Name: Pobieranie tkanek i ekstrakcja RNA z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji wysokiej jakości RNA z tkanek ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów i badania mechanizmów choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują uczestnikom badania, dzięki którym te badania były możliwe i dedykują ten raport nowym naukowcom w dziedzinie choroby zwyrodnieniowej stawów.

Ten protokół badania został zatwierdzony i zgodny z wytycznymi instytucjonalnymi ustalonymi przez Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).
1. Wybór pacjenta
<ol>
	<li>Zidentyfikuj pacjentów spośród tych, u których zaplanowano TKA u chirurga ortopedy.</li>
	<li>Wyboru pacjentów należy dokonać na podstawie kryteriów kwalifikacji określonych w protokole badania. Przykłady kryteriów włączenia obejmują ukończone 18 lat i potwierdzoną diagnozę choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego. Przykładami kryteriów wykluczenia są poddanie się częściowej wymianie stawu kolanowego lub potwierdzona diagnoza reumatoidalnego zapalenia stawów.</li>
	<li>Skontaktuj się z pacjentami w celu uzyskania świadomej zgody przed zabiegiem.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbki (dla RNA)
UWAGA: Przeprowadź wszystkie procesy przetwarzania tkanek w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i postępuj zgodnie z technikami sterylnymi. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne) podczas przetwarzania próbek ludzkich. Podczas TKA wytwarzanych jest kilka fragmentów kości, duża ilość kości/chrząstki będzie potencjalnie dostępna do rozwarstwienia. Ze względu na postęp choroby, zwyrodnienie chrząstki stawowej może być bardziej nasilone w niektórych częściach kości, co można uwzględnić w projekcie eksperymentalnym. Tylko tkanki, które wymagają elektrokoagulacji do resekcji, mają termiczne uszkodzenie krawędzi, a skoordynowany wysiłek chirurgiczny jest podejmowany w celu pozyskania większości tkanek za pomocą skalpela, aby zminimalizować uszkodzenia. Wycięte tkanki muszą być przez cały czas nawodnione sterylnym PBS.
<ol>
	<li>Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie robocze i sprzęt za pomocą 70% etanolu, środka odkażającego RNazy, wody uzdatnionej DEPC i ponownie 70% etanolu. Wytrzyj resztki płynu czystymi, niestrzępiącymi się chusteczkami. Kleszcze, obcinacze do kości i skalpele są sterylizowane w autoklawie lub moczone w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut przed użyciem. Utrzymuj sprzęt zanurzony w 70% etanolu, gdy nie jest używany natychmiast.</li>
	<li>Wstępnie oznacz co najmniej trzy kriowiale zanonimizowaną nazwą próbki i podwielokrotnym numerem dla każdej tkanki (np. TKA-1 Chrząstka 1).
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj każdy typ tkanki z próbki na podstawie różnic w rozmiarze, kształcie, kolorze i teksturze, jak pokazano i opisano w Rysunek 2. Zidentyfikuj chrząstkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A strzałka), kość (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B strzałka), łąkotkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C), podrzepkową poduszkę tłuszczową (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D), więzadło krzyżowe przednie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E), błonę maziową (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F) i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj chrząstkę stawową.
	<ol>
		<li>Wybierz część kości z minimalną degradacją chrząstki.</li>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 przeciąć chrząstkę tak daleko, jak to możliwe, aby wyciąć całą grubość warstwy chrząstki. 
		UWAGA: Skalpel nr 10 przeniknie tylko do chrząstki, a nie do kości.</li>
		<li>Wykorzystując całą grubość chrząstki, rozetnij trzy kostki o średnicy 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj kość podchrzęstną.
	<ol>
		<li>Użyj tego samego odcinka kości, z którego pobrano chrząstkę.</li>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 zeskrob wszelkie pozostałe chrząstki i resztki tkanek z powierzchni kości.</li>
		<li>Przytrzymaj część kości do cięcia kleszczami i użyj noży do kości, aby przeciąć trzy kostki o średnicy 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj łąkotkę.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj stosunkowo nieuszkodzoną część łąkotki przyśrodkowej lub bocznej.</li>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy rozetnij trzy kostki o średnicy 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj podrzepkową poduszeczkę tłuszczową.
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy pokrój żółtą część tkanki na trzy równej wielkości i jednorodne porcje (~500 mg każda).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj więzadło krzyżowe przednie (ACL).
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy rozetnij trzy kostki o średnicy 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj błonę maziową.
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy odizoluj różową komórkową część błony tak bardzo, jak to możliwe, zeskrobując tkankę tłuszczową.</li>
		<li>Rozciąć trzy równej wielkości i jednorodne porcje (~200 mg każda).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj mięsień obszerny przyśrodkowy skośny (VMO).
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy usuń tkankę tłuszczową z próbki, pozostawiając tylko czerwoną tkankę mięśniową.</li>
		<li>Przeanalizuj trzy kostki o średnicy 5 mm. 
		UWAGA: Początkowy rozmiar tkanki ogranicza wielkość porcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opłucz porcje tkanek sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości lub zanieczyszczenia.</li>
	<li>Aby wykonać histologię, należy ustalić każdą część tkanki zgodnie z opisem w części 3.</li>
	<li>Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA, należy pokroić każdą z trzech porcji tkanki na mniejsze kawałki (kostki ~1-2 mm).
