Pobieranie tkanek i ekstrakcja RNA z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów

Protokół ten zachęca do wykorzystania pierwotnych tkanek ludzkich jako klinicznie istotnego modelu do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów. Przeprowadzanie analiz ekspresji genów i histologicznych w tych tkankach może dostarczyć nowych informacji mechanistycznych. Technika ta standaryzuje metody identyfikacji i przetwarzania elementów stawu kolanowego człowieka.

Umożliwia ekstrakcję wysokiej jakości RNA, które spełnia wymagania dla dalszych testów ekspresji genów. Uzyskanie wysokiej jakości RNA z chorych tkanek stawowych jest wyzwaniem, dlatego nie należy lekceważyć znaczenia pozornie nieistotnych kroków, takich jak utrzymywanie wszystkiego w czystości i chłodzie. Procedurę zademonstrują Thomas Wilson, pracownik naukowy i Navdeep Kaur, doktor habilitowany z mojego laboratorium.

Zacznij od zidentyfikowania tkanek twardych, w tym chrząstek, kości i łąkotki oraz tkanek miękkich, w tym poduszeczki tłuszczowej podrzepkowej, więzadła krzyżowego przedniego, błony maziowej i mięśnia skośnego obszernego przyśrodkowego z próbki na podstawie różnic w rozmiarze, kształcie, kolorze i teksturze. Pokrój każdą z tkanek na trzy sekcje. Opłucz skrawki tkanki sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości lub zanieczyszczenia.

W celu ekstrakcji RNA pokrój każdy z trzech odcinków tkanki na około jedną do dwóch milimetrowych kostek. Przenieś mniejsze kawałki do dwumililitrowej fiolki kriogenicznej. Po szczelnym zabezpieczeniu nakrętek, błyskawicznie zamroź fiolki, zanurzając je w ciekłym azocie na 30 sekund, a następnie przenieś fiolkę do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania i powtórz tę procedurę dla wszystkich tkanek.

Zhomogenizuj twardą tkankę za pomocą moździerza i tłuczka. Przed homogenizacją schłodzić moździerz, tłuczek i szpatułkę za pomocą ciekłego azotu, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Przetwarzaj tylko jedną próbkę na raz.

Przenieść próbkę tkanki do zaprawy za pomocą schłodzonej szpatułki. Wlej ciekły azot na wierzch tkanki. Po odparowaniu ciekłego azotu zmiażdż tkankę tłuczkiem.

Wielokrotnie dodawaj ciekły azot podczas mielenia tkanki, aby uzyskać drobny proszek tkankowy. Przenieś drobny proszek tkankowy do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, wstępnie schłodzonej, zanurzając ją w ciekłym azocie na 30 sekund. Dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu fenolu guanidyny kwasowej do każdej probówki i inkubuj probówki na lodzie przez 20 minut.

Przed homogenizacją różnych twardych tkanek należy dokładnie oczyścić moździerz, tłuczek i szpatułkę 70% etanolem, następnie odkażaniem RNazy, a następnie wodą uzdatnioną DEPC. Namocz moździerz, tłuczek i szpatułkę w 70% etanolu, a następnie wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Homogenizuj tkankę miękką za pomocą homogenizatora tkankowego.

W celu dezynfekcji homogenizatora umyj sondę, uruchamiając rurki z 70% etanolem i odkażaczem RNazy przez 30 sekund na mycie, a następnie przemyć wodą uzdatnioną DEPC, a następnie dodatkowym 70% etanolem, każda przez 30 sekund. Wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Dodaj jeden mililitr kwaśnego roztworu fenolu guanidyny do wstępnie oznakowanych, pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem i przenieś próbkę tkanki do probówki.

Umieść probówkę na lodzie przez cały zabieg i homogenizuj tkankę przez maksymalnie pięć 32. impulsów lub do momentu, gdy tkanka zostanie wizualnie rozpuszczona. Inkubować homogenizowaną tkankę na lodzie, aż wszystkie próbki tkanek zostaną przetworzone. Zdezynfekować i oczyścić homogenizator przed przetworzeniem następnej próbki tkanki.

Za pomocą sterylnych kleszczy usuń wszelkie kawałki tkanki znajdujące się w zębach sondy. Inkubuj całą homogenizowaną tkankę na lodzie przez dodatkowe 20 minut, a następnie przenieś próbkę tkanki do wstępnie oznakowanej, wstępnie schłodzonej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Siedem unikalnych tkanek ludzkiego stawu kolanowego uzyskanych od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów poddano obróbce w ciągu czterech godzin od chirurgicznego usunięcia.

Tkanki zostały zidentyfikowane wizualnie i potwierdzone przez barwienie histologiczne H&E. Wycinki tkanek twardych, chrząstki stawowej, kości podchrzęstnej i łąkotki wybarwione metodą H&E uwidoczniono w sześciokrotnym i 40-krotnym powiększeniu. Podobnie, wybarwione H&E skrawki tkanek miękkich, podrzepkową poduszeczkę tłuszczową, więzadło krzyżowe przednie, mięsień maziowy i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy uwidoczniono w sześciokrotnym powiększeniu, a następnie w 40-krotnym powiększeniu.

Ocena jakości wyekstrahowanego RNA wykazała obecność próbek wysokiej jakości w oparciu o integralność, wydajność i czystość, a także próbek niskiej jakości, co sugeruje, że pomimo zastosowania zoptymalizowanej metody, czynniki zewnętrzne, takie jak nasilenie choroby, mogą wpływać na jakość RNA w różnych tkankach tego samego pacjenta. Prawidłowa identyfikacja każdego typu tkanki jest niezbędna, aby umożliwić porównania wewnątrz- i międzytkankowe w obrębie próbek pobranych od pacjentów i między nimi, zwłaszcza biorąc pod uwagę znaczną niejednorodność tkanek pierwotnych chorobowych. Technologie sekwencjonowania szybko się rozwijają, a izolacja wysokiej jakości RNA jest kluczowym warunkiem wstępnym do wykorzystania tych technologii do rozwikłania mechanizmów specyficznych dla tkanek w złożonych, przewlekłych chorobach, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów.