Name: Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj skalowalny model urazów mózgu u dorosłych Danio rerio wykorzystujący metodę upuszczania ciężaru. Ta technika pozwala badać mechanizmy regeneracji neuronalnej i odpowiedzi komórkowe po urazach o różnym nasileniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Hyde za ich wnikliwe dyskusje, technikom Centrum Nauk Przyrodniczych Freimann za opiekę i hodowlę danio pręgowanego oraz University of Notre Dame Optical Microscopy Core/NDIIF za korzystanie z instrumentów i ich usługi. Praca ta była wspierana przez Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Notre Dame, Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej na Uniwersytecie Notre Dame oraz granty z National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Stypendium Strażników Wolności (JTH) oraz Stypendium Pata Tillmana (JTH).

Rybki danio zostały wyhodowane i utrzymywane w ośrodku Zebrafish na Uniwersytecie Notre Dame w centrum Freimann Life Sciences Center. Metody opisane w niniejszej pracy zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Notre Dame.
1. Model urazowego uszkodzenia mózgu
<ol>
	<li>Dodaj 1 mL 2-fenoksyetanolu do 1 L wody systemowej (60 mg Instant Ocean w 1 L dejonizowanej wody RO).</li>
	<li>Przygotuj napowietrzany zbiornik regeneracyjny zawierający 2 L wody systemowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wybierz pożądaną masę kulki łożyskowej oraz pożądaną długość i średnicę rurki stalowej lub plastikowej i wyznacz energię oraz siłę uderzenia. 
	UWAGA: Rurka powinna mieć średnicę wewnętrzną umożliwiającą przejście kulki łożyskowej bez zmiany jej toru lub prędkości ruchu.
	<ol>
		<li>Wyznacz energię kinetyczną w momencie uderzenia: 
		<img alt="Wzór na energię kinetyczną KE=mgh, edukacja z zakresu fizyki, wyjaśnienie konwersji energii" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		Gdzie, KE = energia kinetyczna, m = masa (w kg), g = siła grawitacji, h = wysokość (w m) od punktu zrzutu do ryby. 
		UWAGA: Pozwala to wyznaczyć energię kinetyczną w J. Pomnóż wartość przez 1 000, aby otrzymać wynik w mJ. KE opiera się na obiekcie przyspieszającym, co ma miejsce w przypadku upuszczenia kulki łożyskowej z pozycji spoczynkowej.</li>
		<li>Wywołaj łagodne TBI (miTBI), używając stalowej lub plastikowej rurki o długości 7,62 cm, która kończy się 1,5 cm nad płytką na czaszce danio pręgowanego (całkowita odległość 9,1 cm) oraz kulki łożyskowej o masie 1,5 g (średnica 6,4 mm). Generuje to energię kinetyczną wynoszącą 1,33 mJ. Empirycznie ustalono, że uszkodzenie to jest równoważne miTBI w oparciu o kluczowe markery patofizjologiczne TBI, takie jak uszkodzenia naczyniowe, tworzenie się krwiaków podtwardówkowych/wewnątrzczaszkowych, śmierć komórek neuronalnych oraz zaburzenia poznawcze, które w dużej mierze odzwierciedlały doniesienia dotyczące populacji ludzkiej w sposób zależny od stopnia nasilenia urazu.</li>
		<li>Oblicz energię kinetyczną miTBI = <img alt="Wzór na równowagę statyczną, obliczanie pracy w milijulach, równanie konwersji energii." src="/files/ftp_upload/62709/62709eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Wywołaj umiarkowane TBI (moTBI), używając stalowej lub plastikowej rurki o długości 12,7 cm, która kończy się 1,5 cm nad płytką na czaszce danio pręgowanego (całkowita odległość 14,2 cm) oraz kulki łożyskowej o masie 1,5 g (średnica 6,4 mm), co generuje energię kinetyczną wynoszącą 2,08 mJ.</li>
		<li>Oblicz energię kinetyczną moTBI = <img alt="Wzór na równowagę statyczną; obliczanie energii; równania fizyczne; masa, grawitacja, wysokość." src="/files/ftp_upload/62709/62709eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
		<li>Wywołaj ciężkie TBI (sTBI), używając stalowej lub plastikowej rurki o długości 7,62 cm, która kończy się 1,5 cm nad płytką na czaszce danio pręgowanego (całkowita odległość 9,1 cm) oraz kulki łożyskowej o masie 3,3 g (średnica 8,38 mm), co generuje energię kinetyczną wynoszącą 2,94 mJ.</li>
		<li>Oblicz energię kinetyczną sTBI =  <img alt="Obliczenia równowagi statycznej, wzór pokazujący konwersję energii potencjalnej na milijule." src="/files/ftp_upload/62709/62709eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnij szalkę Petriego plasteliną (Rysunek 1, krok 1) i za pomocą tępego narzędzia (np. grzbietu pęsety) utwórz wypukłą platformę (5 cm x 1,5 cm) z dodatkowej plasteliny (Rysunek 1, krok 2).
	<ol>
		<li>Użyj żyletki, aby podzielić wypukłą platformę wzdłuż na dwie w przybliżeniu równe połowy (Rysunek 1, krok 3, czerwona przerywana linia). Uformuj obie połowy w kanał mieszczący długość dorosłej ryby (Rysunek 1, krok 4). Użyj dodatkowej plasteliny do zbudowania ścianek, które zabezpieczą ok. 2/3 ciała ryby, pozostawiając odsłoniętą głowę.</li>
		<li>Uformuj niewielkie podparcie w obszarze odsłoniętej głowy, prostopadle do ścianek, aby podtrzymać głowę i uniknąć jej rotacji lub odrzutu podczas urazu (Rysunek 1, krok 4). 
		UWAGA: Kanał powinien być wystarczająco głęboki, aby utrzymać rybę w pozycji grzbietem do góry, ale nadal powinien pozwalać głowie spoczywać powyżej otaczającej plasteliny. Dodatkowo podparcie głowy powinno mengikutić naturalną krzywiznę ryby, podtrzymując dolną szczękę i skrzela.</li>
		<li>Upewnij się, że opadający ciężarek nie jest blokowany przez ścianki kanału (Rysunek 1, krok 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj stalowy dysk o średnicy 3 mm, używając mini dziurkacza i blachy stalowej o grubości 22 g. Każdy dysk można wykorzystać wielokrotnie.</li>
	<li>Zanurz jedną rybę w zlewce z 50-100 mL 2-fenoksyetanolu w stężeniu 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) i pozostaw do czasu, aż przestanie reagować na uciśnięcie ogona.</li>
	<li>Umieść rybę grzbietem do góry w formach z plasteliny wewnątrz kanału tak, aby ciało było zabezpieczone z boków, a na głowie umieść stalowy dysk o średnicy 3 mm i grubości 22 g, centrując go nad pożądanym punktem uderzenia (Rysunek 1, krok 5).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że ryba jest ustawiona jak najbardziej prostopadle, aby uniknąć przechylenia głowy na jedną stronę, co mogłoby spowodować nierównomierne uderzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamocuj rurkę stalową lub plastikową, używając standardowego statywu z obejmą, tak aby dół rurki znajdował się 1,5 cm nad głową danio pręgowanego (Rysunek 1, krok 6). Upewnij się, że rurka jest prosta.
	<ol>
		<li>Spójrz przez rurkę i upewnij się, że jest ona wyrównana nad stalową płytką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upuść kulkę łożyskową (1,5 g dla łagodnego i umiarkowanego TBI oraz 3,3 g dla ciężkiego TBI) z określonej wysokości (opisanej w krokach 1.3.3-1.3.5) przez rurkę na stalową płytkę umieszczoną nad pożądanym obszarem neuroanatomicznym (np. móżdżkiem, Rysunek 1, krok 5), aby wywołać TBI z urazem tępym o pożądanym stopniu nasilenia. Umieść ranną rybę w zbiorniku regeneracyjnym w celu monitorowania. 
	UWAGA: W zależności od stopnia nasilenia urazu może dojść do śmierci lub wystąpienia napadów toniczno-klonicznych. Jeśli ryby nie reagują przez dłuższy czas po TBI, użyj pipety transferowej lub pęsety, aby ucisnąć ogon i ocenić reakcję bólową.</li>
</ol>
2. Ocena napadów drgawek po TBI u dorosłych rybek danio pręgowanych
<ol>
	<li>Zanurz rybę w środku znieczulającym i wykonaj uraz zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, a następnie umieść ranną rybę w napowietrzanym zbiorniku regeneracyjnym zawierającym 2 L wody systemowej.</li>
	<li>Obserwuj ryby pod kątem wystąpienia jakichkolwiek oznak napadów potraumatycznych bezpośrednio po umieszczeniu ich w zbiorniku regeneracyjnym. Wyznacz czas obserwacji (np. 1 h) i zapisz całą aktywność napadową, w tym ocenę napadu (opisaną poniżej), czas trwania każdego napadu oraz odsetek ryb, u których wystąpiły napady (Ryc. 2A). 
	UWAGA: Napady mogą wystąpić natychmiast po urazie, a także godziny lub dni po TBI. Napady mogą utrzymywać się długoterminowo, a jedna ryba może przejść wiele napadów. Ustalenie czasu obserwacji wynoszącego 1 h lub więcej pozwoli na uzyskanie dobrej reprezentacji ogólnej tendencji częstości występowania napadów.</li>
	<li>Oceń stan ryb, korzystając z wytycznych Mussulini18 dotyczących fenotypów napadów u dorosłych danio pręgowanych. 
	​UWAGA: Bez użycia oprogramowania do śledzenia trudne jest obiektywne ocenienie napadów o wyniku poniżej 3. Dlatego w przypadku oceny przeprowadzanej bez użycia oprogramowania należy zapisywać jedynie wyniki napadów równe 3 lub wyższe.</li>
</ol>
3. Disekcja mózgu
<ol>
	<li>Uśmierć ryby w roztworze 2-fenoksyetanolu o stężeniu 1:500 (2 mL/1 L, 0.2%), aż do ustania ruchów skrzelowych i braku reakcji na uciśnięcie płetwy, w pożądanym punkcie końcowym.</li>
	<li>Wypełnij szalkę Petriego plasteliną i utwórz niewielki otwór, aby podeprzeć ciało podczas sekcji.</li>
	<li>Umieść rybę grzbietem do góry w formie z plasteliny. Wbij jedną szpilkę sekcyjną w linii środkowej w połowie długości ciała ryby oraz drugą szpilkę ok. 5 mm za podstawą głowy.</li>
	<li>Pod stereomikroskopem rozetnij tępym narzędziem nerw wzrokowy za pomocą pęsety Dumont #5 i usuń oczy (Rysunek 2A).</li>
	<li>Ustaw rybę tak, aby koniec rostralny był najdalej podczas obserwacji przez mikroskop (Rysunek 2B). 
	UWAGA: Kolejne kroki są przeznaczone dla osób praworęcznych. Osoby leworęczne mogą preferować wykonanie poniższych czynności w orientacji lustrzanej.</li>
	<li>Używając pęsety #5, powoli wsuń jeden koniec pęsety pod prawą płytkę ciemieniową, wykonując celowy ruch nożycowy w kierunku końca rostralnego, a następnie usuń prawą płytkę ciemieniową i czołową (Rysunek 2C).
	<ol>
		<li>Trzymaj pęsetę pod kątem 45° lub mniejszym, aby uniknąć przebicia mózgu podczas sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróć rybę o 90˚ zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Wsuń jeden koniec pęsety #5 pod lewą płytkę ciemieniową i stosując ten sam ruch nożycowy, usuń lewą płytkę ciemieniową i czołową, odsłaniając całą grzbietową stronę mózgu (Rysunek 2D,E).</li>
	<li>Tępym narzędziem przetnij szczękę za pomocą pęsety #5. Zachowaj cebulki węchowe i nie uszkadzaj ich, jeśli jest to obszar zainteresowania.</li>
	<li>Usuń prawą pokrywę, przedpokrywę, międzyoperkulum i podpokrywę za pomocą pęsety #5 (Rysunek 2F).</li>
	<li>Tępym narzędziem wyreseknuj muskulaturę na końcu ogonowym otworu czaszki, używając pęsety #5, aby odsłonić rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Tępym narzędziem przetnij rdzeń kręgowy pęsetą #5. Ostrożnie wsuń pęsetę pod mózg i delikatnie wyjmij go z czaszki. 
	UWAGA: Nigdy nie ściskaj mózgu. Używaj pęsety, aby „podtrzymać” mózg lub wyreseknuj tkanki ku dołowi i wykorzystaj odsłonięty rdzeń kręgowy jako punkt podparcia do manipulacji mózgiem.</li>
