Name: Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę inżynierii tkanki łącznej z fibroblastów ludzkich pod zdefiniowanymi warunkami mechanicznymi. Protokół umożliwia równoległe testowanie do 48 warunków w badaniach przesiewowych leków przeciwzwłóknieniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemieckie Towarzystwo Kardiologiczne (DGK Research Fellowship for GLS) oraz przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG poprzez projekt IRTG 1816 for GLS and AD; DFG 417880571 i DFG TI 956/1-1 dla MT; SFB 1002 TP C04 dla MT i WHZ; SFB 1002 TP S01 dla WHZ; i EXC 2067/1-390729940J dla WHZ). WHZ jest wspierany przez niemieckie Federalne Ministerstwo Nauki i Edukacji (BMBF w ramach projektu IndiHEART) oraz Fundację Leducq (20CVD04). MT, WHZ i SL są wspierane przez Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK).

GLS i SL sporządziły projekt manuskryptu. Wszyscy autorzy przyczynili się do opracowania protokołu i zredagowali manuskrypt. TM, MT i WHZ są doradcami naukowymi myriamed GmbH. WHZ jest założycielem i udziałowcem myriamed GmbH.

Prezentowany protokół opisuje wytwarzanie elektrowstrząsów z pierwotnego mukowiscydozy człowieka, co pozwala na badanie mechanicznego wpływu tych komórek na środowisko ich macierzy zewnątrzkomórkowej i odwrotnie.
Fibroblasty muszą zostać rozprężone, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do planowanych eksperymentów ECT (0,75 x 106 komórek/ECT). W celu uzyskania najlepszej odtwarzalności zaleca się wstępną hodowlę fibroblastów zamrożonych lub pochodzących z tkanek w jednowarstwowej...

