Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Protokół ten pozwala fibroblastom budować i organizować własne środowisko w określonych warunkach mechanicznych. W ten sposób powstają tkanki anizotropowe o sztywności i składzie matrycy porównywalnym z naturalnym środowiskiem komórki. Metoda ta pozwala na równoległe porównanie do 48 warunków.

Jest elastyczny w odniesieniu do zastosowanego typu komórki i warunków hodowli. Dzięki zastosowaniu tylko kilku dobrze zdefiniowanych komponentów, jest on odtwarzalny między laboratoriami. Stosując czynniki profibrotyczne lub leki przeciwzwłóknieniowe, protokół ten może być wykorzystany do badania procesów leżących u podstaw chorób zwłóknieniowych dowolnego rodzaju.

Procedurę zademonstruje Alisa Degrave, doktorantka z naszego laboratorium, oraz ja. Na początek rozmrozić kriokonserwowane fibroblasty serca w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około dwie minuty, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową kroplami za pomocą dwumililitrowej pipety serologicznej do odpowiedniej sterylnej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów pożywki wzrostowej fibroblastów.

Aby uzyskać optymalne pobranie komórek, przepłucz kriofiolkę jednym mililitrem FGM i przenieś ją do probówki wirówkowej. Delikatnie zawiesić komórki i przenieść do kolby do hodowli komórkowych. Uzupełniaj FGM co drugi dzień przez pięć dni lub do momentu, gdy komórki osiągną 80% konfluencji.

Po zaessaniu pożywki z hodowanych komórek, umyj komórki sześcioma mililitrami PBS i aspiruj, a następnie dodaj sześć mililitrów odczynnika do dysocjacji komórek do komórek i inkubuj, aż widoczne będzie oderwanie komórki. Zneutralizuj aktywność enzymatyczną, dodając od sześciu do 12 mililitrów FGM do usuniętych komórek w odczynniku asocjacyjnym komórek. Delikatnie pipetować w górę i w dół cztery do ośmiu razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby zapewnić zawiesinę pojedynczych komórek i przenieść komórki do świeżej 50-mililitrowej probówki zbiorczej.

Sprawdź wydajność za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta i zdeponuj ogniwa. Po odwirowaniu odessać supernatant, przesunąć probówkę, aby usunąć osad i ponownie zawiesić komórki w FGM. Następnie przecedź zawiesinę komórek przez sitko o siatkowej siatce 40 mikrometrów, a następnie za pomocą automatycznego licznika komórek oceń liczbę komórek i żywotność poprzez wykluczenie prądu elektrycznego, aby zapewnić wiarygodną liczbę komórek przed przystąpieniem do zmodyfikowanych tkanek łącznych lub przygotowania ECT.

Aby przygotować się do ECT, dostosuj zawiesinę komórek do 8,9 miliona komórek na mililitr w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, dodając FGM i utrzymuj komórki na lodzie. Przenieść wszystkie pozostałe probówki zawierające poszczególne składniki mieszaniny hydrożelu ECT na lód i wstępnie schłodzić pustą 50-mililitrową probówkę wirówkową w celu przygotowania mieszaniny. Przygotowanie mieszaniny hydrożelowej ECT należy rozpocząć od dodania składników opisanych w tekście do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Najpierw odpipetuj rozpuszczalny w kwasach hydrożel kolagenu typu I do pipety serologicznej z końcówką o szerokim otworze. Dostosuj zawartość soli w roztworze kolagenu, dodając DMEM, delikatnie obracając probówkę w celu prawidłowego wymieszania. Aby zneutralizować pH, dodaj 0,2 molowego wodorotlenku sodu podczas wirowania probówki i potwierdź neutralizację, obserwując czerwony kolor czerwonego wskaźnika fenolu.

Następnie dodaj zawiesinę komórkową kroplami, delikatnie obracając probówkę. Wymieszaj zawiesinę, delikatnie przesuwając rurki w górę i w dół tylko raz, używając pipety serologicznej z końcówką o szerokim otworze, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i zminimalizować naprężenia ścinające. Delikatnie zakręć tubką 10 razy, aby dokładnie wymieszać.

Probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę hydrożelu ECT należy przechowywać na lodzie przez cały proces odlewania. Zwilż jednomililitrową końcówkę pipety w mieszaninie hydrożelu ECT, a następnie równomiernie rozprowadź 180 mikrolitrów mieszaniny hydrożelu w każdej formie 48-dołkowej płytki odlewniczej, unikając nadmiernych sił ścinających, które mogą wpływać na integralność zespołu matrycy kolagenowej i zapewniając, że cała płytka zakończy się w ciągu 15 do 20 minut. Upewnij się, że w formie tworzy się pełna pętla, ponieważ nieciągły rozkład mieszaniny ECT zapobiegnie całkowitemu tworzeniu się pierścienia ECT.

Należy unikać pipetowania do studzienki wewnętrznej i tworzenia pęcherzyków podczas pipetowania, aby zapewnić równomierne odlewanie hydrożelu ECT w celu tworzenia jednorodnych i funkcjonalnych tkanek. Ostrożnie umieścić 48-dołkową płytkę odlewniczą w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby rozpuścić mieszaninę hydrożelu ECT przez 15 do 30 minut. Po inkubacji wydaje się żelowy i nieprzezroczysty.

Delikatnie dodaj 600 mikrolitrów ciepłego FGM o temperaturze 37 stopni Celsjusza na studzienkę wzdłuż ściany, aby uniknąć oderwania ECT od dna. Codziennie zastępuj pożywkę 500 mikrolitrami FGM do czasu analizy. W żądanych punktach czasowych użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zarejestrować obrazy mikroskopowe widoków z góry i z boku ECT.

Użyj programu do przetwarzania obrazu, aby przeprowadzić analizę skanowania liniowego. Ustaw skalę i użyj narzędzia linii prostej, aby śledzić i mierzyć średnice ECT w co najmniej sześciu pozycjach na ramię w każdej płaszczyźnie obrazowania. Zobrazuj 48-dołkową płytkę odlewaną pod urządzeniem rejestrującym ze zintegrowaną kamerą skanującą obszar umieszczoną w stałej odległości, wyposażoną w monochromatyczny czujnik obrazu o wysokiej rozdzielczości i źródło światła bliskiego UV.

Wykonaj automatyczne wykrywanie końcówek tyczek zawierających barwnik fluorescencyjny w celu maksymalizacji kontrastu. Zmierz odległość między biegunami od dziennych zapisów za pomocą automatycznej analizy, uruchamiając zarejestrowane obrazy w oprogramowaniu do wykrywania jasnych pikseli o wysokim kontraście na ciemnym tle lub w programie do przetwarzania obrazu. Zdejmij ECT z drążków mocujących i włóż hak przenoszący i pętlę ECT.

Następnie przenieś ECT na dwa haki zaciśnięte na nieruchomym ramieniu i ramieniu przetwornika przedłużającego dynamicznego mechanicznego riometru wyposażonego w wannę narządową o temperaturze 37 stopni Celsjusza wypełnioną PBS. Zastosuj naprężenie jednoosiowe ze stałą szybkością liniową, ustawiając riometr na około 1% początkowej odległości między hakami na sekundę. Przy typowych wymiarach ECT można zastosować stałą szybkość rozciągania wynoszącą 0,03 milimetra na sekundę.

Rozerwij siłę przetwornika i rozpocznij rozciąganie. Kontynuuj nagrywanie do punktu pęknięcia ECT po znormalizowaniu zmierzonej siły przez pole przekroju poprzecznego i wykreśl krzywą naprężenie-odkształcenie, określając różne parametry biomechaniczne. Tuż przed rozpoczęciem mikroszczelinowania tkanki górna granica obszaru elastycznego odpowiada granicy plastyczności, a jego odkształcenie jest miarą elastyczności tkanki.

Obszar tworzywa sztucznego znajduje się pomiędzy granicą plastyczności a granicą uszkodzenia. Punkt uszkodzenia odpowiada nagłemu spadkowi naprężeń spowodowanemu pęknięciem tkanki, definiując ostateczne odkształcenie, które jest miarą rozciągliwości tkanki. Trzeci punkt pomiarowy odpowiada maksymalnej wytrzymałości określonej przez największe naprężenie, jakie tkanka może wytrzymać bez pękania podczas rozciągania.

Sprężystość i wytrzymałość nadana przez obszar pod krzywą odpowiada energii pochłoniętej przez tkankę odpowiednio do granicy plastyczności i punktu uszkodzenia. Dla każdej uzyskanej krzywej nachylenie części liniowej obszaru sprężystego odpowiada modułowi Younga, znanemu również jako moduł sprężystości. Jest to właściwość mechaniczna, która mierzy sztywność tkanki.

Korzystając z tego protokołu, zagęszczenie i kurczenie się ECT w warunkach kontrolnych i w obecności FCS następowało kilka godzin po odlewaniu i znacznie nasilało się do piątego dnia. Gdy elektrowstrząsy traktowano inhibitorem polimeryzacji aktyny Latrunkuliną A, zagęszczenie elektrowstrząsów było zmniejszone, na co wskazuje znacznie większa powierzchnia przekroju poprzecznego w porównaniu z kontrolą. Skurcz tkanek oceniano w ciągu pięciu dni hodowli.

Przy braku latrunkuliny A skurcz stopniowo nasilał się do piątego dnia, osiągając około 40% skurczu. Jednak obecność latrunkuliny A wpłynęła na skurcz tkanek, powodując tylko około 20% maksymalnego skurczu. Hamowanie polimeryzacji aktyny doprowadziło do znacznego zmniejszenia sztywności tkanki o około 50% w porównaniu z kontrolą.

Wyniki te pokazują, że integralność cytoszkieletu aktyny jest niezbędna do zagęszczenia, skurczu i usztywnienia ECT. Ważne jest, aby wybrać niezawodne, wysokiej jakości rozwiązanie kolagenowe i upewnić się, że zawiesina jednokomórkowa o wysokiej żywotności jest używana do odtworzenia zmodyfikowanych tkanek łącznych.