	<li>Utrwal usunięte mózgi w mieszaninie 9 części 100% etanolu i 1 części 37% formaldehydu przez noc w temperaturze 4°C na platformie kołyszącej.</li>
</ol>
4. Badania nad obrzękiem mózgu u ryb zebrafish
<ol>
	<li>Zanurzyć ryby w anestetyku i zadać im obrażenia zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, a następnie pozostawić ryby w zbiorniku regeneracyjnym do czasu, aż zaczną swobodnie pływać.</li>
	<li>Po zadaniu obrażeń umieścić ryby z powrotem w normalnych warunkach bytowania na 1 dzień.</li>
	<li>Po upływie wyznaczonego czasu przeprowadzić eutanazję ryb w roztworze 2-fenoksyetanolu w stężeniu 1:500.</li>
	<li>Wypreparować cały mózg lub obszar zainteresowania zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 3 i natychmiast umieścić mózg w małym naczynku do ważenia. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas przenoszenia mózgu, używając pęsety precyzyjnej, aby delikatnie położyć go w naczyniu do ważenia, unikając nakłuwania lub zdrapywania tkanki, co mogłoby doprowadzić do jej utraty.</li>
	<li>Oznaczyć (grupa obrażeń i numer mózgu) oraz wytarować dodatkowe małe naczynko do suszenia i ważenia na wadze. W celu uzyskania dokładnego pomiaru należy użyć wagi o rozdzielczości minimum 0.001 g.</li>
	<li>Przenieść mózg do wytarowanego naczynka do suszenia i zapisać masę mokrą mózgu. Ułożyć mózgi płasko w naczyniu, stroną grzbietową do góry.</li>
	<li>Umieścić naczynko do suszenia wraz z mózgiem w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 60 °C na 8 h.</li>
	<li>Po wysuszeniu mózg może przywrzeć do naczynka, co może utrudnić jego usunięcie i przeniesienie do nowego, wytarowanego małego naczynka do ważenia. Należy unikać ściskania mózgu pęsetą, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia wysuszonego organu i utraty tkanki. Zamiast tego należy złożyć końcówki pęsety precyzyjnej i, zaczynając od strony brzusznej mózgu, podważyć go ruchem ku górze.</li>
	<li>Wyznaczyć zawartość wody w każdym mózgu, korzystając ze wzoru (Rysunek 4): 
	<img alt="Wzór na zawartość wody, % Zawartość Wody=(masa mokra-masa sucha)/masa mokra*100, równowaga statyczna." src="/files/ftp_upload/62709/62709eq05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5"></li>
</ol>
5. Markowanie proliferacji komórkowej wzdłuż neuroosi i przygotowanie utrwalonej tkanki.
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) w 2 mL ddH2O.</li>
	<li>Zanurzyć od 3 do 4 ryb jednocześnie w 50-100 mL 2-fenoksyetanolu w stężeniu 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) w celu znieczulenia, aż ryby przestaną reagować na uciśnięcie ogona, w wybranym punkcie czasowym po urazie (zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1).</li>
	<li>Wyciąć częściowe otwory w mokrej gąbce i umieszczać w nich po jednej rybie, stroną brzuszną do góry.</li>
	<li>Za pomocą igły 30 G wstrzyknąć ~40 µL 10 mM EdU do ciała ryby. Przenieść rybę do zbiornika przechowawczego wypełnionego wodą systemową. 
	UWAGA: Można przeprowadzać wielokrotne iniekcje w różnych punktach czasowych, aby oznakować większą liczbę proliferujących komórek; może to być konieczne, jeśli wymagany jest okres pogoni (chase period) dłuższy niż 1 tydzień.</li>
	<li>Pobrać mózgi zgodnie z opisem w sekcji 3 i umieścić je grupowo w szklanej fiolce o pojemności 5 mL zawierającej 2 mL mieszaniny 9 części 100% etanolu i 1 części 37% formaldehydu. Utrwalać mózgi w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. 
	UWAGA: Platforma kołysząca lub wytrząsarka zapobiega osiadaniu mózgów na dnie oraz zwijaniu się telencefalonu w przypadku całych mózgów.</li>
	<li>Rehydratyzować mózgi w tej samej szklanej fiolce, w której były utrwalane, przeprowadzając płukanie w malejącej serii stężeń etanolu: 75%, 50% i 25% przez 15 min każde, a następnie płukać przez 1,5 h w 5% sacharozy/PBS na kołysarce w temperaturze pokojowej. Przechowywać mózgi w szklanej fiolce przez noc w 30% sacharozy/PBS w temperaturze 4° C na platformie kołyszącej.</li>
	<li>Wyjąć mózgi z 30% sacharozy/PBS i przenieść je pęsetą do płytki 12-dołkowej (jedna grupa badawcza na dołek), w której dołki wypełnione są roztworem w stosunku 2:1 (2 części medium do mrożenia tkanek i 1 część 30% sacharozy/PBS). Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej.</li>
	<li>Przenieść mózgi do kolejnego rzędu dołków w płytce 12-dołkowej, zanurzając je w 100% TFM na 2-24 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyć uchwytu do kriotomu, aby zatopić mózgi w TFM w pożądanej orientacji na suchym lodzie.</li>
	<li>Wykonać kriosiekcjonowanie (przekroje o grubości 16 μm) i zebrać sekcje na szkiełkach dodatnio naładowanych. Suszyć szkiełka na ogrzewaczu do szkiełek przez 1 h, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować procedurę immunohistochemiczną.</li>
	<li>Stworzyć barierę hydrofobową na szkiełku wokół sekcji tkankowych i pozostawić do wyschnięcia na ogrzewaczu do szkiełek przez 20 min.</li>
	<li>Krótko płukać szkiełka w PBS przez 5 min, a następnie dwukrotnie w PBS-Tween 20 (0,05%) po 10 min każde.</li>
	<li>Przeprowadzić detekcję EdU przy użyciu zestawu EdU Cell Proliferation Kit zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przeanalizować szkiełka i skwantyfikować fluorescencyjnie oznakowane komórki EdU przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Aby wyraźnie rozróżnić poszczególne komórki, wymagany będzie obiektyw o powiększeniu minimum 40x.</li>
</ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+Report+of+Traumatic+Brain+Injury-related+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations%2C+and+Deaths-United+States%2C+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%2C+U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services%22%5BJournal%5D)">Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014.</a> Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).</li>
<li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+current+treatment+strategies+and+future+endeavors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li>
<li>Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+comparison+of+penetrating+and+blunt+traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+injury%22%5BJournal%5D)">A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries.</a> Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).</li>
<li>Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergency+department+evaluation+of+traumatic+brain+injury+in+the+United+States%2C+2009-2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Head+Trauma+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010.</a> The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).</li>
<li>Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+Brain+Injury+in+the+United+States%3A+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations+and+Deaths%22">Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths</a>. , (2010).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch3+and+DeltaB+maintain+M%C3%BCller+glia+quiescence+and+act+as+negative+regulators+of+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Glia. 69 (3), 546-566 (2021).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLoS Biology. 17 (2), 3000159(2019).</li>
<li>Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+zinc+sulfate+results+in+differential+effects+on+olfactory+sensory+neuron+subtypes+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445(2016).</li>
<li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Becker, C., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Alyenbawwi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizures+are+a+druggable+mechanistic+link+between+TBI+and+subsequent+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy.</a> eLife. 10, 58744(2021).</li>
<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelia-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>McCutcheon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+traumatic+brain+injury+in+adult+zebrafish+demonstrates+response+to+injury+and+treatment+comparable+with+mammalian+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marmarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+I%3A+Pathophysiology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).</li>
<li>Mussulini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizures+induced+by+pentylenetetrazole+in+the+adult+zebrafish%3A+a+detailed+behavioral+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization.</a> PloS One. 8 (1), 54515(2013).</li>
<li>Kalueff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li>
<li>Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of traumatic brain injuries.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).</li>
<li>Amamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+axolotls+can+regenerate+original+neuronal+diversity+in+response+to+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury.</a> eLife. 5, 13998(2016).</li>
<li>Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild%2C+moderate+and+severe%3A+terminology+implications+for+clinical+and+experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).</li>
<li>Lund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury%2C+acute+phase+course+and+deviations+in+physiological+variables%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Trauma+Resuscitation+and+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77(2016).</li>
<li>Levin, H., Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis%2C+prognosis%2C+and+clinical+management+of+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury.</a> The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).</li>
<li>Ruff, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+diagnosing+a+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+National+Academy+of+Neuropsychology+education+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Clinical+Neuropsychology%3A+The+Official+Journal+of+the+National+Academy+of+Neuropsychologists%22%5BJournal%5D)">Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper.</a> Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).</li>
<li>Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in fish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018(2016).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Muller+glia+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons.</a> Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania nad neurotraumą i związanymi z nią następstwami od dawna koncentrują się na tradycyjnych, nieregenerujących się modelach gryzoni20. Dopiero w najnowszych badaniach zastosowano różne formy uszkodzenia OUN w modelach regeneracyjnych 9,11,13,14,21. Modele te, choć wnikliwe, są ograniczone albo przez zastosowanie metody urazów rzadk...

