Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda
23 września 2021
Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.
Protokół ten pokazuje produkcję transgenicznego robaka Fall Armyworm przy użyciu systemu transformacji opartego na piggyBac. Mamy nadzieję, że te metody przyniosą korzyści w poprawie transformacji, nie tylko u robaka jesiennego, ale także u owadów z rzędu lepidoptera. Opisana tutaj metoda sprawia, że transformacja linii zarodkowej owadów szkodników z rzędu Lepidoptera jest wydajna.
Procedurę zademonstruje dr Xien Chen, adiunkt w moim laboratorium. Zacznij od umieszczenia w pudełku 12 poczwarek męskich i 12 poczwarek żeńskich. Umieść 10% roztwór sacharozy w pudełku do karmienia dorosłych.
Przykryj pudełko ręcznikiem papierowym. Drugiego dnia po eklozji wystaw dorosłe osobniki na intensywne światło przez noc. Trzeciego dnia po eklozji przenieś dorosłe osobniki do ciemnego miejsca.
Zbierz zarodki w ciągu dwóch godzin po przemieszczeniu się. Dodaj krople wody do kawałka ręcznika papierowego ze świeżymi jajkami trzymanymi na szalce Petriego na lodzie. Delikatnie przenieś jajka na szklane szkiełko za pomocą cienkiego pędzelka i wyrównaj je jedno po drugim na szklanym szkiełku.
Utrzymuj szkiełka podstawowe z jajami ustawionymi na lodzie przed mikrowstrzyknięciem. Wstrzyknąć mieszaninę 200 nanogramów na mikrolitr EGFP na bazie piggyBac eksprymującego plazmid, 200 nanogramów na mikrolitr nadpobudliwej transpozazy piggyBac mRNA i sterylnej wody destylowanej do jaj przy użyciu ciśnienia kompensacyjnego automatycznego mikrowstrzykiwacza. Utrzymuj wstrzyknięte jaja w temperaturze 27 plus minus jeden stopień Celsjusza, 60 plus minus 10% wilgotności względnej do momentu wyklucia.
Nakarm wyklute larwy sztuczną dietą i przenieś każdą larwę do jednej małej filiżanki we wczesnej fazie twarogu i gwiazdy. Zbierz poczwarki i umieść około 150 poczwarek żeńskich i 150 męskich w klatce. Zawieś w klatce kilka kawałków ręczników papierowych o wymiarach 30 na 15 centymetrów, aby zebrać jaja.
Codziennie zbieraj ręczniki papierowe z jajkami i przechowuj jaja w odpowiednich warunkach do momentu wyklucia. Trzymaj nowonarodzone larwy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby je unieruchomić, a następnie przenieś je na lodowatą płytkę. Przesiewaj unieruchomione larwy noworodków pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
Wybierz noworodki z dodatnim wynikiem EGFP, podnieś je do stadium poczwarki, w ciągu około dwóch tygodni w temperaturze 27 plus minus jeden stopień Celsjusza. Nadpobudliwe mRNA transpozazy piggyBac zsyntetyzowane in vitro wykryto przy użyciu 1% żelu agarozowego. Zarodki, którym wstrzyknięto PDS, nie wykazywały sygnału EGFP, podczas gdy plazmid eksprymujący EGFP i nadpobudliwe zarodki, którym wstrzyknięto mRNA transpozazę piggyBac, wykazywały fluorescencję EGP, co wskazuje, że budowa piggyBac zakończyła się sukcesem.
Larwy G1 uzyskane z jaj powstałych w wyniku samokrzyżowania dorosłych osobników G0 wykazywały silny sygnał EGFP. Fragment zawierający promotor i fragment EGFP udało się namnażać przy użyciu genomowego DNA wyizolowanego z larw EGFP-dodatnich jako matrycy. Jednak ten sam fragment nie został wykryty, gdy genomowe DNA zostało wyizolowane z larw typu dzikiego jako matryca.
Jaja do mikroiniekcji powinny być jak najbardziej świeże i zawsze muszą być trzymane na lodzie przed mikroiniekcją, aby spowolnić ich rozwój. Technika ta toruje naukowcom drogę do odpowiedzi na pytania z zakresu genomiki funkcjonalnej owadów szkodników i opracowania metod kontroli genetycznej tego globalnego szkodnika.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół skutecznej transformacji linii zarodkowej u omacnicy jesiennej, Spodoptera frugiperda, z wykorzystaniem systemu transformacji opartego na piggyBac. Metoda ta obiecuje poprawę wydajności transformacji u szkodników z rzędu motyli oraz usprawnia badania z zakresu genomiki funkcjonalnej u tych organizmów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Inżynieria genetyczna owadów szkodników
- Techniki biologii transformacyjnej
- Zastosowania genomiki funkcjonalnej
Wstęp
- Omacnica jesienna jest istotnym szkodnikiem rolniczym.
- System transpozonu piggyBac jest znany z wysokiej wydajności w dostarczaniu genów.
- Doskonalenie transformacji linii zarodkowej jest kluczowe dla strategii zwalczania szkodników.
Zastosowane metody
- Mikroiniekcja jaj plazmidem piggyBac i mRNA
- Spodoptera frugiperda jako model biologiczny
- Mikroskopia fluorescencyjna do przesiewania larw transgenicznych
Główne wyniki
- Pomyślna ekspresja EGFP w larwach transgenicznych potwierdziła funkcjonalność systemu piggyBac.
- Ekspresję EGFP zweryfikowano poprzez amplifikację DNA genomowego, co pozwoliło odróżnić larwy transgeniczne od larw typu dzikiego.
- Technika transformacji okazała się wydajna w otrzymywaniu genetycznie zmodyfikowanych owadów szkodników.
Wnioski
- Badanie ustanawia solidną metodę transformacji linii zarodkowej u Spodoptera frugiperda.
- Wyniki przyczyniają się do rozwoju środków genetycznej kontroli szkodników rolniczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie wydajnej transformacji linii zarodkowej u szkodników rolniczych, takich jak omacnica jesienna, umożliwia prowadzenie badań z zakresu genomiki funkcjonalnej w celu walidacji celów oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w procesach opracowywania metod zwalczania szkodników. Niniejszy protokół wspiera wczesną fazę odkryć, zapewniając skalowalny system do badania funkcji genów i oceny wyników fenotypowych w istotnym dla danej jednostki chorobowej modelu owadzim. Skuteczna transgeneza ułatwia późniejszą analizę przesiewową i odkrywanie biomarkerów dla genetycznych strategii zarządzania szkodnikami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę genów szkodników w celu walidacji celów dla strategii kontroli genetycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system generowania linii transgenicznych dla spójnej oceny celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zakłócenia działania genów z efektami fenotypowymi w modelu szkodnika.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie linii z fluorescencyjnymi reporterami do wysokoprzepustowego przesiewania perturbacji genetycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane genotypowanie oparte na PCR oraz TAIL-PCR w celu walidacji miejsca insercji.
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie stabilnych szczepów transgenicznych odpowiednich do przesiewania związków i analiz fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy walidację genów w fazie odkryć z przedkliniczną oceną mechanizmów kontroli genetycznej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Ułatwia ocenę istotności genu oraz wpływu fenotypowego przed zastosowaniem w warunkach polowych.
- Dostosowanie biomarkerów: Wspiera identyfikację markerów genetycznych związanych z cechami podatności lub odporności.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając walidację celu poprzez transgenezę, wspierając identyfikację związków wiodących za pomocą screeningu fenotypowego oraz dostarczając podstaw do decyzji przedklinicznych dzięki stabilnym modelom genetycznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie nokautu lub nadekspresji genów u omacnicy jesionnicy w celu oceny istotności celu.
- Przesiewanie: Umożliwia tworzenie zestandaryzowanych linii transgenicznych do powtarzalnego przesiewania modulatorów genetycznych lub chemicznych.
- Analityka: Zapewnia odczyty z qPCR i fluorescencji w celu pomiaru poziomów integracji i ekspresji transgenu.
- Badania translacyjne: Łączy odkrywanie funkcji genów z przedkliniczną oceną metod genetycznej kontroli szkodników.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę transgenezy, którą można zastosować u różnych gatunków szkodników z rzędu Lepidoptera w celu walidacji celów w całym portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośrednią manipulację genetyczną w modelu szkodnika.
- Wartość operacyjna: Dostarcza skalowalny, powtarzalny system transgenezy ze zestandaryzowanymi protokołami mikroiniekcji i przesiewania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niepewności biologicznej w zakresie niezbędności celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o walidację fenotypową in vivo w modelu szkodnika.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie embriologii owadów i technik mikroiniekcji.
- Wymagany jest zautomatyzowany mikroiniektor, stereomikroskop fluorescencyjny oraz sprzęt do PCR w celu walidacji.
- Wymagane są ustandaryzowane protokoły zbioru zarodków, warunków iniekcji oraz screeningu transgenicznego we wszystkich zespołach.
- Wymagana jest adaptacja protokołów temperatury, wilgotności i diety dla różnych gatunków motyli (Lepidoptera).
- Metoda jest zależna od jakości i świeżości zarodków, a efektywność mikroiniekcji jest uwarunkowana czasem rozwoju.