Główną przeszkodą w badaniu chorób zwłóknieniowych jest brak reprezentatywnych modeli 3D tkanek ludzkich, które dostarczają wglądu w zachowanie fibroblastów i ich patologicznych pochodnych. Aby badać procesy zwłóknieniowe, standardowe systemy hodowli 2D są nieoptymalne, ponieważ izolowane fibroblasty szybko różnicują się w miofibroblasty wykazujące ekspresję aktyny α mięśni gładkich (SMA), gdy są hodowane na niezgodnych substratach 2D1,2,3. Tak więc fibroblasty w standardowej hodowli 2D nie odzwierciedlają regularnego "zdrowego" fenotypu tkanki3,4,5,6. Hodowle na giętkich podłożach zostały wprowadzone w celu symulacji środowisk tkanek niezwłóknistych (10 kPa) i zwłóknieniowych (35 kPa)7, ale brakuje im trzeciego wymiaru, który jest bardzo ważny w odniesieniu do patofizjologii. Inżynieria tkankowa daje możliwość przezwyciężenia tego ograniczenia, umożliwiając hodowlę fibroblastów w zdefiniowanym i eksperymentalnie przestrajalnym kontekście macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), na przykład poprzez zmiany w komórkowości, składzie ECM i stężeniu ECM, z których wszystkie mogą determinować biomechanikę tkanki.
Różne modele 3D zostały wygenerowane przy użyciu fibroblastów. Pływające dyski i mikrosfery były jednymi z pierwszych i pokazują, że kolagen jest przebudowywany i zagęszczany w sposób zależny od czasu. Fibroblasty wywierają siły trakcyjne na włókienka kolagenowe, proces ten można ułatwić poprzez dodanie czynników pro-fibrotycznych, takich jak transformujący czynnik wzrostu-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Jednak swobodnie pływające kultury nie pozwalają na kontrolowane obciążenie zewnętrzne i dlatego stanowią modele stale kurczące się lub zagęszczające. Tkanki inżynieryjne przypominające arkusze otworzyły możliwość badania homeostatycznej regulacji właściwości biomechanicznych tkanek, a mianowicie poprzez jedno-, dwu-, wieloosiowe lub cykliczne testowanie szczepów17,18,19,20. Modele te zostały wykorzystane m.in. do wykazania wpływu liczby komórek na sztywność tkanki, która okazała się pozytywnie korelować z integralnością cytoszkieletu i kurczliwością cytoszkieletu aktomiozyny18,19. Należy jednak pamiętać, że konwersja siły na odkształcenie jest skomplikowana przez nierównomierne odkształcenie tkanki wokół punktów zacisku przetworników siły i punktów kotwiczenia. To nieodłączne ograniczenie można ominąć za pomocą tkanek w kształcie psiej kości lub pierścienia, oferując pewne wzmocnienie tkanek w punktach kotwiczenia21,22,23. Tkanki w kształcie pierścienia można przygotować, rozprowadzając hydrożel kolagenu komórkowego w foremkach w kształcie pierścienia. Gdy hydrożel zagęszcza się, wokół nieściśliwego wewnętrznego pręta formy tworzy się tkanka, która zapewnia opór dla dalszego kurczenia się tkanki24,25,26,27. Po początkowym i zazwyczaj maksymalnym zagęszczeniu, tkanki mogą być również przenoszone do regulowanych przekładek, aby jeszcze bardziej ograniczyć okrężny ECT na określonej długości tkanki3,24,25,26,27,28,29,30. Właściwości biofizyczne można oceniać w standardowych poziomych lub pionowych urządzeniach do odkształcania i naprężeń z odpowiednimi czujnikami wagowymi w ramach jednokierunkowego lub dynamicznego odkształcenia3. Ponieważ tkanki mają w dużej mierze jednolitą strukturę kołową i mogą być utrzymywane na prętach/hakach (punktach kotwiczenia i/lub przetwornikach siły), chociaż mogą one nadal otaczać obszary kompresji wokół prętów obciążających, ten format pozwala na bardziej jednolitą zmienność odkształcenia w porównaniu do zaciskania3. Co więcej, zakotwiczone tkanki wywołują dwubiegunowy kształt komórki, a komórki dostosowują się do sił tkankowych poprzez wydłużanie wzdłuż linii sił sprzyjających trakcji anizotropowej31,32,33,34,35,36. Wcześniej zastosowaliśmy elektrowstrząsy w kształcie pierścienia z fibroblastów serca (CF) szczurów i ludzi wokół pojedynczego sztywnego bieguna w eksperymentach funkcjonalnych ze szczepem stresu i przeprowadziliśmy badania nad zyskiem i utratą funkcji przy użyciu fibroblastów transdukowanych wirusem24,25,26 i badania farmakologiczne37. Co więcej, udało nam się zidentyfikować różnice płci w zwłóknieniu wywołanym przez mukowiscydozę w modelu ECT27.
Poniższy protokół generowania ludzkiego ECT, zilustrowany pierwotnym ludzkim CF uzyskanym jako kriokonserwowany CF od komercyjnych dostawców (zobacz Tabelę Materiałów), łączy zalety tkanek w kształcie pierścienia z łatwym i szybkim sposobem wytwarzania makroskopowych tkanek dla 48-dołkowej platformy przeznaczonej do równoległych testów o wysokiej zawartości.
Co ważne, model ECT nie jest ograniczony do konkretnego typu fibroblastów, z udokumentowanym zastosowaniem w badaniu innych fibroblastów, np. fibroblastów skóry38,39. Co więcej, fibroblasty z biopsji pacjenta działają równie dobrze, a wybór fibroblastów ostatecznie zależy od pytania naukowego, którym należy się zająć.
Platforma używana do generowania ECT opisana w tym protokole to dostępna na rynku 48-dołkowa płytka do hodowli komórek/tkanek 3D (Rysunek 1A). Opisano metody przygotowania, hodowli i monitorowania powstawania i funkcjonowania ECT przy określonej geometrii i obciążeniu mechanicznym za pomocą płytki 48-dołkowej. Uformowane ECT są utrzymywane przez zintegrowane elastyczne tyczki, a obciążenie mechaniczne można precyzyjnie dostroić zgodnie z ostatecznym przeznaczeniem za pomocą tyczek o różnej twardości (wartość Shore A 36-89), co wpływa na ich sztywność zginania. Zalecane są słupy o wartości A w skali Shore'a 46. Protokół jest ponadto kompatybilny z wcześniej opisaną niestandardową okrągłą formą, w której ECT jest utrzymywany wokół pojedynczego sztywnego pręta37. Wymiary tej formy podane są w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie form odlewniczych. (A) Rysunek techniczny i wymiary formy odlewniczej z dwoma elastycznymi biegunami. Forma składa się z wewnętrznego obwodu ograniczonego krótką ścianką, na której znajdują się podwójne słupki mocujące przy głównym korpusie formy. Elastyczne słupy mają swobodną odległość poziomą od siebie i są połączone u podstawy. Forma pozwala na uzyskanie objętości odlewu 180 μL. Studzienka każdej formy pozwala na objętość co najmniej 600 μl pożywki hodowlanej. Do produkcji słupów o określonej sztywności można stosować różne składy materiałowe (np. TM5MED-TM9MED). (B) Rysunek techniczny i wymiary pierścieniowej formy z pojedynczym sztywnym prętem. Jest to alternatywna forma o odrębnej geometrii i środowisku mechanicznym, która może być używana z protokołem odlewania ECT37. Metoda montażu formy w kształcie pierścienia została zaadaptowana z opublikowanych większych formatów28,41. Krótko mówiąc, metoda obejmuje (1) odciśnięcie przekładek formujących z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica 8 mm) w polidimetylosiloksanie (PDMS, silikon) wlanych do szklanych naczyń (średnica 60 mm) oraz (2) zamocowanie uchwytu tyczki PDMS (średnica 1,5 mm) koncentrycznie wewnątrz uformowanej pustej wnęki, która służy do (3) przytrzymania zdejmowanego drążka (rurka silikonowa o średnicy 4 mm). Powstała pusta przestrzeń pozwala na uzyskanie 180 μl objętości odlewu. Każde szklane naczynie może pomieścić wiele drukowanych form (przykładowo pokazanych z 5 formami) i ma pojemność do 5 ml pożywki hodowlanej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Roztwór Accutase Merk</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik dysocjacyjny &ndash; TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w proszku, o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>12100061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), pH 7,2, -Ca2+, -Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 Pożywka do wzrostu fibroblastów-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>FBM&nbsp; Fibroblast Growth Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&nbsp; Suplementy i czynniki wzrostu</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa fibroblastów 3 ZESTAW</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Basal Medium 3</td><td>PromoCell</td><td>C-23230</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa 3 Pakiet suplementów</td><td>PromoCell</td><td>C-39350</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (10000 U/ml)/ Streptomycyna (10000 &mu; L / ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Źródła komórek:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalne ludzkie fibroblasty serca z komory (NHCF-V)</td><td>Lonza</td><td>CC-2904</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty serca (HCF-c)</td><td>PromoCell</td><td>C-12375</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty serca ( HCF-p)</td> <td>PromoCell</td><td>C-12377</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie fibroblasty napletka-1 (HFF-1)</td> <td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>Zasoby kolagenu:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kolagen typu I (bydlęcy) w 0,01 M HCl</td><td>LLC Collagen Solutions</td><td>FS22024</td><td>6-7 mg / ml</td></tr><tr><td>Kolagen typu I (ogon szczura) w 0,02 M HCl</td><td>Corning</td><td>354236</td> <td>~ 4 mg / ml</td></tr><tr><td>Leki:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin-A (Lat-A)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Wyroby z tworzyw sztucznych:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyroby z tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt i Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatkowy sitko komórkowe (nylon, wielkość porów 40 i mu; m)</td> <td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>myrPlate-uniform</td><td>myriamed GmbH</td><td>TM5 med</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne o szerokim otworze, sterylne (10 mL)</td><td>Corning</td><td>07-200-619</td><td></td></tr><tr><td>Specyficzne instrumenty:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bi-telecentryczna soczewka CORE do detektorów 1/2&Prime;</td><td>OptoEngineering</td><td>TCCR12096</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do skanowania obszaru Basler ace acA4024</td><td>Basler</td><td>107404</td><td></td></tr></tbody></table>

tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasty to fenotypowo dynamiczne komórki, które szybko różnicują się w miofibroblasty w odpowiedzi na bodźce biochemiczne i biomechaniczne. Obecna wiedza na temat procesów zwłóknieniowych, w tym zwłóknienia serca, pozostaje słaba, co utrudnia rozwój nowych terapii przeciwfibrotycznych. Kontrolowane i niezawodne systemy modelowania człowieka mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patologii zwłóknienia. Jest to wysoce powtarzalny i skalowalny protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych (ECT) w 48-dołkowej płytce odlewniczej, aby ułatwić badania fibroblastów i patofizjologii tkanki zwłóknieniowej w środowisku trójwymiarowym (3D). Elektrowstrząsy są generowane wokół biegunów ze sztywnością przestrajaną, co pozwala na badania pod określonym obciążeniem biomechanicznym. W określonych warunkach obciążenia można badać adaptacje fenotypowe kontrolowane przez interakcje komórka-macierz. Równoległe testowanie jest możliwe w formacie 48-dołkowym z możliwością analizy przebiegu w czasie wielu parametrów, takich jak zagęszczenie tkanek i kurczenie się w stosunku do obciążenia. Na podstawie tych parametrów można badać właściwości biomechaniczne, takie jak sztywność i elastyczność tkanki.