Urazowe urazy mózgu (TBI) są globalnym kryzysem zdrowotnym i główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności. W Stanach Zjednoczonych około 2,9 miliona ludzi doświadcza TBI każdego roku, a w latach 2006-2014 śmiertelność z powodu TBI lub następstw TBI wzrosła o ponad 50%1. Jednak TBI różnią się etiologią, patologią i obrazem klinicznym, głównie ze względu na mechanizm urazu (MOI), który również wpływa na strategie leczenia i przewidywane rokowanie2. Chociaż TBI mogą wynikać z różnych MOI, są one głównie wynikiem urazu penetrującego lub narzędzia. Urazy penetrujące stanowią niewielki procent TBI i generują ciężkie i ogniskowe urazy, które są zlokalizowane w bezpośrednich i otaczających przebitych obszarach mózgu3. W przeciwieństwie do tego, TBI siły są bardziej powszechne w populacji ogólnej, obejmują zakres nasileń (łagodne, umiarkowane i ciężkie) i powodują rozproszone, niejednorodne i globalne uszkodzenie wpływające na wiele obszarów mózgu1,4,5.
Danio pręgowany (Danio rerio) został wykorzystany do zbadania szerokiego zakresu neurologicznych urazów obejmujących ośrodkowy układ nerwowy (OUN)6,7,8,9. Danio pręgowany posiada również, w przeciwieństwie do ssaków, wrodzoną i silną reakcję regeneracyjną na naprawę uszkodzeń OUN10. Obecne modele urazów danio pręgowanego wykorzystują różne metody urazów, w tym penetrację, wycięcie, zniewagę chemiczną lub fale ciśnienia11,12,13,14,15,16. Jednak każda z tych metod wykorzystuje MOI, który jest rzadko doświadczany przez populację ludzką, nie jest skalowalny w zakresie ciężkości obrażeń i nie odnosi się do heterogeniczności lub zależnej od ciężkości następstw TBI zgłaszanych po TBI siły. Czynniki te ograniczają wykorzystanie modelu danio pręgowanego do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patologii związanych z najczęstszą postacią TBI w populacji ludzkiej (łagodne urazy siłą).
Naszym celem było opracowanie szybkiego i skalowalnego modelu TBI z siłą, który umożliwia badanie patologii urazów, progresji następstw TBI i wrodzonej reakcji regeneracyjnej. Zmodyfikowaliśmy powszechnie używany spadek wagi gryzonia Marmarou17 i zastosowaliśmy go do dorosłego danio pręgowanego. Ten model daje powtarzalny zakres nasileń od łagodnego, umiarkowanego do ciężkiego. Model ten podsumowuje również wiele aspektów patologii TBI u ludzi, w sposób zależny od nasilenia, w tym drgawki, obrzęki, krwiaki podtwardówkowe i śródmózgowe, śmierć komórek neuronalnych i deficyty poznawcze, takie jak zaburzenia uczenia się i pamięci. Dni po urazie patologie i deficyty ustępują, wracając do poziomów przypominających nieuszkodzone kontrole. Ponadto ten model danio pręgowanego wykazuje silną reakcję na proliferację i regenerację neuronów w całej neuroosi w odniesieniu do ciężkości urazu.
Tutaj podajemy szczegóły dotyczące przygotowania i indukcji urazu, punktacji napadów pourazowych, oceny urazów naczyniowych, instrukcji dotyczących przygotowania sekcji mózgu, podejść do ilościowego określania obrzęku oraz wglądu w reakcję proliferacyjną po urazie.

