Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6
29 lipca 2021
Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.
Protokół ten opisuje charakterystykę i zastosowanie nowej, wrażliwej na pH fluorescencyjnej sondy lipidowej, specyficznej dla błon komórkowych, która pozwala naukowcom monitorować egzocytozę i endocytozę w żywych komórkach. Większość poprzednich reporterów na białku błonowym opartym na białku zielonej fluorescencji wrażliwym na pH, które jest pośrednie. Jako mimetyk lipidów, ND6 integruje się z błoną komórkową, a tym samym wiernie raportuje transport błony lipidowej.
Sonda ND6 staje się fluorescencyjna tylko wtedy, gdy jest osadzona w biologicznym środowisku membranowym. Intensywność fluorescencji tej sondy koreluje z protonacją i deprotonacją grupy głowic piperazyny. Dzięki temu fluoryzuje znacznie silniej przy niższym pH.
Egzocytoza i endocytoza to wszechobecne procesy leżące u podstaw wydzielania i wychwytu wielu cząsteczek sygnałowych. Dlatego ND6 może być używany do badania niektórych podstawowych pytań w biologii komórki i naukach biomedycznych. Procedurę zademonstrują Haley, Oliver i Jonathan, studenci z mojego laboratorium.
Zacznij od przygotowania komory obrazowania, która umożliwia kontrolę temperatury i wyjście wejściowe roztworu do obrazowania fluorescencji żywych komórek. Skonfiguruj programowalne urządzenie, aby przełączać roztwory perfuzyjne i dostarczać bodziec elektryczny w określonych punktach czasowych podczas obrazowania. Odważyć odpowiednią ilość ND6.
Rozpuść go w dimetylosulfotlenku i pozwól mu rozpuścić się w temperaturze pokojowej. Następnie krótko poddać roztwór sonikacji. Przefiltrować surowy roztwór podstawowy za pomocą filtra 0,22 mikrometra w celu usunięcia dużych agregatów barwnika.
Za pomocą spektrofotometru konwencjonalnego lub mikroobjętościowego oznacz stężenie barwnika na 405 nanometrach. Przed zastosowaniem rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia jednego miligrama na mililitr za pomocą roztworu do kąpieli. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.
Dodaj roztwór podstawowy ND6 do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr i inkubuj go w celu wszechobecnego znakowania endocytozowanych przedziałów błonowych, takich jak endosomy. Aby zmniejszyć zakres znakowania pęcherzyków synaptycznych, farmakologicznie hamuj spontaniczną aktywność neuronalną. Po selektywnym znakowaniu pęcherzyków synaptycznych zgodnie z opisem w manuskrypcie, zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki w komorze obrazowania.
Podłącz czujnik temperatury, wejście perfuzyjne i końcówkę próżniową do komory obrazowania. Dostosuj prędkość perfuzji do około 0,2 mililitra na sekundę i rozpocznij perfuzję wstępnie podgrzanego normalnego roztworu tyrode zawierającego NBQX i DAP5 w celu usunięcia nadmiaru ND6 z hodowli. Dostosuj ostrość i zlokalizuj odpowiednie pole widzenia zawierające zdrowe i dobrze rozprzestrzenione neurony z połączonymi neurytami.
Unikanie obszarów zawierających nierozwiązane dikoloidy. Spróbuj obrazować komórki załadowane ND6 z różnymi czasami ekspozycji, aby określić najlepsze ustawienia obrazowania. Ustaw protokół stymulacji i perfuzji, interwał ramki i całkowity czas trwania, korzystając z informacji zawartych w rękopisie tekstowym.
Rozpocznij akwizycję obrazu, której towarzyszy zsynchronizowana stymulacja i perfuzja. Monitoruj stymulację i wymianę roztworu podczas obrazowania. Zatrzymaj perfuzję po zakończeniu obrazowania.
Zdejmij szkiełko nakrywkowe i wyczyść komorę obrazowania do następnej próby. Utwórz kopię zapasową i utwórz elektroniczną kopię wszystkich plików obrazów. Wybierz i otwórz program do analizy w celu wyodrębnienia danych.
Otwórz lub zaimportuj stos obrazów do programu analitycznego. Po wygenerowaniu maski binarnej użyj funkcji analizuj cząstki o odpowiednim rozmiarze obszaru i okrągłości, aby uzyskać obszary zainteresowania lub ROI, odpowiadające błonom komórkowym, endosomom, lizosomom lub butonom synaptycznym. Wybierz cztery obszary robocze tła w regionach wolnych od komórek w polu widzenia.