ECT osiąga około 95% zagęszczenia w porównaniu do początkowej objętości hydrożelu komórkowego kolagenu w ciągu pierwszych 24 godzin. Zagęszczenie i kurczenie się tkanek w warunkach kontrolnych i w obecności FCS następuje kilka godzin po odlaniu i znacznie wzrasta do 5 dnia (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A). Ugięcie tyczki może się jeszcze zwiększyć w ciągu kolejnych 15 dni (najdłuższy czas testowany był przez 20 dni). Wielkość ugięcia bieguna zależy od typu komórki, stanu komórki oraz warunków hodowli komórek i tkanek. Za...

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Protokół ten pozwala fibroblastom budować i organizować własne środowisko w określonych warunkach mechanicznych. W ten sposób powstają tkanki anizotropowe o sztywności i składzie matrycy porównywalnym z naturalnym środowiskiem komórki. Metoda ta pozwala na równoległe porównanie do 48 warunków.Jest elastyczny w odniesieniu do zastosowanego typu komórki i warunków hodowli. Dzięki zastosowaniu tylko kilku dobrze zdefiniowanych komponentów, jest on odtwarzalny między laboratoriami. Stosując czynniki profibrotyczne lub leki przeciwzwłóknieniowe, protokół ten może być wykorzystany do badania procesów leżących u podstaw chorób zwłóknieniowych dowolnego rodzaju.Procedurę zademonstruje Alisa Degrave, doktorantka z naszego laboratorium, oraz ja. Na początek rozmrozić kriokonserwowane fibroblasty serca w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około dwie minuty, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową kroplami za pomocą dwumililitrowej pipety serologicznej do odpowiedniej sterylnej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów pożywki wzrostowej fibroblastów.Aby uzyskać optymalne pobranie komórek, przepłucz kriofiolkę jednym mililitrem FGM i przenieś ją do probówki wirówkowej. Delikatnie zawiesić komórki i przenieść do kolby do hodowli komórkowych. Uzupełniaj FGM co drugi dzień przez pięć dni lub do momentu, gdy komórki osiągną 80% konfluencji.Po zaessaniu pożywki z hodowanych komórek, umyj komórki sześcioma mililitrami PBS i aspiruj, a następnie dodaj sześć mililitrów odczynnika do dysocjacji komórek do komórek i inkubuj, aż widoczne będzie oderwanie komórki. Zneutralizuj aktywność enzymatyczną, dodając od sześciu do 12 mililitrów FGM do usuniętych komórek w odczynniku asocjacyjnym komórek. Delikatnie pipetować w górę i w dół cztery do ośmiu razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby zapewnić zawiesinę pojedynczych komórek i przenieść komórki do świeżej 50-mililitrowej probówki zbiorczej.Sprawdź wydajność za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta i zdeponuj ogniwa. Po odwirowaniu odessać supernatant, przesunąć probówkę, aby usunąć osad i ponownie zawiesić komórki w FGM. Następnie przecedź zawiesinę komórek przez sitko o siatkowej siatce 40 mikrometrów, a następnie za pomocą automatycznego licznika komórek oceń liczbę komórek i żywotność poprzez wykluczenie prądu elektrycznego, aby zapewnić wiarygodną liczbę komórek przed przystąpieniem do zmodyfikowanych tkanek łącznych lub przygotowania ECT.Aby przygotować się do ECT, dostosuj zawiesinę komórek do 8,9 miliona komórek na mililitr w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, dodając FGM i utrzymuj komórki na lodzie. Przenieść wszystkie pozostałe probówki zawierające poszczególne składniki mieszaniny hydrożelu ECT na lód i wstępnie schłodzić pustą 50-mililitrową probówkę wirówkową w celu przygotowania mieszaniny. Przygotowanie mieszaniny hydrożelowej ECT należy rozpocząć od dodania składników opisanych w tekście do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.Najpierw odpipetuj rozpuszczalny w kwasach hydrożel kolagenu typu I do pipety serologicznej z końcówką o szerokim otworze. Dostosuj zawartość soli w roztworze kolagenu, dodając DMEM, delikatnie obracając probówkę w celu prawidłowego wymieszania. Aby zneutralizować pH, dodaj 0,2 molowego wodorotlenku sodu podczas wirowania probówki i potwierdź neutralizację, obserwując czerwony kolor czerwonego wskaźnika fenolu.Następnie dodaj zawiesinę komórkową kroplami, delikatnie obracając probówkę. Wymieszaj zawiesinę, delikatnie przesuwając rurki w górę i w dół tylko raz, używając pipety serologicznej z końcówką o szerokim otworze, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i zminimalizować naprężenia ścinające. Delikatnie zakręć tubką 10 razy, aby dokładnie wymieszać.Probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę hydrożelu ECT należy przechowywać na lodzie przez cały proces odlewania. Zwilż jednomililitrową końcówkę pipety w mieszaninie hydrożelu ECT, a następnie równomiernie rozprowadź 180 mikrolitrów mieszaniny hydrożelu w każdej formie 48-dołkowej płytki odlewniczej, unikając nadmiernych