<table><tbody><tr><td>2-fenoksyetanol</td><td>Sigma Alderich</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>#00 śrut</td><td>Remington</td><td>RMS23770</td><td>3,3 g do</td></tr> <tr><td>śrutu</td> sTBI#3 <td>Remington</td><td>RMS23776</td><td>1,5 g waga do miTBI/moTBI</td></tr><tr><td>#5 Kleszcze Dumonta</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>5-etynylo-2'-deoksyurydyna</td><td>Life Technologies</td><td>A10044</td><td>EdU</td></tr><tr><td>Szklana fiolka o pojemności 5 ml</td><td>VWR</td><td>66011-063</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne 12-dołkowa płytka</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr> Super <tr><td>frost dodatnio naładowane szkiełka</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen Liquid Blocker</td><td>Ted Pella</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>Środek do zamrażania tkanek</td><td>VWR</td><td>15148-031</td><td></td></tr></tbody></table>

skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

urazowe urazy mózgu (TBI) są najczęstszą formą urazów głowy, które obejmują różne nasilenia i skutkują złożonymi i niejednorodnymi skutkami ubocznymi. Chociaż nie ma mechanizmu zastępowania lub regeneracji utraconych neuronów po TBI u ludzi, danio pręgowany posiada zdolność do regeneracji neuronów w całym ciele, w tym w mózgu. Aby zbadać zakres patologii wykazywanych u danio pręgowanego po TBI i zbadać mechanizmy leżące u podstaw późniejszej neuronalnej odpowiedzi regeneracyjnej, zmodyfikowaliśmy powszechnie stosowany spadek masy ciała gryzoni Marmarou do stosowania u dorosłych danio pręgowanego. Nasz prosty model TBI z siłą jest skalowalny, indukując łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje wiele fenotypów obserwowanych po TBI u ludzi, takich jak napady kontaktowe i pourazowe, obrzęki, krwiaki podtwardówkowe i śródmózgowe oraz zaburzenia poznawcze, z których każdy objawia się w sposób zależny od ciężkości urazu. Następstwa TBI, które zaczynają pojawiać się w ciągu kilku minut od urazu, ustępują i wracają do prawie nieuszkodzonego poziomu kontrolnego w ciągu 7 dni po urazie. Proces regeneracji rozpoczyna się już po 48 godzinach od urazu (hpi), a szczytową proliferację komórek obserwuje się po 60 hpi. W ten sposób nasz model TBI siły danio pręgowanego wytwarza charakterystyczne pierwotne i wtórne patologie TBI urazów podobne do ludzkiego TBI, co pozwala na badanie początku i progresji choroby, a także mechanizmów regeneracji neuronów, które są unikalne dla danio pręgowanego.

Przygotowanie zestawu do indukowania urazów umożliwia szybki i prosty sposób zadawania skalowalnego urazu tępego TBI u dorosłych danio pręgowanych. Stopniowany stopień nasilenia w tym modelu urazów dostarcza kilku łatwo identyfikowalnych wskaźników skuteczności urazu, przy czym uraz naczyniowy jest jedną z najłatwiejszych do rozpoznania i najbardziej prominentnych patologii (Rycina 3). Szczep ryb użyty podczas indukowania urazu może sprawić, że wskaźnik ten będzie łatwiejszy lub trudniejszy ...

