Name: Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Poznaj metodę nadpobudliwej transformacji linii zarodkowej za pomocą transpozonu piggyBac u Spodoptera frugiperda. Technika mikroiniekcji jaj z wykorzystaniem EGFP umożliwia efektywną produkcję organizmów transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przedstawione badania są wspierane przez National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, w ramach grantu nr IIP-1821936 oraz przez partnerów przemysłowych, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant nr 2019-67013-29351 oraz National Institute of Food and Agriculture, Departament Rolnictwa USA (2019-67013-29351 i 2353057000).

1. Synteza mRNA hyPBazy in vitro
UWAGA: Kompletna sekwencja kodująca sekwencji hyPBazy została zsyntetyzowana i wstawiona do wektora pTD1-Cas9 (patrz Tabela Materiałów) w celu wytworzenia konstruktu pTD1-hyPBazy, który zawiera kasetę eksprymującą hyPBazę, promotor T7: polihedryna-5' UTR: hyPBaza: polihedryna-3' UTR: poli (A). Pełna sekwencja konstruktu pTD1-hyPBazy znajduje się w materiale uzupełniającym.
<ol>
	<li>Przygotowanie matrycy do syntezy in vitro
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcję PCR w celu amplifikacji kasety z ekspresją hyPBazy za pomocą startera do przodu, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' i startera odwrotnego 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerazy o wysokiej wierności i plazmidu pTD1-hyPBazy jako matrycy. 
		UWAGA: Reakcja PCR (końcowa objętość 50 μL) zawiera 5,0 μL 10x buforu reakcyjnego, 4,0 μL 10 mM trifosforanu deoksynukleozydu (dNTP), 1,0 μL plazmidu (50 μg/μL), 1,0 μl polimerazy o wysokiej wierności, po 10 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 33 μL wody wolnej od nukleaz. Ustawienia były następujące: początkowa inkubacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 15 s i 68 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Sprawdź produkt PCR na 1% żelu agarozowym przy 120 V w świeżym buforze kwasu tris-octanowo-etylenodiaminowego (TAE) przez 30 minut i oczyść produkt za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. 
		UWAGA: Nie używaj zestawu do oczyszczania produktu PCR. Nawet śladowa ilość plazmidu pTD1-hyPBazy znacznie obniża efektywność syntezy in vitro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza in vitro mRNA hyPBazy przy użyciu komercyjnego zestawu
	<ol>
		<li>Całkowicie rozmrozić zamrożone odczynniki, utrzymać enzym i 2x roztwór NTP/CAP na lodzie i pozostawić rozmrożony 10-krotny bufor reakcyjny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej, dodając następujące składniki: 2x roztwór NTP/CAP: 10 μL; 10x Bufor reakcyjny: 2 μL; Matryca DNA: 0,1-0,2 μg; Mieszanina enzymów: 2 μL; Woda wolna od nukleaz do 20 μl.</li>
		<li>Odczynniki dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując mieszaninę w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie zsyntetyzowanego mRNA przez wytrącanie chlorku litu
	<ol>
		<li>Dodać 30 μl roztworu strącającego LiCl, dokładnie wymieszać, przesuwając probówkę, a następnie utrzymywać w temperaturze -20 °C przez ≥ 30 minut.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Umyj osad raz 1 ml 70% etanolu, ponownie odwiruj i ostrożnie usuń supernatant.</li>
		<li>Wysuszyć osad w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty, a następnie ponownie zawiesić osad w 20-40 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1 μl roztworu mRNA w 9 μl wody wolnej od nukleaz. Weź 2 μl, aby oznaczyć stężenie mRNA i użyj 8 μl, aby sprawdzić jakość mRNA na 1% żelu agarozowym przy 100 V w świeżym buforze TAE przez 40 minut.</li>
		<li>Podwielokrotnić roztwór mRNA i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -70 °C przez okres do jednego roku. 
		UWAGA: Nie susz całkowicie granulki mRNA; Może być trudniej rozpuścić go w wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Kolekcja jaj
	<ol>
		<li>Umieść 12 poczwarek płci męskiej i 12 poczwarek żeńskich w pudełku o wymiarach 15 cm x 15 cm x 10 cm. Przykryj pudełko ręcznikiem papierowym. Umieść 10% roztwór sacharozy w pudełku do karmienia dorosłych.</li>
		<li>W 2 dniu po eklacji wystaw dorosłe osobniki na intensywne światło przez noc.</li>
		<li>W 3 dniu po ewakuacji przenieś dorosłe osobniki z kroku 2.1.2 do ciemnego miejsca. Zbierz zarodki w ciągu 2 godzin po złożeniu jaj</li>.
		<li>Dodaj krople wody do kawałka ręcznika papierowego ze świeżymi jajkami trzymanymi na szalce Petriego na lodzie. Delikatnie przenieś jajka na szklane szkiełko za pomocą cienkiego pędzelka i wyrównaj je jedno po drugim na szklanym szkiełku. Szklane szkiełka z wyrównanymi jajami należy przechowywać na lodzie przed mikrowstrzyknięciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja mikroiniekcji
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć do jaj mieszaninę transgenicznego plazmidu eksprymującego białko zielonej fluorescencji (EGFP) (200 ng / μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, mRNA hyPBazy (200 ng / μL) i sterylnej wody destylowanej, stosując ciśnienie kompensacyjne automatycznego mikrowstrzykiwacza (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przechowywać wstrzyknięte jaja w temperaturze 27 ± 1 °C, wilgotności względnej 60 ± 10% aż do wyklucia.</li>
		<li>Nakarm wyklute larwy sztuczną dietą i przenieś każdą larwę do jednego małego kubka na początku 3. stadium rozwojowego (~6 mm długości, a kolor ciała zmienia kolor na).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Badania przesiewowe fluorescencji i krzyżowanie genetyczne
<ol>
	<li>Zbierz poczwarki i umieść ~150 poczwarek żeńskich i ~150 poczwarek męskich w klatce o wymiarach 35 cm x 35 cm x 35 cm. Zawieś kilka kawałków ręczników papierowych (~30 cm x 15 cm) w klatce, aby zebrać jaja.</li>
	<li>Codziennie zbieraj ręczniki papierowe z jajkami i przechowuj jaja w temperaturze 27 ± 1 °C, wilgotności względnej 60 ± 10% aż do wyklucia.</li>
	<li>Utrzymuj larwy noworodków w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby je unieruchomić, a następnie przenieś je na lodowatą płytkę.</li>
	<li>Przebadaj unieruchomione larwy noworodków pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Wybrać noworodki z dodatnim wynikiem EGFP, podnieść je do stadium poczwarki w ciągu ~2 tygodni w temperaturze 27 ± 1 °C i rozdzielić według płci zgodnie z różnicami fenotypowymi w brzusznych segmentach brzucha. 
	UWAGA: Poczwarka samicy ma szczelinowy otwór narządów płciowych na ósmym segmencie brzusznym, a brzegi głowowe dziewiątego i dziesiątego segmentu zakrzywiają się w kierunku otworu narządów płciowych. Otwór narządów płciowych poczwarki samca ma niewielkie uniesienie na dziewiątym segmencie brzucha.</li>
	<li>Poczwarki EGFP-dodatnie i poczwarki typu dzikiego płci przeciwnej umieścić w klatce w stosunku samiec do samicy 1:1. Sib-krzyżuj dorosłe osobniki wykazujące ekspresję EGFP, aby wytworzyć kolejne pokolenia.</li>
</ol>
4. Wykrywanie insercji transgenicznej metodą PCR
<ol>
	<li>Ekstrahować genomowe DNA z pojedynczych larw typu dzikiego i EGFP za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR, używając genomowego DNA jako matrycy; starter do przodu, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' zlokalizowany w regionie promotora ie1; i starter odwrotny, 5'- aagcactgcgccgtaggtcag' zlokalizowany w regionie EGFP wektora transformacji.</li>
	<li>Ustaw każdą reakcję PCR (końcowa objętość 40 μl) tak, aby zawierała 20 μl mieszaniny polimerazy, 1,0 μl genomowego DNA (40 μg/μl), po 1,0 μl starterów do przodu i do tyłu po 10 μM oraz 17 μl wody wolnej od nukleaz. Stosować następujące ustawienia: początkowa inkubacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 20 s, 56 °C przez 20 s i 68 °C przez 40 sekund.</li>
	<li>Sprawdzaj produkty PCR na 1% żelu agarozowym przy 120 V przez 30 minut.</li>
</ol>
5. Określenie miejsca insercji transgenicznej
<ol>
	<li>Wykonaj wysokowydajny TAIL-PCR przy użyciu genomowego DNA jako matrycy w celu określenia miejsca integracji insercji transgenu u owadów z dodatnim wynikiem EGFP.
	<ol>
		<li>Wykonaj reakcje PCR, postępując zgodnie z krokami opisanymi w innym miejscu9.
		<ol>
			<li>Użyj trzech starterów, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3' i P3: 5'-atgtcctaaatgcacacagcgacgcct-3', które są specyficzne dla wektora piggyBac, odpowiednio w 3 rundach reakcji PCR.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie końcowych produktów PCR w celu określenia miejsca integracji.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transformation+with+piggyBac%3A+getting+the+number+of+injections+just+right%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niska szybkość transpozycji i trudności w dostarczaniu składników transgenicznych do świeżych zarodków ograniczają powodzenie transformacji linii zarodkowej u wielu owadów niemodelowych, zwłaszcza tych z rzędu Lepidoptera. Aby zwiększyć szybkość transformacji linii zarodkowej, opracowano nadpobudliwą wersję najpowszechniej stosowanej transpozazy piggyBac (hyPBazy) 7,10. Do tej pory udane przekształcenie linii zarodkowej u owadów z rzędu Lepidoptera odnot...

