Name: Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania fluorescencyjnego z sondą ND6 do badania dynamiki błon lipidowych w żywych komórkach neuronowych. Technika ta umożliwia bezpośredni pomiar egzocytozy i endocytozy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) oraz NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

Poniższy protokół obejmuje (1) uproszczoną procedurę tworzenia kultur hipokampa i kory mózgu myszy w oparciu o dobrze udokumentowany protokół22, (2) krótki wstęp do konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego do obrazowania żywych neuronów, (3) szczegółowy opis wprowadzania i obrazowania ND6 w neuronach myszy, (4) omówienie kwantyfikacji transportu błonowego za pomocą sygnału ND6. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz IACUC na Florida Atlantic University. Synteza ND6 została opisana wcześniej20.
1. Przygotowanie kultur hipokampa i kory myszy
UWAGA: Jeśli nie określono inaczej, wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Należy wysterylizować wszystkie narzędzia i materiały.
<ol>
	<li>Użyć pęsety rozmiaru 5, aby umieścić szklane szkiełka nakrywkowe w wielodołkowych płytkach hodowlanych. 
	UWAGA: Na przykład płytka 24-dołkowa jest idealna dla szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm <img alt="Schemat równowagi statycznej, zasada ΣFx=0, ilustrująca równowagę sił, strzałki oznaczają wektory sił." src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość macierzy zewnątrzkomórkowej w celu pokrycia powierzchni hodowli komórkowej (np. 75 μL roztworu macierzy błony podstawnej na szkiełko nakrywkowe 12 mm <img alt="Schemat równowagi statycznej, zasada ΣFx=0, ilustrująca równowagę sił, strzałki oznaczają wektory sił." src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1">; patrz Tabela materiałów)</li>
	<li>Umieścić przygotowane płytki w inkubatorze do hodowli tkanek (5% CO2, 100% wilgotności i 37 °C) na 1-4 h, aby umożliwić sieciowanie macierzy błony podstawnej.</li>
	<li>Uśmiercić zwierzęta, otworzyć czaszkę i przenieść cały mózg do szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 3 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) z dodatkiem 20% płodowej surowicy bydlęcej (H+20). Przeciąć mózg wzdłuż linii środkowej, a następnie oddzielić korę i hipokampy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby ograniczyć kontaminację.</li>
	<li>Użyć mikronożyczek, aby pociąć tkanki na małe kawałki (~1 mm3). Przenieść tkanki do stożkowej probówki 15 mL zawierającej 5 mL H+20.</li>
	<li>Przemyć tkanki trzykrotnie 5 mL H+20 i trzykrotnie 5 mL HBSS.</li>
	<li>Dodać 1,5 mL 1% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym i inkubować w 37 °C przez 10 min w celu trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.6, a na koniec odessać HBSS za pomocą odkurzacza.</li>
	<li>Rozdzielić tkanki mechanicznie w 1 mL HBSS zawierającego 2,95 g/L MgSO4•7H2O, używając wypalonej szklanej pipety.</li>
	<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 400 × g, 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Odessać nadsącz i resuspendować komórki w odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie ~10 000 000 komórek/ml.</li>
	<li>Wysiać komórki w zagęszczeniu ~1 000 000 komórek/cm2 i umieścić hodowlę w inkubatorze (5% CO2, 100% wilgotności i 37 °C) na 1-4 h, aby ułatwić przyleganie komórek do szklanych szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość pożywki hodowlanej (np. 1 mL na dołek w płytce 24-dołkowej). Po 1 tygodniu dodać taką samą objętość pożywki. Po 2 tygodniach wymieniać połowę istniejącej pożywki na świeżą co tydzień.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek
UWAGA: Przykładowy zestaw do obrazowania (Rysunek 5) obejmuje co najmniej odwrócony mikroskop fluorescencyjny (patrz Tabela materiałów), źródło światła fluorescencyjnego z automatyczną migawką, zestawy filtrów fluorescencyjnych (np. dla obrazowania ND6 należy użyć 405/10 BP do wzbudzenia, 495 LP jako lustra dichroicznego i 510/20 BP do emisji) oraz kamerę o wysokiej czułości (Tabela materiałów), z których wszystkie są sterowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazu (Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przygotować komorę obrazowania umożliwiającą kontrolę temperatury oraz dopływ i odpływ roztworów do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. 
	UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano na przykład zmodyfikowaną otwartą komorę obrazowania zamocowaną na platformie grzewczej (Rysunek 6).</li>
	<li>Skonfigurować programowalne urządzenie do przełączania roztworów perfuzyjnych i dostarczania stymulacji elektrycznej w określonych punktach czasowych podczas obrazowania. 
	UWAGA: Synchronizacja sprzętu i oprogramowania jest niezbędna do analiz ilościowych (Rysunek 7). W tym protokole wykorzystano na przykład wyjście wyzwalające z kamery obrazującej do uruchomienia programu komputerowego sterującego automatycznym przełącznikiem, który z kolei kontroluje wielokanałowy system perfuzji oraz stymulator impulsów prostokątnych.</li>
	<li>W celu jednoczesnego obrazowania dwóch lub więcej reporterów fluorescencyjnych, przeprowadzić wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne poprzez sekwencyjne przełączanie zestawów filtrów lub jednoczesne rozdzielanie różnych emisji fluorescencji i rzutowanie ich na tę samą kamerę.</li>
</ol>
3. Obciążanie i obrazowanie ND6 w kulturach neuronalnych
<ol>
	<li>Odważ odpowiednią ilość ND6, rozpuść w dimetylosulfotlenku (DMSO) i pozostaw do całkowitego rozpuszczenia w temperaturze pokojowej; poddaj krótkiej sonikacji (np. 3 min). Przefiltruj surowy roztwór zapasowy przez filtr 0,22 μm, aby usunąć duże agregaty barwnika. Po filtracji wyznacz stężenie barwnika metodą spektroskopii absorpcyjnej przy 405 nm, korzystając z konwencjonalnego spektrofotometru lub spektrofotometru mikroobjętościowego, przyjmując ε = 10 700 M-1 cm-1.</li>
	<li>Przed zastosowaniem rozcieńcz roztwór zapasowy do stężenia 1 μM za pomocą roztworu kąpieli. Przechowuj roztwór zapasowy w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
	<li>Znakowanie endosomów i pęcherzyków synaptycznych
	<ol>
		<li>Aby powszechnie oznakować endocytowane przedziały błonowe, takie jak endosomy, dodaj roztwór zapasowy ND6 (np. 1 mM w DMSO) do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 1 µM i inkubuj przy 5% CO2, 100% wilgotności i 37 °C przez 30 min. Aby zmniejszyć stopień znakowania pęcherzyków synaptycznych (SV), stłum farmakologicznie spontaniczną aktywność neuronalną. Na przykład użyj tetrodotoksyny w celu zablokowania potencjałów czynnościowych lub 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]chinoksalin-7-sulfonamid (NBQX) oraz kwasu D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanowego (D-AP5) w celu zahamowania przekazywania pobudzającego23.</li>
		<li>Aby selektywnie oznakować SV, zastosuj krótką, ale silną stymulację w celu wywołania presynaptycznej egzo- i endocytozy. Po pierwsze, przenieś szkiełko nakrywkowe z kulturą do 35 mm <img alt="Schemat równowagi statycznej, zasada ΣFx=0, ilustrująca równowagę sił, strzałki oznaczają wektory sił." src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> szalki Petriego zawierającej 2 mL normalnego roztworu Tyrode'a w temperaturze pokojowej. Po drugie, rozcieńcz roztwór zapasowy ND6 w roztworze Tyrode'a z wysokim stężeniem K+ (90 mM KCl) do końcowego stężenia 1 μM. Po trzecie, zastąp normalny roztwór Tyrode'a w szalce Petriego roztworem Tyrode'a z wysokim stężeniem K+ zawierającym ND6 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś kulturę komórek oznakowanych ND6 do komory obrazowania wypełnionej podgrzanym normalnym roztworem Tyrode'a zawierającym 10 μM NBQX i 10 μM D-AP5.</li>
	<li>Ustaw prędkość perfuzji na ~0,2 mL/s (tj. 1 kropla na sekundę) i rozpocznij perfuzję podgrzanego normalnego roztworu Tyrode'a zawierającego NBQX i D-AP5, aby usunąć nadmiar ND6 z kultury.</li>