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Protokół ten zapewnia prostą, szybką i powtarzalną metodę wywoływania skalowalnego urazowego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego. Dorosłe rybo pręgowane, które przechodzą to urazowe uszkodzenie mózgu, wykazują wiele cech obserwowanych u ludzi, którzy cierpią na siłę TBI. Procedurę zademonstrują Pan James Hentig i Pani Kaylee Cloghessy, dwie doktorantki z mojego laboratorium.Zacznij od wypełnienia szalki Petriego plasteliną. Następnie użyj palców lub grzbietu kleszczy, aby stworzyć podniesioną platformę z dodatkową plasteliną. Podziel podniesioną platformę wzdłuż na dwie mniej więcej równe połówki za pomocą żyletki.Uformuj dwie połówki w kanał, tak aby mieścił się w długości dorosłej ryby. Użyj dodatkowej gliny do budowy ścian, aby zabezpieczyć 2/3 ciała ryby z odsłoniętą głową. Uformuj małą podporę w odsłoniętym obszarze głowy prostopadłą do ścian, aby uniknąć obrotu lub odrzutu głowy w przypadku urazu.Upewnij się, że boki kanału nie utrudniają upuszczonego ciężaru. Użyj mini dziurkacza, aby stworzyć 3-milimetrową stalową tarczę z obróbki blacharskiej o grubości 22 mm. Umieść znieczuloną rybę, która nie reaguje na szczypanie ogona, na glinianej formie w kanale grzbietem do góry, tak aby jej ciało było zabezpieczone po bokach.Umieść 3-milimetrową stalową tarczę o grubości 22 na głowie, wyśrodkowaną nad żądanym punktem uderzenia. Ustaw rybę prostopadle, aby uniknąć przechylenia jej głowy na jedną stronę, co mogłoby spowodować nierównomierne uderzenie. Użyj standardowego stojaka pierścieniowego i ramienia clamp, aby zabezpieczyć stalową lub plastikową rurkę, upewniając się, że jest prosta, tak aby spód rurki znajdował się 1.5 centymetra nad głową danio pręgowanego.Spójrz w dół rurki, aby upewnić się, że jest wyrównana nad stalową płytą. Wybierz odpowiednie łożysko kulkowe w zależności od pożądanej skali urazu. Upuść łożysko kulkowe z określonej wysokości w dół rurki na stalową płytę.Następnie umieść zranioną rybę w zbiorniku regeneracyjnym, który ma być monitorowany. Wypełnij szalkę Petriego plasteliną i utwórz małą jamę, aby podeprzeć ciało podczas sekcji. Umieść rybę w glinianej foremce grzbietem do góry.Umieść dwie szpilki preparacyjne, jedną przez linię środkową w połowie długości ciała, a drugą około 5 milimetrów za podstawą głowy. Użyj pary 5 kleszczy Dumonta, aby tępo przeciąć nerw wzrokowy i usunąć oczy. Umieść jeden koniec 5 kleszczy pod prawą płytką ciemieniową.Wykonaj celowy ruch nożycami, przesuwając się w kierunku końca rostralnego i usuń prawą płytkę przednią. Następnie obróć rybę o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Umieść jeden koniec 5 kleszczy pod lewą płytką ciemieniową i tym samym ruchem nożycowym usuń lewą płytkę ciemieniową i czołową, odsłaniając całą grzbietową część mózgu.Użyj 5 kleszczy, aby tępo przeciąć szczękę, tak aby opuszki węchowe zostały zachowane i nie zostały uszkodzone. Za pomocą tych samych kleszczy usuń prawe wieczko, przedopercle, interopercle i subopercle. Następnie tępo wytnij mięśnie na ogonowym końcu kalwarii, aby odsłonić rdzeń kręgowy.Za pomocą kleszczy tępo przeciąć rdzeń kręgowy. Ostrożnie umieść kleszcze pod mózgiem i delikatnie usuń mózg z kalwarii. Przeprowadź sekcję całego mózgu lub obszaru zainteresowania, korzystając z instrukcji zawartych w manuskrypcie tekstu, i natychmiast umieść mózg na małej łodzi do ważenia za pomocą cienkich kleszczy, uważając, aby nie dźgnąć ani nie zadrapać mózgu.Przenieś mózg do tarowanej łodzi do suszenia i zapisz mokrą masę mózgu. Ustaw mózgi tak, aby ułożyły je płasko na łodzi do ważenia, stroną grzbietową skierowaną do góry. Następnie umieść mózg i suszącą łódź wagową w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 60 stopni Celsjusza na osiem godzin.Aby przenieść mózg do nowej, wytarowanej małej łodzi do ważenia po wyschnięciu, ściśnij cienkie kleszcze i zaczynając od brzusznej strony mózgu, zgarnij je ruchem w górę. Wykonaj częściowe nacięcie na mokrej gąbce. Umieszczaj jedną rybę na raz w otworze brzuszną stroną do góry i za pomocą igły o rozmiarze 30 wstrzyknij około 40 mikrolitrów 10-milimolowego EdU do ciała ryby.Następnie zawróć rybę do zbiornika napełnionego wodą systemową. Zbierz mózgi, jak wspomniano wcześniej, i umieść je jako grupę w 9-mililitrowej szklanej fiolce zawierającej 2 mililitry dziewięciu części 100% etanolu i jednej części 37% formaldehydu. Zamocuj mózg w temperaturze 4 stopni Celsjusza na platformie kołyskowej.Użyj uchwytu do kriostatu, aby osadzić mózgi w TFM w żądanej orientacji na suchym lodzie. Stwierdzono, że uraz naczyniowy jest jedną z najłatwiejszych i najbardziej znanych patologii do zidentyfikowania udanego urazu za pomocą tego modelu. Zdolność do identyfikacji wskaźnika zmieniała się wraz ze szczepem ryb używanych podczas urazu.Identyfikacja uszkodzenia naczyń krwionośnych u dzikiego typu AB była trudna do rozróżnienia między łagodnym lub umiarkowanym TBI a nieuszkodzonymi rybami kontrolnymi ze względu na pigmentację. Po urazie łagodne ryby TBI wykazywały minimalne otarcia powierzchniowe, podczas gdy umiarkowane ryby TBI wykazywały ograniczony krwotok mózgowy. Zakres urazu był widoczny u ryb z ciężkim TBI.W przeciwieństwie do tego, uszkodzenie naczyń krwionośnych można łatwo zidentyfikować przy użyciu ryb albinosów lub Casperów. Obrzęk mózgu spowodowany urazem oceniano za pomocą obrzęku. W przeciwieństwie do tego, zarówno umiarkowane, jak i ciężkie TBI miały znaczny obrzęk, 1 dpi i 3 dpi, ale zawartość płynów zarówno w umiarkowanym TBI, jak i ciężkim TBI powróciła do poziomów przypominających nieuszkodzone kontrole o 5 dpi.To uszkodzenie spowodowało silną odpowiedź proliferacji komórek obejmującą oś nerwową. Zwiększone znakowanie EdU zaobserwowano w strefach komorowych i podkomorowych przodomózgowia w porównaniu z nieuszkodzonymi kontrolami. Uszkodzone mózgi wykazywały zwiększone znakowanie EdU w okołokomorowej szarej strefie, optycznych płatach tektalnych i aspektach przedniego podwzgórza w porównaniu z nieuszkodzonym mózgiem ryby.Po ciężkim TBI neurogenne regiony w tyłomózgowiu wykazywały zwiększoną proliferację komórek w porównaniu z nieuszkodzonym mózgiem. Aby prawidłowo wywołać uraz, upewnij się, że ryby są zabezpieczone i stabilne w formie, a rurka jest prosta, aby uniknąć uderzenia poza środkiem lub zmienić trajektorię spadku masy. Procedura ta zapewnia szybką i opłacalną metodę indukcji urazów siłą zastosowaną do modelu regeneracyjnego, która byłaby szczególnie przydatna w przypadku powtarzających się urazów głowy lub badań regeneracyjnych wywołanych urazem.