Jesienny robak wojenny (FAW), Spodoptera frugiperda, pochodzi z tropikalnych i subtropikalnych regionów Ameryki. Obecnie jest to niszczycielski owad roślinożerca w ponad 100 krajach na całym świecie1. Larwy FAW żywią się ponad 350 roślinami żywicielskimi, w tym niektórymi ważnymi podstawowymi roślinami spożywczymi2. Silna zdolność migracyjna dorosłych FAW przyczynia się do jej niedawnego szybkiego rozprzestrzeniania się z obu Ameryk do innych miejsc1,2. W rezultacie owad ten zagraża obecnie bezpieczeństwu żywnościowemu na całym świecie. Zastosowanie nowych technologii może ułatwić zaawansowane badania nad FAW i dostarczyć nowych strategii zwalczania tego szkodnika.
Transformacja linii zarodkowej owadów została wykorzystana do badania funkcji genów i generowania transgenicznych owadów do wykorzystania w kontroli genetycznej3,4. Spośród różnych metod stosowanych do osiągnięcia transformacji genetycznej u owadów, najczęściej stosowaną metodą jest metoda oparta na elementach piggyBac5. Jednak ze względu na niski współczynnik transpozycji, przeprowadzenie transgenezy u owadów niemodelowych jest nadal trudne. Niedawno opracowano nadpobudliwą wersję transpozazy piggyBac (hyPBazy)6,7. Transformacja linii zarodkowej została osiągnięta w FAW niedawno8, co jest pierwszym raportem, w którym użyto hyPBazy u owadów z rzędu Lepidoptera. W niniejszym raporcie opisano szczegółowe informacje na temat wykorzystania mRNA hyPBazy do generowania transgenicznego FAW. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do osiągnięcia transformacji innych owadów z rzędu Lepidoptera.

<table><tbody><tr><td>1,5-calowe bawełniane rolki dentystyczne</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>REARING</td></tr><tr><td>1 uncja pokrywek do kubków sufletowych</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 uncja kubków sufletowych</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>HODOWLA</td></tr><tr><td>48 uncji Plastikowe pojemniki delikatesowe</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Dodatkowy zestaw filtrów (zielony)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>BF100-50-10</td><td>WTRYSK</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna</td><td>Nikon</td><td></td><td>SMZ745T SCREENING</td></tr><tr><td>Kleszcze piórkowe</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>HODOWLA</td></tr><tr><td>Osłona rynny</td><td>ThermWell Products</td><td>VX620</td><td>HODOWLA</td></tr><tr><td>Odwrócona Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>INIEKCJA</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>INIEKCJA</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>WTRYSK</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>WTRYSK</td></tr><tr><td>NightSea Pełny system</td><td>NightSea</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td>AWG/ Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Bounty</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>HODOWLA</td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda Artificial Diet</td><td>Southland Products, Inc</td><td>Nie dotyczy [zapytaj o gatunek/ilość]</td><td>HODOWLA</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Jaja</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [Zapytaj o gatunek/ilość]</td><td>HODOWLA Mieszanina</td></tr><tr><td>polimerazy</td> <td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggybac u jesiennego robaka wojskowego, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stabilne wprowadzanie ładunku genetycznego do genomów owadów za pomocą elementów transpozycyjnych jest potężnym narzędziem do funkcjonalnych badań genomicznych i opracowywania genetycznych strategii zwalczania szkodników. Najczęściej stosowanym elementem transpozycyjnym w transformacji owadów jest piggyBac, a transformacja linii zarodkowej oparta na piggyBac została z powodzeniem przeprowadzona u owadów modelowych. Jednak nadal trudno jest zastosować tę technologię w przypadku owadów niemodelowych, do których należą szkodniki rolnicze. W artykule przedstawiono transformację linii zarodkowej globalnego szkodnika rolniczego, armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, przy użyciu nadpobudliwej transpozazy piggyBac (hyPBazy).
W tej pracy mRNA hyPBazy zostało wyprodukowane i użyte zamiast plazmidu pomocniczego w mikroiniekcjach zarodkowych. Ta zmiana doprowadziła do udanego wytworzenia transgenicznego FAW. Ponadto opisano metody badań przesiewowych zwierząt transgenicznych, szybkie wykrywanie insercji transgenu za pomocą PCR oraz termiczne oznaczanie miejsca integracji metodą PCR z przeplotem (tail-pcr). W związku z tym w niniejszej pracy przedstawiono protokół produkcji transgenicznego FAW, który ułatwi transgenezę opartą na piggyBac u FAW i innych owadów z rzędu Lepidoptera.

Przygotowano konstrukt do ekspresji hyPBase zawierający promotor T7: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: sygnał poly (A) (Ryc. 1A), który następnie namnożono jako fragment PCR o wielkości ~2.2 kb w celu syntezy mRNA hyPBase in vitro (Ryc. 1B). Następnie otrzymano mRNA hyPBase i poddano je elektroforezie w żelu agarozowym. mRNA o oczekiwanej wielkości (prążek ~1.1 kb) wykryto w 1% żelu agarozowym (Ryc. 1C).
<p c...

Udana transformacja linii zarodkowej u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda, została osiągnięta przy użyciu mRNA nadpobudliwej transposazy piggyBac.