Następnie zapisz wszystkie wybrane ROI. Wyrównaj wszystkie klatki w stosach obrazów poklatkowych ND6. Ustaw pierwszy obraz jako odniesienie i wyrównaj do niego resztę przy użyciu sztywnego pasowania, co ograniczy artefakty spowodowane dryfowaniem XY.
Następnie zapisz wyrównane stosy obrazów. Zastosuj zapisane ROI do wyrównanych stosów obrazów ND6. Zmierz średnią intensywność pikseli fluorescencji ND6 dla każdego zwrotu z inwestycji w każdej klatce stosu obrazów.
Następnie wyeksportuj wyniki do analizy statystycznej. Oblicz średnią intensywność ROI tła, aby uzyskać szum bazowy, który zostanie odjęty od wszystkich wybranych ROI. Uśrednij trzy najwyższe średnie intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji roztworu tyrode'a o pH 5,5, aby uzyskać maksymalną intensywność fluorescencji, określoną jako 100% dla normalizacji.
Uśrednij trzy najniższe średnie intensywności dla każdego wybranego ROI podczas stosowania 50-milimolowego chlorku amonu, aby ustawić minimalną intensywność fluorescencji, zdefiniowaną jako 0% dla normalizacji. Oblicz względne zmiany fluorescencji dla każdego ROI na podstawie jego własnych intensywności 0% i 100%. Wyprowadź średnie zmiany fluorescencji, kinetykę zmian i inne wartości lub wykresy na podstawie indywidualnych danych ROI.
Jasnozielone fluorescencyjne punkty wzdłuż procesów neuronalnych były widoczne po załadowaniu komórek neuronalnych ND6. Silna korelacja między intensywnością fluorescencji ND6 i FM464 również sugerowała barwienie pęcherzyków synaptycznych przez ND6. Zaobserwowano spadek fluorescencji ND6 w odpowiedzi zarówno na stymulację elektryczną, jak i stymulację wysokim poziomem potasu, co sugeruje, że ND6 znajduje się w błonie pęcherzyków synaptycznych i że światło pęcherzyków synaptycznych jest neutralizowane podczas uwalniania.
Pod wpływem wyczerpującej stymulacji elektrycznej leczenie M beta CD znacznie zmniejszyło uwalnianie i odzyskiwanie pęcherzyków synaptycznych mierzone za pomocą obrazowania ND, co sugerowało, że cholesterol błonowy ułatwia egzocytozę pęcherzyków synaptycznych i endocytozę. Baf A1 zapobiegał odzyskiwaniu fluorescencji ND6 po stymulacji poprzez ostre blokowanie ponownego zakwaszenia odzyskanych pęcherzyków synaptycznych. Podstawowa wiedza na temat mikroskopii fluorescencyjnej jest koniecznością.
Bardzo ważne jest staranne planowanie warunków fizjologicznych w celu wsparcia obrazowania żywych komórek. Kluczowe znaczenie ma precyzyjne określenie stężenia roztworu podstawowego ND. Jeśli to możliwe, przed każdym użyciem należy ponownie zmierzyć stężenie roztworu podstawowego.
Trzymaj go z dala od bezpośredniego światła słonecznego, aby uniknąć wybielania zdjęć i rozkładu sondy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem sond lipidowych wrażliwych na pH do monitorowania transportu błon lipidowych podczas egzocytozy i endocytozy komórkowej. Mimetyk lipidowy ND6 wbudowuje się w błonę komórkową, umożliwiając wgląd w te dynamiczne procesy w żywych komórkach w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Biologia komórki
- Neurobiologia
Wstęp
- Sonda ND6 jest wrażliwa na pH i została zaprojektowana specjalnie do błon komórkowych.
- Poprzednie metody wykorzystujące zielone białka fluorescencyjne są pośrednie, podczas gdy ND6 umożliwia pomiar bezpośredni.
- Intensywność fluorescencji koreluje z protonowaniem i deprotonowaniem jej grupy głównej.
- Badanie egzocytozy i endocytozy jest kluczowe dla zrozumienia sygnalizacji komórkowej.
Cel badania
- Opracowanie metody bezpośredniej obserwacji dynamiki błon lipidowych w żywych komórkach.
- Ułatwienie badania podstawowych procesów w biologii komórki.
- Zapewnienie wglądu w mechanizmy transportu pęcherzykowego i oddziaływań błonowych podczas aktywności neuronalnej.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano obrazowanie żywych komórek w celu monitorowania zmian fluorescencji z wykorzystaniem ND6 w hodowlanych komórkach neuronalnych.
- Kluczowe procedury obejmują przygotowanie komory obrazowania, solubilizację ND6 oraz kontrolowaną perfuzję.
- Akwizycja obrazów jest zsynchronizowana z protokołami stymulacji elektrycznej i perfuzji.
- Analiza statystyczna obejmuje obliczanie względnych zmian fluorescencji oraz generowanie masek binarnych dla obszarów zainteresowania.
Główne wyniki
- Jasna fluorescencja punktów ND6 wskazuje na pomyślne znakowanie pęcherzyków synaptycznych.
- Zmiany fluorescencji ND6 korelują z dynamiką pęcherzyków synaptycznych podczas stymulacji.
- Eksperymenty ujawniły interakcje między cholesterolem a transportem pęcherzyków synaptycznych.
- Traktowanie Baf A1 wpłynęło na powrót fluorescencji ND6, podkreślając rolę pH w zakwaszaniu pęcherzyków.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia szczegółowe badanie transportu błon lipidowych w żywych neuronach.
- Wnioski płynące z tej metody przyczyniają się do lepszego zrozumienia mechanizmów komórkowych leżących u podstaw egzocytozy i endocytozy.
- Wyniki te mają istotne znaczenie dla sygnalizacji komórkowej i neurobiologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar obrotu lipidów błonowych dostarcza bezpośredniego wglądu w fizyczne podstawy egzocytozy i endocytozy, procesów kluczowych dla sygnalizacji komórkowej i transportu pęcherzykowego. Wrażliwy na pH fluorescencyjny analog lipidów ND6 umożliwia ilościowe śledzenie recyklingu lipidów między błoną plazmatyczną a przedziałami wewnątrzkomórkowymi w czasie rzeczywistym, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego podczas walidacji celów i opracowywania testów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie dynamiki lipidów z efektami funkcjonalnymi w szlakach sekrecji i poboru.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie transportu błon lipidowych jako hipotezy terapeutycznej w szlakach związanych z sekrecją.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośredni odczyt obrotu lipidów, zmniejszając zależność od pośrednich reporterów opartych na białkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację dynamiki lipidów z uwalnianiem i odzyskiwaniem pęcherzyków.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty fluorescencji proporcjonalne do dynamiki błon lipidowych podczas stymulacji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zestandaryzowany, powtarzalny pomiar kinetyki egzocytozy/endocytozy w żywych komórkach.
- Gotowość do analizy: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do screeningu związków i badań nad modulacją szlaków sygnałowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary obrotu lipidów z systemami istotnymi dla chorób, takimi jak sekrecja neuronalna i uwalnianie insuliny.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia rolę cholesterolu błonowego oraz pH w transporcie pęcherzykowym, co dostarcza informacji o bezpieczeństwie i skuteczności celu terapeutycznego.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie dynamiki lipidów z funkcjonalnymi efektami sekrecyjnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną – zapewniając bezpośrednie, ilościowe odczyty dynamiki błon lipidowych, które wspierają zrozumienie mechanizmów oraz screening funkcjonalny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów zależnych od lipidów w szlakach egzocytozy i endocytozy.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki fluorescencji do oceny wpływu związków na obrót lipidów.
- Analityka: Umożliwia wyznaczenie średnich zmian fluorescencji, kinetyki oraz wskaźników normalizacji w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę lipidów z funkcją wydzielniczą w komórkach neuronalnych i endokrynnych, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do monitorowania transportu błon lipidowych w różnych typach komórek i paradygmatach stymulacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia bezpośredni, ilościowy pomiar wymiany błon lipidowych, redukując niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach sekrecyjnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów transportu lipidów dzięki normalizacji opartej na pH oraz analizie ROI.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie dynamiki lipidów z funkcjonalnym uwalnianiem i odzyskiwaniem pęcherzyków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów zaangażowanych w transport błonowy i procesy sekrecyjne z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej, obrazowania żywych komórek oraz pracy z sondami wrażliwymi na pH.
- Wymaga aparatury do kontrolowanej perfuzji, regulacji temperatury oraz zsynchronizowanej stymulacji podczas obrazowania.
- Wymaga standaryzacji stężenia sond, rozcieńczeń i ustawień obrazowania pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych typów komórek, składów błon oraz protokołów stymulacji.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko fotoblaknięcia, potrzeba przechowywania w ciemności oraz optymalizacja czasów ekspozycji i roztworów pH.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Microscope Setup, Loading and Imaging ND6 in Neuronal Cultures
4:17
Quantification of Membrane Trafficking by a Change in ND6 Fluorescence
6:44
Results: Membrane Lipid Turnover with the pH‐Sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6
8:00
Conclusion