a-scalable-model-to-study-effects-blunt-force-injury-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę badania uszkodzeń mózgu larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM), techniki, która łączy elementy zarówno skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jak i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem próbek i pozyskiwaniem obrazów STEM o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji uszkodzenia mózgu.

Badanie uszkodzenia mózgu u larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W tym filmie zapłodnione zarodki danio pręgowanego są dechorionowane pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie poddawane działaniu inhibitora syntezy cholesterolu, co prowadzi do rozwoju pęknięć naczyń krwionośnych i krwotoków mózgowych u larw. Larwy krwotoczne, rozpoznawalne po wyraźnych czerwonych plamach, są następnie oddzielane pod mikroskopem w celu dalszej analizy.

Modelowanie krwotoku wywołanego lekami u larw danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów lokomotorycznych i zapalenia nerwowego po krwawieniu do mózgu u larw danio pręgowanego, w kontekście ludzkiego krwotoku śródmózgowego (ICH).

Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Zdolny do funkcjonalnego powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego, dorosły danio pręgowany jest głównym modelowym systemem do wyjaśnienia wrodzonych mechanizmów regeneracji neuronów. Tutaj opisujemy testy wytrzymałości pływackiej i zachowania podczas pływania jako funkcjonalne odczyty regeneracji rdzenia kręgowego.

Ocena wytrzymałości pływackiej i zachowań związanych z pływaniem u dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje model kriouszkodzeń w celu wywołania głębokiego uszkodzenia kilku miomerów ogonowych u dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia nowe podejście do badania regeneracji mięśni szkieletowych po ciężkiej utracie tkanki u kręgowców innych niż ssaki.

Model kriouszkodzeń do badania regeneracji mięśni szkieletowych szypułki ogonowej u dorosłych danio pręgowanych

Ten protokół oferuje metodę badania dynamiki komórkowej za pomocą prostej techniki hodowli in vitro. Jest to okazja dla badaczy i edukatorów danio pręgowanego do badania procesów komórkowych, takich jak te związane z homeostazą kości i podstawową biologią komórki, poprzez wizualizację jąder fluorescencyjnych i komórek apoptotycznych w łuskach.

Technika hodowli in vitro do badania dynamiki komórkowej w łuskach danio pręgowanego

Poznaj skalowalny model urazów mózgu u dorosłych Danio rerio wykorzystujący metodę upuszczania ciężaru. Ta technika pozwala badać mechanizmy regeneracji neuronalnej i odpowiedzi komórkowe po urazach o różnym nasileniu.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów