Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

Test stanowi ważne narzędzie badawcze do symulacji degranulacji bazofili indukowanych przez sieciowanie IgE pacjentów i alergenów. W ten sposób test może być stosowany do naśladowania reakcji alergicznych typu 1. Test jest solidny, powtarzalny i można go dostosować do indywidualnych potrzeb.

Co więcej, jest bardzo czuły, ponieważ można go wykonywać z niewielkimi ilościami rekombinowanego lub oczyszczonego alergenu, a nawet ze złożonymi ekstraktami alergenowymi. Metoda służy do diagnozowania alergii, ponieważ analizuje reaktywność IgE pacjentów na alergeny. Metoda ta jest również odpowiednia do analizy reaktywności krzyżowej i monitorowania skuteczności leczenia AIT.

Rozpocznij od zebrania komórek Ag8 z kolby do hodowli komórkowej i przenieś komórki do probówki wirówkowej. Granulować komórki przez odwirowywanie przez pięć minut, w ilości 250 g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do końcowego stężenia około 10 do szóstych komórek, na mililitr w humanizowanej pożywce z komórek RBL.

Rozcieńczyć surowicę ludzką od 1 do 10 w zawiesinie komórek Ag8 w celu uzyskania końcowego rozcieńczenia surowicy od 1 do 20 w teście i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 7% dwutlenku węgla. Gdy humanizowane komórki RBL osiągną 50 do 90% zbieżności, ostrożnie odessaj pożywkę z kolby do hodowli komórek T-75, nie dotykając przylegających humanizowanych komórek RBL. Umyć komórki dwukrotnie, dodając 10 mililitrów DPBS po przeciwnej stronie kolby, a nie bezpośrednio na komórki.

Odessać DPBS, dodać pięć mililitrów wstępnie podgrzanej jednorazowo trypsyny-EDTA w celu oderwania komórek i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie postukaj w kolbę, aby odłączyć komórki. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-milimetrowej probówki wirówkowej i napełnij probówkę humanizowaną pożywką komórkową RBL lub DPBS w celu rozcieńczenia trypsyny-EDTA.

Odwirować komórki w temperaturze 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach humanizowanego podłoża komórkowego RBL w celu zliczenia komórek. Po policzeniu komórek rozcieńczyć komórki w humanizowanym pożywce komórkowej RBL, aby uzyskać końcowe stężenie dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr.

Dodaj 50 mikrolitrów humanizowanej zawiesiny komórek RBL na studzienkę, co odpowiada jednemu razy 10 do piątej komórki na studzienkę w sterylnej 96-dołkowej płytce. Odwirować wstępnie inkubowaną zawiesinę surowicy Ag8 i przenieść 50 mikrolitrów odwirowanej zawiesiny surowicy Ag8 do każdej studzienki zawierającej humanizowane komórki RBL, nie naruszając osadu komórek Ag8. Używaj uczulonych, niestymulowanych komórek bez antygenu jako braku kontroli antygenu do wskazania dolnego plateau sygnałowego lub tła i nie uczulaj tła i studzienek kontrolnych maksymalnej lizy.

Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu do 7% dwutlenku węgla. Odessać surowicę zawierającą pożywkę komórkową, odwrócić i postukać płytką o bibułę chłonną, aby opróżnić płytkę do mycia humanizowanych komórek RBL. Przemyć komórki trzy razy, dodając 200 mikrolitrów buforu Tyrode'a na studzienkę i inkubować przez około 30 sekund na przemycie przez pierwsze dwa płukania.

Po dodaniu buforu Tyrode'a po raz trzeci, odessać bufor i pozostawić roztwór w studzienkach, aż będzie gotowy do dodania rozcieńczenia antygenu. Przenieś 100 mikrolitrów roztworu antygenu do każdej studzienki zawierającej wstępnie uczulone humanizowane komórki RBL, ale nie stymuluj antygenem maksymalnej lizy i nieuczulonych komórek tła. Dodaj 100 mikrolitrów buforu Tyrode'a do studzienek kontrolnych o maksymalnej lizie, nieuczulonych studzienek kontrolnych w tle i uczulonych studzienek bez antygenu.

Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 7% dwutlenku węgla. Potraktuj studzienki kontrolne maksymalnej lizy 10 mikrolitrami 10% Triton X-100 na studzienkę i odpowiednio wymieszaj, aby całkowicie zlizować komórki w celu 100% uwolnienia beta-heksozaminidazy. Dodać 50 mikrolitrów roztworu substratu do nowej niewiążącej płytki 96-dołkowej.

Przenieść 50 mikrolitrów supernatantu z dołków humanizowanych komórek RBL zawierających płytkę do nowej płytki zawierającej roztwór substratu i inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić konwersję substratu fluorogenicznego. Dodać 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do studzienki i zmierzyć fluorescencję zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Krzywa dzwonowa uzyskana w teście aktywności beta-heksozaminidazy, wskazująca na monowalentne zajęcie epitopów antygenu immunoglobuliny E z powodu nadmiaru alergenu, który hamuje sieciowanie immunoglobuliny alergenowej E przy wysokich stężeniach antygenu.

Stężenie antygenu niezbędne do połowy maksymalnego uwolnienia mediatora obliczono za pomocą analizy regresji liniowej. Test żywotności komórek przeprowadzono w celu wykluczenia efektów cytotoksycznych pochodzących zarówno z surowicy uczulającej, jak i antygenu użytego do stymulacji. Do testu aktywności beta-heksozozominidazy użyto pięciu różnych surowic ludzkich, a cztery z pięciu surowic pochodzących z alergii na pyłki brzozy zareagowały na stymulację Bet v 1, wykazując, że Bet v 1 jest silnym alergenem odpowiedzialnym za objawy alergiczne, w których pośredniczy immunoglobulina E.

Oceniono reaktywność krzyżową immunoglobuliny E wobec alergenów homologicznych. Odpowiedź na Bet v 1 stwierdzono u obu pacjentów, ale pacjent drugi zareagował również na Cor a 1. Homologiczny alergen pokarmowy Bet v 1, wskazujący na wyższy poziom immunoglobuliny E reagującej krzyżowo Cor a 1 u pacjenta drugiego.

Oceniono hipoalergiczny charakter zmutowanych wariantów alergenów i porównano je z ich odpowiednikami typu dzikiego. Krzywa uwalniania wariantu Bet v 1 fold przesunęła się w kierunku wyższego stężenia antygenu w porównaniu z alergenem typu dzikiego, co skutkowało znacznie wyższym stężeniem antygenu w celu sprowokowania połowy maksymalnego uwalniania, co sprawia, że mutant jest mniej alergiczny, a zatem jest kandydatem do swoistej immunoterapii alergenowej. Nie zapomnij pozostawić roztworów myjących na komórkach do czasu zastosowania rozcieńczenia antygenu, aby uniknąć wysychania komórek, w przeciwnym razie skutkowałoby to słabą wydajnością testu.

Test może być stosowany do wielu różnych zastosowań, w tym do standaryzacji produktów alergizujących, w oparciu o ich aktywność biologiczną, takich jak roztwory punktowych testów skórnych lub ekstrakty stosowane w swoistej immunoterapii alergenowej.