	<li>Ustaw ostrość i zlokalizuj odpowiednie pole widzenia zawierające zdrowe i dobrze rozprzestrzenione neurony z połączonymi neurytami. Unikaj obszarów zawierających nierozdzielone koloidy barwnika.</li>
	<li>Przeprowadź obrazowanie komórek obciążonych ND6 przy różnych czasach ekspozycji, aby zidentyfikować optymalne ustawienia obrazowania. 
	UWAGA: Dla optymalnego czasu ekspozycji najwyższa intensywność fluorescencji pikseli w otrzymanym obrazie powinna wynosić około połowy zakresu bitowego (np. dla obrazu 16-bitowego zakres ten wynosi od 0 do 65 535), co pozwoli na dalszy wzrost fluorescencji po zastosowaniu kwaśnego roztworu kąpieli. Wybrany czas ekspozycji należy stosować we wszystkich pomiarach obrazowania ND6.</li>
	<li>Ustaw protokół stymulacji i perfuzji, odstęp między klatkami oraz całkowity czas trwania. Na przykład w poniższym protokole zastosuj 30 s linii bazowej, 10 s stymulacji polem elektrycznym o częstotliwości 30 Hz, 50 s regeneracji, 120 s 90 mM K+, 60 s regeneracji, 60 s roztworu Tyrode'a z 50-mM NH4Cl, 60 s roztworu Tyrode'a o pH 5,5 oraz odstęp między klatkami wynoszący 3 s.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazów wraz z zsynchronizowaną stymulacją i perfuzją. Monitoruj stymulację i wymianę roztworów podczas obrazowania.</li>
	<li>Zatrzymaj perfuzję po zakończeniu obrazowania, usuń szkiełko nakrywkowe i oczyść komorę obrazowania przed kolejną próbą.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja transportu błonowego poprzez zmianę fluorescencji ND6
<ol>
	<li>Utwórz kopię zapasową i/lub elektroniczną kopię wszystkich plików obrazów.</li>
	<li>Wybierz program analityczny do ekstrakcji danych, np. oprogramowanie do analizy obrazu typu open-source, takie jak ImageJ24 i/lub FIJI25.</li>
	<li>Otwórz lub zaimportuj stos obrazów do programu analitycznego.</li>
	<li>Ustaw pierwszy obraz jako referencyjny i wyrównaj pozostałe względem niego, korzystając z funkcji/wtyczek takich jak Rigid Registration26, co pozwoli zminimalizować artefakty wynikające z dryftu w osiach xy. Przykładowe obrazy przedstawiono na Rysunku 8.</li>
	<li>Wyciągnij średnią ze wszystkich obrazów pozyskanych podczas 30-s fazy przed bazową, aby utworzyć obraz referencyjny. Zapisz kopię tego obrazu do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Ustaw próg intensywności w celu wygenerowania obrazu binarnego z obrazu uśrednionego bazowo.</li>
	<li>Użyj funkcji Watershed w ImageJ lub podobnych funkcji w innym programie, aby oddzielić połączone neuryty lub komórki.</li>
	<li>Użyj funkcji Analyze Particle z odpowiednio dobraną wielkością obszaru i kolistością, aby wyznaczyć obszary zainteresowania (ROIs) odpowiadające błonom komórkowym, endosomom, lizosomom lub pączkom synaptycznym. Zapisz wszystkie wybrane ROIs.</li>
	<li>Wybierz cztery ROIs tła w obszarach wolnych od komórek w obrębie pola widzenia.</li>
	<li>Zmierz średnią intensywność pikseli dla każdego ROI w każdej klatce stosu obrazów, a następnie wyeksportuj wyniki do analizy statystycznej.</li>
	<li>Oblicz średnią intensywność ROIs tła jako szum bazowy, który zostanie odjęty od średnich intensywności pikseli dla każdego ROI.</li>
	<li>Wyciągnij średnią z trzech najwyższych średnich intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji roztworu Tyrode'a o pH 5.5, aby uzyskać maksymalną intensywność fluorescencji, którą definiuje się jako 100% do celów normalizacji.</li>
	<li>Wyciągnij średnią z trzech najniższych średnich intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji 50 mM NH4Cl, aby ustalić minimalną intensywność fluorescencji, którą definiuje się jako 0% do celów normalizacji.</li>
	<li>Oblicz względne zmiany fluorescencji dla każdego ROI na podstawie jego własnych intensywności 0% i 100%. Na podstawie danych z poszczególnych ROI wyznacz średnie zmiany fluorescencji, kinetykę zmian oraz inne wartości/wykresy.</li>
</ol>

<ol><li>Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).</li>
<li>Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+and+beta-amyloid%3A+a+harmful+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Pept+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection.</a> Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).</li>
<li>Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis%3A+proteins+and+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis: proteins and perturbations.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).</li>
<li>Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+regulated+exocytosis%3A+what+are+they+doing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipids in regulated exocytosis: what are they doing.</a> Frontiers in Endocrinology. 4, 125(2013).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112 (4), 519-533 (2003).</li>
<li>Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+cellular+membranes%3A+a+convergence+with+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386(2017).</li>
<li>Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+pHluorin+for+quantitative%2C+kinetic+and+high-throughput+analysis+of+endocytosis+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587(2016).</li>
<li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
<li>Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biophysical+properties+of+lipid+membranes+by+environment-sensitive+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).</li>
<li>Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+recycling+by+staining+and+destaining+vesicles+with+FM+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).</li>
<li>Gaus, K., Zech, T., Harder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+membrane+microdomains+by+Laurdan+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy.</a> Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).</li>
<li>Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pH-sensitive+lipid+based+exo-endocytosis+tracers+reveal+fast+intermixing+of+synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18(2018).</li>
<li>Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+of+molecular+probes+based+on+the+fluorophore+4-amino-1%2C8-naphthalimide%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide.</a> Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).</li>
<li>Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l%2C8-Naphthalimide+based+DNA+intercalators+and+anticancer+agents.+A+systematic+review+from+2007+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).</li>
<li>Ulla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+emitting+1%2C8-naphthalimides+with+electron+transport+properties+for+organic+light+emitting+diode+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications.</a> Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).</li>
<li>Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+anion+sensors%3A+An+overview+of+recent+developments+in+the+use+of+1%2C8-naphthalimide-based+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors.</a> Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).</li>
<li>Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+intramolecular+charge+transfer+%28ICT%29+process+in+push-pull+systems%3A+Effect+of+nitro+groups%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups.</a> RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+pH-sensitive+fluorescent+membrane+probes+for+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells.</a> ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).</li>
<li>Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+breadth+of+4-amino-1%2C8-naphthalimide+photophysical+properties+through+substitution+of+the+naphthalimide+core%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core.</a> Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).</li>
<li>Liu, G. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+synaptic+transmission+at+single+hippocampal+synaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons.</a> Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).</li>
<li>Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+provide+an+optical+signal+specific+to+full+collapse+fusion+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+chloride+alters+neuronal+excitability+and+synaptic+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5061(2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).</li>
<li>DelBove, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+modulation+between+amyloid+precursor+protein+and+synaptic+membrane+cholesterol+revealed+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging.</a> Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).</li>
<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Barwniki na bazie lipidów, takie jak 1,1′-dioktadecylo-3,3,3′,3′-tetrametyloindokarbocyjanina (DiI) i nadchloran 3,3′-dioktadecyloksakarbocyjaniny (DiO), od dawna są używane do ilustrowania morfologii komórek i śledzenia procesów komórkowych, takich jak projekcje aksonów neuronów. Barwniki styrylowe, takie jak FM1-43, zostały wynalezione i z powodzeniem stosowane do badania egzocytozy34. Ze względu na ich niskie powinowactwo do błony, selektywnie znakują pęcherzyki endocytozowane w miejscu, w któr...

Dwuwarstwa lipidowa jest jednym z najpowszechniejszych zespołów biomolekuł i jest niezbędna dla wszystkich komórek. Na zewnątrz komórek tworzy błonę plazmatyczną łączącą komórki i ich środowisko; Wewnątrz komórek dzieli się na przedziały różnych organelli wyspecjalizowanych w określonych funkcjach. Błony lipidowe są raczej dynamiczne niż nieruchome, ponieważ nieustannie doświadczają fuzji i rozszczepienia, co pośredniczy w transporcie biomateriału, reformie organelli, zmianie morfologii i komunikacji komórkowej. Niewątpliwie błona lipidowa jest fizyczną podstawą prawie wszystkich procesów komórkowych, a jej dysfunkcja odgrywa kluczową rolę w różnych zaburzeniach, począwszy od raka1 po chorobę Alzheimera2. Chociaż cząsteczki lipidów są znacznie mniej zróżnicowane niż białka, dotychczasowe badania nad błonami koncentrowały się głównie na białkach. Na przykład o wiele więcej wiadomo o maszynerii białkowej niż o lipidach w egzocytozie3,4,5. Co więcej, organizacja, dystrybucja, dynamika i homeostaza lipidów na błonach powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w dużej mierze pozostają niezbadane w porównaniu z białkami błonowymi6.
To nie jest zaskakujące, ponieważ nowoczesne techniki biologii molekularnej, takie jak mutageneza, zapewniają metodologiczną przewagę w badaniu białek, a nie lipidów. Na przykład, transgeniczne znakowanie wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji (znanego również jako pHluorin) do białek pęcherzykowych ułatwia ilościowy pomiar ilości i szybkości obrotu białek pęcherzykowych podczas egzo-/endocytozy7,8,9. Jednak genetyczna modyfikacja lipidów błonowych in vivo jest prawie niemożliwa. Co więcej, jakościowe, a nawet ilościowe manipulacje ilością i dystrybucją białek są znacznie bardziej wykonalne niż w przypadku lipids10. Niemniej jednak, natywne i syntetyczne lipidy fluorescencyjne zostały wyizolowane i opracowane w celu symulacji endogennych lipidów błonowych in vitro i in vivo11. Jedną z grup szeroko stosowanych lipidów fluorescencyjnych są barwniki styrylowe, np. FM1-43, które wykazują fluorescencję wzmocnioną błoną i są potężnym narzędziem w badaniu uwalniania pęcherzyków synaptycznych (SV) w neuronach12. Ostatnio wynaleziono wrażliwe na środowisko barwniki lipidowe i są one szeroko stosowane jako nowa klasa reporterów do badania różnych właściwości błony komórkowej, w tym potencjału błonowego11, phase order13 i secretion14.
Nowa klasa mimetyki lipidów, których fluorescencja jest zarówno wrażliwa na pH (np. pHluorin), jak i na błonę (np. FM1-43), została opracowana do bezpośredniego pomiaru dystrybucji lipidów w błonie plazmatycznej i endosomach/lizosomach oraz ruchu lipidów podczas egzo-/endocytozy. W tym celu wybrano dobrze znane fluorofory solwatochromowe wykazujące charakterystykę push-pull ze względu na wewnątrzcząsteczkową wymianę ładunku. Spośród istniejących fluoroforów solwatochromowych, rusztowanie 1,8-naftalimidowe (ND) jest stosunkowo łatwe do modyfikacji, wszechstronne do znakowania i jest unikalne w fotofizyce15 i dlatego było używane w interkalatorach DNA, organicznych diodach elektroluminescencyjnych i czujnikach biomolekuł16,17,18.
Dołączenie grupy oddającej elektrony do pozycji C4 rusztowania ND generuje strukturę push-pull, która prowadzi do zwiększenia momentu dipolowego poprzez redystrybucję gęstości elektronów w stanie wzbudzonym19,20. Takie wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie ładunku powoduje duże uzysk kwantowy i przesunięcia Stokesa, co skutkuje jasną i stabilną fluorescencją21. Grupa ta opracowała ostatnio serię solwatochromowych analogów lipidowych opartych na rusztowaniu ND i uzyskała je z dobrą wydajnością syntetyczną20.
Charakterystyka spektroskopowa pokazuje, że spośród tych produktów, ND6 posiada najlepsze właściwości fluorescencyjne (Rysunek 1)<klasa sup="xref">20. Po pierwsze, ma dobrze oddzielone piki wzbudzenia i emisji (tj. odpowiednio ~400 nm i ~520 nm, w <silnej klasie="xfig">Rysunek 2A,B) w porównaniu z popularnymi fluoroforami, takimi jak izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina lub GFP, dzięki czemu jest od nich spektralnie oddzielalny, a tym samym przydatny do obrazowania wielobarwnego. Po drugie, fluorescencja ND6 wykazuje ponad ośmiokrotny wzrost fluorescencji w obecności miceli (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C), co sugeruje silną zależność od błony. Wcześniejsze badania obrazowania fluorescencji żywych komórek z różnymi typami komórek wykazały doskonałe barwienie błony przez ND620. Po trzecie, gdy pH roztworu zmniejsza się z 7,5 (powszechnie występujące w środowiskach zewnątrzkomórkowych lub cytozolowych) do 5,5 (powszechnie występujące w endosomach i lizosomach), ND6 wykazuje około dwukrotny wzrost fluorescencji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2D), co pokazuje jego wrażliwość pH. Co więcej, symulacja dynamiki molekularnej wskazuje, że ND6 łatwo integruje się z dwuwarstwą lipidową z rusztowaniem ND skierowanym na zewnątrz błony i resztą piperazyny, wykazując silne interakcje z grupami głów fosfolipidów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Podsumowując, te cechy sprawiają, że ND6 jest idealnym fluorescencyjnym analogiem lipidów do wizualizacji i pomiaru obrotu lipidów w błonie podczas egzo-/endocytozy.
Ten artykuł przedstawia metodę badania szybkości obrotu i dynamiki lipidów SV przy użyciu hodowanych mysich neuronów hipokampa. Stymulując neurony roztworami Tyrode'a o wysokiej zawartości K+, SV i błonę plazmatyczną załadowano ND6 (<silna klasa = "xfig" >Figura 4A,B). Następnie neurony zostały ponownie stymulowane różnymi bodźcami, a następnie roztworami NH4Cl i pH 5,5 Tyrode (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4D). Protokół ten ułatwia ilościowy pomiar złożonych wskaźników egzocytozy i endocytozy w różnych okolicznościach (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A Data Acquistion System</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td>Do zsynchronizowanej stymulacji i wymiany roztworów</td></tr><tr><td>Dwukanałowy regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>Do sporządzania roztworu H+20 stosowanego w sekcjach i hodowlach tkankowych</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS kamera</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>Kamera C13440-20CU</td> o <td>wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli</td><td>Hanka Sigma</td><td>H6648</td><td>Do wytwarzania roztworu H+20 stosowanego w sekcjach i hodowlach tkankowych</td></tr><tr><td>Podgrzewana platforma</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Stół do izolacji drgań Micro-G</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>Do kontroli akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Wieloliniowy podgrzewacz roztworu</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Ti-E</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 Cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Sześciokanałowy system perfuzji sterowania zaworem</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Do wymiany roztworu</td></tr><tr><td>Kwadratowy stymulator impulsów</td><td>Instrument do trawy</td><td>SD9</td><td>Do stymulacji pola elektrycznego</td></tr></tbody></table>

pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na ph fluorescencyjnego analogu lipidowego nd6

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Egzo-/endocytoza to powszechny proces pośredniczący w wymianie biomolekuł między komórkami a ich otoczeniem oraz między różnymi komórkami. Wyspecjalizowane komórki wykorzystują ten proces do wykonywania ważnych funkcji organizmu, takich jak wydzielanie insuliny z komórek β i uwalnianie neuroprzekaźników z synaps chemicznych. Ze względu na swoje znaczenie fizjologiczne, egzo-/endocytoza jest jednym z najczęściej badanych tematów w biologii komórki. Opracowano wiele narzędzi do badania tego procesu na poziomie genów i białek, dzięki czemu wiele wiadomo o maszynerii białkowej uczestniczącej w tym procesie. Jednak opracowano bardzo niewiele metod pomiaru obrotu lipidów błonowych, który jest fizyczną podstawą egzo-/endocytozy.
Ten artykuł przedstawia klasę nowych fluorescencyjnych analogów lipidów wykazujących fluorescencję zależną od pH i demonstruje ich zastosowanie do śledzenia recyklingu lipidów między błoną plazmatyczną a pęcherzykami wydzielniczymi. Wspomagane prostymi manipulacjami pH, analogi te umożliwiają również ilościowe określenie rozmieszczenia lipidów na powierzchni i przedziałach błony wewnątrzkomórkowej, a także pomiar szybkości obrotu lipidów podczas egzo-/endocytozy. Te nowatorskie reportery lipidowe będą bardzo interesujące dla różnych dziedzin badań biologicznych, takich jak biologia komórki i neuronauka.

Pęcherzyki synaptyczne (SVs) są wyspecjalizowane w uwalnianiu neuroprzekaźników poprzez wywołaną egzo- i endocytozę27. SVs mają silnie zakwaszone światło (tj. pH 5.5), co jest idealne dla ND6. Zastosowaliśmy stymulację wysokim stężeniem K+, aby wywołać egzo- i endocytozę SVs, co umożliwiło ND6 dostęp do pęcherzyków. Zgodnie z oczekiwaniami, po obciążeniu pojawiły się jasne, zielone fluorescencyjne punkty wzdłuż wypustek neuronalnych (Rysunek 9A). Profil lin...

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.

Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Protokół ten opisuje charakterystykę i zastosowanie nowej, wrażliwej na pH fluorescencyjnej sondy lipidowej, specyficznej dla błon komórkowych, która pozwala naukowcom monitorować egzocytozę i endocytozę w żywych komórkach. Większość poprzednich reporterów na białku błonowym opartym na białku zielonej fluorescencji wrażliwym na pH, które jest pośrednie. Jako mimetyk lipidów, ND6 integruje się z błoną komórkową, a tym samym wiernie raportuje transport błony lipidowej.Sonda ND6 staje się fluorescencyjna tylko wtedy, gdy jest osadzona w biologicznym środowisku membranowym. Intensywność fluorescencji tej sondy koreluje z protonacją i deprotonacją grupy głowic piperazyny. Dzięki temu fluoryzuje znacznie silniej przy niższym pH.Egzocytoza i endocytoza to wszechobecne procesy leżące u podstaw wydzielania i wychwytu wielu cząsteczek sygnałowych. Dlatego ND6 może być używany do badania niektórych podstawowych pytań w biologii komórki i naukach biomedycznych. Procedurę zademonstrują Haley, Oliver i Jonathan, studenci z mojego laboratorium.Zacznij od przygotowania komory obrazowania, która umożliwia kontrolę temperatury i wyjście wejściowe roztworu do obrazowania fluorescencji żywych komórek. Skonfiguruj programowalne urządzenie, aby przełączać roztwory perfuzyjne i dostarczać bodziec elektryczny w określonych punktach czasowych podczas obrazowania. Odważyć odpowiednią ilość ND6.Rozpuść go w dimetylosulfotlenku i pozwól mu rozpuścić się w temperaturze pokojowej. Następnie krótko poddać roztwór sonikacji. Przefiltrować surowy roztwór podstawowy za pomocą filtra 0,22 mikrometra w celu usunięcia dużych agregatów barwnika.Za pomocą spektrofotometru konwencjonalnego lub mikroobjętościowego oznacz stężenie barwnika na 405 nanometrach. Przed zastosowaniem rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia jednego miligrama na mililitr za pomocą roztworu do kąpieli. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.Dodaj roztwór podstawowy ND6 do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr i inkubuj go w celu wszechobecnego znakowania endocytozowanych przedziałów błonowych, takich jak endosomy. Aby zmniejszyć zakres znakowania pęcherzyków synaptycznych, farmakologicznie hamuj spontaniczną aktywność neuronalną. Po selektywnym znakowaniu pęcherzyków synaptycznych zgodnie z opisem w manuskrypcie, zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki w komorze obrazowania.Podłącz czujnik temperatury, wejście perfuzyjne i końcówkę próżniową do komory obrazowania. Dostosuj prędkość perfuzji do około 0,2 mililitra na sekundę i rozpocznij perfuzję wstępnie podgrzanego normalnego roztworu tyrode zawierającego NBQX i DAP5 w celu usunięcia nadmiaru ND6 z hodowli. Dostosuj ostrość i zlokalizuj odpowiednie pole widzenia zawierające zdrowe i dobrze rozprzestrzenione neurony z połączonymi neurytami.Unikanie obszarów zawierających nierozwiązane dikoloidy. Spróbuj obrazować komórki załadowane ND6 z różnymi czasami ekspozycji, aby określić najlepsze ustawienia obrazowania. Ustaw protokół stymulacji i perfuzji, interwał ramki i całkowity czas trwania, korzystając z informacji zawartych w rękopisie tekstowym.Rozpocznij akwizycję obrazu, której towarzyszy zsynchronizowana stymulacja i perfuzja. Monitoruj stymulację i wymianę roztworu podczas obrazowania. Zatrzymaj perfuzję po zakończeniu obrazowania.Zdejmij szkiełko nakrywkowe i wyczyść komorę obrazowania do następnej próby. Utwórz kopię zapasową i utwórz elektroniczną kopię wszystkich plików obrazów. Wybierz i otwórz program do analizy w celu wyodrębnienia danych.Otwórz lub zaimportuj stos obrazów do programu analitycznego. Po wygenerowaniu maski binarnej użyj funkcji analizuj cząstki o odpowiednim rozmiarze obszaru i okrągłości, aby uzyskać obszary zainteresowania lub ROI, odpowiadające błonom komórkowym, endosomom, lizosomom lub butonom synaptycznym. Wybierz cztery obszary robocze tła w regionach wolnych od komórek w polu widzenia.Następnie zapisz wszystkie wybrane ROI. Wyrównaj wszystkie klatki w stosach obrazów poklatkowych ND6. Ustaw pierwszy obraz jako odniesienie i wyrównaj do niego resztę przy użyciu sztywnego pasowania, co ograniczy artefakty spowodowane dryfowaniem XY.Następnie zapisz wyrównane stosy obrazów. Zastosuj zapisane ROI do wyrównanych stosów obrazów ND6. Zmierz średnią intensywność pikseli fluorescencji ND6 dla każdego zwrotu z inwestycji w każdej klatce stosu obrazów.Następnie wyeksportuj wyniki do analizy statystycznej. Oblicz średnią intensywność ROI tła, aby uzyskać szum bazowy, który zostanie odjęty od wszystkich wybranych ROI. Uśrednij trzy najwyższe średnie intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji roztworu tyrode'a o pH 5,5, aby uzyskać maksymalną intensywność fluorescencji, określoną jako 100% dla normalizacji.Uśrednij trzy najniższe średnie intensywności dla każdego wybranego ROI podczas stosowania 50-milimolowego chlorku amonu, aby ustawić minimalną intensywność fluorescencji, zdefiniowaną jako 0% dla normalizacji. Oblicz względne zmiany fluorescencji dla każdego ROI na podstawie jego własnych intensywności 0% i 100%. Wyprowadź średnie zmiany fluorescencji, kinetykę zmian i inne wartości lub wykresy na podstawie indywidualnych danych ROI.Jasnozielone fluorescencyjne punkty wzdłuż procesów neuronalnych były widoczne po załadowaniu komórek neuronalnych ND6. Silna korelacja między intensywnością fluorescencji ND6 i FM464 również sugerowała barwienie pęcherzyków synaptycznych przez ND6. Zaobserwowano spadek fluorescencji ND6 w odpowiedzi zarówno na stymulację elektryczną, jak i stymulację wysokim poziomem potasu, co sugeruje, że ND6 znajduje się w błonie pęcherzyków synaptycznych i że światło pęcherzyków synaptycznych jest neutralizowane podczas uwalniania.Pod wpływem wyczerpującej stymulacji elektrycznej leczenie M beta CD znacznie zmniejszyło uwalnianie i odzyskiwanie pęcherzyków synaptycznych mierzone za pomocą obrazowania ND, co sugerowało, że cholesterol błonowy ułatwia egzocytozę pęcherzyków synaptycznych i endocytozę. Baf A1 zapobiegał odzyskiwaniu fluorescencji ND6 po stymulacji poprzez ostre blokowanie ponownego zakwaszenia odzyskanych pęcherzyków synaptycznych. Podstawowa wiedza na temat mikroskopii fluorescencyjnej jest koniecznością.Bardzo ważne jest staranne planowanie warunków fizjologicznych w celu wsparcia obrazowania żywych komórek. Kluczowe znaczenie ma precyzyjne określenie stężenia roztworu podstawowego ND. Jeśli to możliwe, przed każdym użyciem należy ponownie zmierzyć stężenie roztworu podstawowego.Trzymaj go z dala od bezpośredniego światła słonecznego, aby uniknąć wybielania zdjęć i rozkładu sondy.

measuring-membrane-lipid-turnover-with-ph-sensitive-fluorescent-lipid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość gaszenia fluorescencji jako miarę aktywności kanałów gramicydynowych. Kanały gramicydynowe są wykorzystywane jako molekularne przetworniki siły do monitorowania zmian w właściwościach dwuwarstwy lipidowej wyczuwanych przez białka przebiegające przez dwuwarstwę.

Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół przedstawia wykorzystanie środowiska próbek o zatrzymanym przepływie do szybkiego mieszania wielu płynnych roztworów in situ podczas pomiaru rozpraszania neutronów pod małym kątem oraz do badania procesów kinetycznych w skali nanometrowej i drugiej skali czasowej.

Pomiar ewolucji w czasie materiałów w nanoskali z zatrzymanym przepływem i rozpraszaniem neutronów pod małym kątem

Lipofagia to selektywna forma autofagii, która polega na degradacji kropelek lipidów. Dysfunkcje w tym procesie są związane z rozwojem nowotworów. Jednak dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Protokół ten opisuje ilościowe podejścia do obrazowania, aby lepiej zrozumieć wzajemne zależności między autofagią, metabolizmem lipidów i progresją raka.

Badanie regulacji katabolizmu kropelek lipidów poprzez lipofagię

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Poznaj metodę obrazowania fluorescencyjnego z sondą ND6 do badania dynamiki błon lipidowych w żywych komórkach neuronowych. Technika ta umożliwia bezpośredni pomiar egzocytozy i endocytozy w czasie rzeczywistym.

Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6

Przeglądaj więcej filmów