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Protokół ten pokazuje produkcję transgenicznego robaka Fall Armyworm przy użyciu systemu transformacji opartego na piggyBac. Mamy nadzieję, że te metody przyniosą korzyści w poprawie transformacji, nie tylko u robaka jesiennego, ale także u owadów z rzędu lepidoptera. Opisana tutaj metoda sprawia, że transformacja linii zarodkowej owadów szkodników z rzędu Lepidoptera jest wydajna.Procedurę zademonstruje dr Xien Chen, adiunkt w moim laboratorium. Zacznij od umieszczenia w pudełku 12 poczwarek męskich i 12 poczwarek żeńskich. Umieść 10% roztwór sacharozy w pudełku do karmienia dorosłych.Przykryj pudełko ręcznikiem papierowym. Drugiego dnia po eklozji wystaw dorosłe osobniki na intensywne światło przez noc. Trzeciego dnia po eklozji przenieś dorosłe osobniki do ciemnego miejsca.Zbierz zarodki w ciągu dwóch godzin po przemieszczeniu się. Dodaj krople wody do kawałka ręcznika papierowego ze świeżymi jajkami trzymanymi na szalce Petriego na lodzie. Delikatnie przenieś jajka na szklane szkiełko za pomocą cienkiego pędzelka i wyrównaj je jedno po drugim na szklanym szkiełku.Utrzymuj szkiełka podstawowe z jajami ustawionymi na lodzie przed mikrowstrzyknięciem. Wstrzyknąć mieszaninę 200 nanogramów na mikrolitr EGFP na bazie piggyBac eksprymującego plazmid, 200 nanogramów na mikrolitr nadpobudliwej transpozazy piggyBac mRNA i sterylnej wody destylowanej do jaj przy użyciu ciśnienia kompensacyjnego automatycznego mikrowstrzykiwacza. Utrzymuj wstrzyknięte jaja w temperaturze 27 plus minus jeden stopień Celsjusza, 60 plus minus 10% wilgotności względnej do momentu wyklucia.Nakarm wyklute larwy sztuczną dietą i przenieś każdą larwę do jednej małej filiżanki we wczesnej fazie twarogu i gwiazdy. Zbierz poczwarki i umieść około 150 poczwarek żeńskich i 150 męskich w klatce. Zawieś w klatce kilka kawałków ręczników papierowych o wymiarach 30 na 15 centymetrów, aby zebrać jaja.Codziennie zbieraj ręczniki papierowe z jajkami i przechowuj jaja w odpowiednich warunkach do momentu wyklucia. Trzymaj nowonarodzone larwy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby je unieruchomić, a następnie przenieś je na lodowatą płytkę. Przesiewaj unieruchomione larwy noworodków pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.Wybierz noworodki z dodatnim wynikiem EGFP, podnieś je do stadium poczwarki, w ciągu około dwóch tygodni w temperaturze 27 plus minus jeden stopień Celsjusza. Nadpobudliwe mRNA transpozazy piggyBac zsyntetyzowane in vitro wykryto przy użyciu 1% żelu agarozowego. Zarodki, którym wstrzyknięto PDS, nie wykazywały sygnału EGFP, podczas gdy plazmid eksprymujący EGFP i nadpobudliwe zarodki, którym wstrzyknięto mRNA transpozazę piggyBac, wykazywały fluorescencję EGP, co wskazuje, że budowa piggyBac zakończyła się sukcesem.Larwy G1 uzyskane z jaj powstałych w wyniku samokrzyżowania dorosłych osobników G0 wykazywały silny sygnał EGFP. Fragment zawierający promotor i fragment EGFP udało się namnażać przy użyciu genomowego DNA wyizolowanego z larw EGFP-dodatnich jako matrycy. Jednak ten sam fragment nie został wykryty, gdy genomowe DNA zostało wyizolowane z larw typu dzikiego jako matryca.Jaja do mikroiniekcji powinny być jak najbardziej świeże i zawsze muszą być trzymane na lodzie przed mikroiniekcją, aby spowolnić ich rozwój. Technika ta toruje naukowcom drogę do odpowiedzi na pytania z zakresu genomiki funkcjonalnej owadów szkodników i opracowania metod kontroli genetycznej tego globalnego szkodnika.

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Poznaj metodę nadpobudliwej transformacji linii zarodkowej za pomocą transpozonu piggyBac u Spodoptera frugiperda. Technika mikroiniekcji jaj z wykorzystaniem EGFP umożliwia efektywną produkcję organizmów transgenicznych.

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda (Wideo) | JoVE Journal

Nadpobudliwa transformacja linii zarodkowej za pośrednictwem transpozy piggyBac u jesiennego robaka wojskowego, Spodoptera frugiperda

Przeglądaj więcej filmów