sił ścinających, które mogą wpływać na integralność zespołu matrycy kolagenowej i zapewniając, że cała płytka zakończy się w ciągu 15 do 20 minut. Upewnij się, że w formie tworzy się pełna pętla, ponieważ nieciągły rozkład mieszaniny ECT zapobiegnie całkowitemu tworzeniu się pierścienia ECT.Należy unikać pipetowania do studzienki wewnętrznej i tworzenia pęcherzyków podczas pipetowania, aby zapewnić równomierne odlewanie hydrożelu ECT w celu tworzenia jednorodnych i funkcjonalnych tkanek. Ostrożnie umieścić 48-dołkową płytkę odlewniczą w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby rozpuścić mieszaninę hydrożelu ECT przez 15 do 30 minut. Po inkubacji wydaje się żelowy i nieprzezroczysty.Delikatnie dodaj 600 mikrolitrów ciepłego FGM o temperaturze 37 stopni Celsjusza na studzienkę wzdłuż ściany, aby uniknąć oderwania ECT od dna. Codziennie zastępuj pożywkę 500 mikrolitrami FGM do czasu analizy. W żądanych punktach czasowych użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zarejestrować obrazy mikroskopowe widoków z góry i z boku ECT.Użyj programu do przetwarzania obrazu, aby przeprowadzić analizę skanowania liniowego. Ustaw skalę i użyj narzędzia linii prostej, aby śledzić i mierzyć średnice ECT w co najmniej sześciu pozycjach na ramię w każdej płaszczyźnie obrazowania. Zobrazuj 48-dołkową płytkę odlewaną pod urządzeniem rejestrującym ze zintegrowaną kamerą skanującą obszar umieszczoną w stałej odległości, wyposażoną w monochromatyczny czujnik obrazu o wysokiej rozdzielczości i źródło światła bliskiego UV.Wykonaj automatyczne wykrywanie końcówek tyczek zawierających barwnik fluorescencyjny w celu maksymalizacji kontrastu. Zmierz odległość między biegunami od dziennych zapisów za pomocą automatycznej analizy, uruchamiając zarejestrowane obrazy w oprogramowaniu do wykrywania jasnych pikseli o wysokim kontraście na ciemnym tle lub w programie do przetwarzania obrazu. Zdejmij ECT z drążków mocujących i włóż hak przenoszący i pętlę ECT.Następnie przenieś ECT na dwa haki zaciśnięte na nieruchomym ramieniu i ramieniu przetwornika przedłużającego dynamicznego mechanicznego riometru wyposażonego w wannę narządową o temperaturze 37 stopni Celsjusza wypełnioną PBS. Zastosuj naprężenie jednoosiowe ze stałą szybkością liniową, ustawiając riometr na około 1% początkowej odległości między hakami na sekundę. Przy typowych wymiarach ECT można zastosować stałą szybkość rozciągania wynoszącą 0,03 milimetra na sekundę.Rozerwij siłę przetwornika i rozpocznij rozciąganie. Kontynuuj nagrywanie do punktu pęknięcia ECT po znormalizowaniu zmierzonej siły przez pole przekroju poprzecznego i wykreśl krzywą naprężenie-odkształcenie, określając różne parametry biomechaniczne. Tuż przed rozpoczęciem mikroszczelinowania tkanki górna granica obszaru elastycznego odpowiada granicy plastyczności, a jego odkształcenie jest miarą elastyczności tkanki.Obszar tworzywa sztucznego znajduje się pomiędzy granicą plastyczności a granicą uszkodzenia. Punkt uszkodzenia odpowiada nagłemu spadkowi naprężeń spowodowanemu pęknięciem tkanki, definiując ostateczne odkształcenie, które jest miarą rozciągliwości tkanki. Trzeci punkt pomiarowy odpowiada maksymalnej wytrzymałości określonej przez największe naprężenie, jakie tkanka może wytrzymać bez pękania podczas rozciągania.Sprężystość i wytrzymałość nadana przez obszar pod krzywą odpowiada energii pochłoniętej przez tkankę odpowiednio do granicy plastyczności i punktu uszkodzenia. Dla każdej uzyskanej krzywej nachylenie części liniowej obszaru sprężystego odpowiada modułowi Younga, znanemu również jako moduł sprężystości. Jest to właściwość mechaniczna, która mierzy sztywność tkanki.Korzystając z tego protokołu, zagęszczenie i kurczenie się ECT w warunkach kontrolnych i w obecności FCS następowało kilka godzin po odlewaniu i znacznie nasilało się do piątego dnia. Gdy elektrowstrząsy traktowano inhibitorem polimeryzacji aktyny Latrunkuliną A, zagęszczenie elektrowstrząsów było zmniejszone, na co wskazuje znacznie większa powierzchnia przekroju poprzecznego w porównaniu z kontrolą. Skurcz tkanek oceniano w ciągu pięciu dni hodowli.Przy braku latrunkuliny A skurcz stopniowo nasilał się do piątego dnia, osiągając około 40% skurczu. Jednak obecność latrunkuliny A wpłynęła na skurcz tkanek, powodując tylko około 20% maksymalnego skurczu. Hamowanie polimeryzacji aktyny doprowadziło do znacznego zmniejszenia sztywności tkanki o około 50% w porównaniu z kontrolą.Wyniki te pokazują, że integralność cytoszkieletu aktyny jest niezbędna do zagęszczenia, skurczu i usztywnienia ECT. Ważne jest, aby wybrać niezawodne, wysokiej jakości rozwiązanie kolagenowe i upewnić się, że zawiesina jednokomórkowa o wysokiej żywotności jest używana do odtworzenia zmodyfikowanych tkanek łącznych.

