowanie w populacje neuronalne, co jest kluczowe dla badania mechanizmów regeneracji.
- Istotne znaczenie dla zastosowań terapeutycznych w obszarze regeneracji neurologicznej oraz leczenia przyczynowych urazów.
- Wspiera rozwój metodologii w badaniach nad neurobiologią rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne celowanie w neurony drogi korowo-rdzeniowej u noworodków szczurów, wypełniając istotną lukę w modelowaniu regeneracji po urazach rdzenia kręgowego u dzieci. Dzięki połączeniu retrogradnych wektorów wirusowych z aktywatorami chemogenetycznymi, metoda ta wspiera mechanistyczną weryfikację strategii neuroterapeutycznych w rozwijających się układach nerwowych. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów dla ścieżek naprawczych ośrodkowego układu nerwowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych subpopulacji neuronów w drogach korowo-rdzeniowych w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną metodę koinfekcji celów w mózgu i rdzeniu kręgowym, pozwalającą na wyizolowanie przyczynowych wkładów neuronalnych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych odczytów aktywacji neuronów poprzez chemogenetyczną modulację za pomocą DREADD.
- Wartość operacyjna: Tworzy zestandaryzowaną platformę do przesiewowego badania związków chemogenetycznych w obwodach noworodkowych istotnych dla przebiegu chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne dla przebiegu choroby w przypadku urazu szyjnego rdzenia kręgowego u niedojrzałych ssaków.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ocenę mechanizmów regeneracji zgodną z markerami biologicznymi poprzez manipulację specyficzną dla danego typu komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając walidację celu przed identyfikacją związku wiodącego w opracowywaniu neuroterapiów.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji neuronów korowo-rdzeniowych w paradygmatach regeneracji po urazie.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, komórkowo-specyficznych wyników do oceny skuteczności efektorów chemogenetycznych.
- Analityka: Zapewnia mierzalne zmienne zależne, takie jak ekspresja mCherry i wskaźniki powrotu funkcji behawioralnych.
- Badania translacyjne: Łączy neonatalne celowanie w drogi korowo-rdzeniowe z ciągłością przedkliniczną w modelach urazów rdzenia kręgowego.
- Zastosowania szerokie: Oferuje reużywalną platformę chirurgiczno-wirusową do badania innych zstępujących dróg ruchowych w modelach rozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w zakresie udziału obwodów neuronalnych w regeneracji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację dwumiejscowego dostarczania wirusów pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez walidację zaangażowania celu przed inwestycją w związki chemiczne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów naprawy OUN skorygowaną o ryzyko, w oparciu o specyficzność podtypów neuronalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w stereotaksycznym operowaniu noworodków gryzoni oraz w technikach mikrochirurgicznych.
- Zależne od precyzyjnego instrumentarium do wewnątrzczaszkowego i wewnątrzrdzeniowego podawania wirusów.
- Wymaga standaryzacji weryfikacji miana wirusa oraz współrzędnych wstrzykiwania pomiędzy zespołami.
- Uwzględnia konieczność adaptacji do różnych serotypów wirusowych i konstruktów promotorowych.
- Ograniczone wyzwaniami technicznymi związanymi z zachowaniem dokładności anatomicznej u małych osobników noworodkowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:00
Performing the Craniotomy and Exposing the Somatomotor Cortex
2:21
Injecting Virus into the Somatomotor Cortex
3:00
Creating a Spinal Window for Precise Spinal Cord Injections
5:31
Direct Injections into the Spinal Cord Targeting Axon Terminals
6:33
Results: Transduction of Neurons in the Motor Cortex
6:52
Conclusion