fibroblast-derived-human-engineered-connective-tissue-for-screening

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Choroba Dupuytrena (DD) jest chorobą fibroproliferacyjną dłoni. W niniejszej pracy przedstawiono protokół resekcji wycinków z DD w trójwymiarowym (3D) systemie hodowli. Taki system hodowli krótkoterminowej pozwala na zachowanie struktury 3D i właściwości molekularnych tkanki zwłóknieniowej.

Ludzka hodowla ex vivo Dupuytrena do badania miofibroblastów i interakcji macierzy zewnątrzkomórkowej

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Wielu badaczy generuje dane "średniej wielkości", o niskiej prędkości i wielowymiarowe, które mogą być efektywniej zarządzane za pomocą baz danych niż arkuszy kalkulacyjnych. W tym miejscu przedstawiono koncepcyjny przegląd baz danych, w tym wizualizację danych wielowymiarowych, łączenie tabel w strukturach relacyjnych baz danych, mapowanie półautomatycznych potoków danych i używanie bazy danych do wyjaśniania znaczenia danych.

Bazy danych do efektywnego zarządzania średniej wielkości, wielowymiarowymi danymi o niskiej prędkości w inżynierii tkankowej

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Poznaj metodę inżynierii tkanki łącznej z fibroblastów ludzkich pod zdefiniowanymi warunkami mechanicznymi. Protokół umożliwia równoległe testowanie do 48 warunków w badaniach przesiewowych leków przeciwzwłóknieniowych.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Przeglądaj więcej filmów