	<ol>
		<li>Przenieś mniejsze kawałki do kriowialu o pojemności 2 ml, szczelnie zabezpiecz nakrętki, błyskawicznie zamroź, zanurzając w ciekłym azocie na 30 s, a następnie przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania (do 4 miesięcy testowane w obecnym protokole). Powtórzyć tę czynność dla wszystkich podwielokrotności wszystkich tkanek.</li>
		<li>Przejdź do Homogenizacji tkanek zgodnie z opisem w części 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie próbki (do histologii)
UWAGA: Formalina jest niebezpieczną substancją chemiczną, stosuje się ją tylko w dygestoriach chemicznych.
<ol>
	<li>Napełnij wstępnie oznakowane probówki stożkowe o pojemności 15 ml 10% roztworem formaliny.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś wycinek tkanki do probówek wypełnionych formaliną.</li>
	<li>Utrwal tkanki w formalinie przez 1 tydzień w temperaturze pokojowej, potrząsając/mieszając, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Po 1 tygodniu wyrzuć formalinę do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne, spłucz chusteczki PBS, a następnie przenieś do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 70% etanolu do długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C, aż próbki zostaną osadzone do podziału. 
	UWAGA: Tylko w przypadku kości/chrząstki należy przeprowadzić odwapnienie w następujący sposób.</li>
	<li>Po 1 tygodniu wyrzuć formalinę do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne i spłucz chusteczki PBS.</li>
	<li>Przenieś tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 45 ml 10% roztworu EDTA (pH 7,4).</li>
	<li>Jeśli wstrząsanie/mieszanie nie jest możliwe, odwróć probówki 10-15 razy raz dziennie.</li>
	<li>Wyrzuć i zastąp roztwór EDTA raz w tygodniu.
	<ol>
		<li>Dwa razy w tygodniu testuj teksturę za pomocą narzędzia (np. szpatułki) lub palca w rękawiczce, aby potwierdzić odwapnienie, obserwując deformację po przyłożeniu nacisku. Czas potrzebny do odwapnienia tkanki kostnej będzie się różnić w zależności od próbki od 4 do 6 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po odwapnieniu przepłukać tkankę PBS i przenieść do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 70% etanolu w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C do momentu osadzenia próbek w celu podzielenia na sekcje.</li>
</ol>
4. Homogenizacja tkanek
UWAGA: Protokół wykorzystuje niebezpieczny fenol. Praca z fenolem musi być wykonywana w dygestoriach chemicznych.
UWAGA: Dokładnie oczyść wszystkie urządzenia i powierzchnie, które mają być używane 70% etanolem (moczyć przez minimum 10 minut), następnie odkaż RNaza (moczyć przez minimum 10 minut), spłucz wodą uzdatnioną przez DEPC, wytrzyj czystym, niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym, a następnie ponownie spryskaj lub namocz 70% etanolem.
<ol>
	<li>Homogenizacja tkanek twardych (chrząstka stawowa, kość podchrzęstna, łąkotka)
	<ol>
		<li>Przed homogenizacją schłodź moździerz, tłuczek i szpatułkę za pomocą ciekłego azotu. Muszą one być przechowywane w jak najniższej temperaturze, aby zapobiec rozmrożeniu próbki.</li>
		<li>Próbki należy przetwarzać pojedynczo, utrzymując pozostałe próbki w temperaturze -80 °C do momentu ich użycia.</li>
		<li>Przenieść próbkę tkanki do zaprawy za pomocą schłodzonej szpatułki; wlać dodatkowy ciekły azot na wierzch tkanki i pozostawić do odparowania. Zmiażdż tkankę za pomocą tłuczka. Kilkakrotnie dodawaj więcej ciekłego azotu do próbki tkanki, pozwól mu odparować, a następnie kontynuuj mielenie tłuczkiem, aby uzyskać drobny proszek.</li>
		<li>Po sproszkowaniu tkanki w jak największym stopniu przenieś ją do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
		<ol>
			<li>Wstępnie schładzaj probówki, zanurzając je w ciekłym azocie na 30 s przed transferem tkanek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu kwasu, guanidyny-fenolu do każdej probówki i trzymać na lodzie.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.1.3-4.1.5 dla każdej próbki tkanek twardych.</li>
		<li>Po każdej chusteczce wyczyść moździerz, tłuczek i szpatułkę 70% etanolem, środkiem odkażającym RNaza, wodą uzdatnioną DEPC i dodatkowo namocz w 70% etanolu. Wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką.</li>
		<li>Próbki należy inkubować na lodzie przez dodatkowe 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja tkanek miękkich (poduszeczka tłuszczowa podrzepkowa, ACL, błona maziowa, VMO)
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj homogenizator, uruchamiając rurki z 70% etanolem, odkażaczem RNazy, wodą uzdatnioną DEPC i dodatkowym 70% płukaniem etanolem, każda przez 30 sekund. Wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Powtórzyć tę czynność między każdą próbką.</li>
		<li>Wstępnie oznacz probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml dla każdej próbki. Do każdej probówki dodać 1 ml roztworu kwasu, guanidyny i fenolu.
		<ol>
			<li>Pracuj na jednej próbce na raz, pozostawiając inne próbki do przetworzenia w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieść tkankę do wstępnie znakowanej probówki o pojemności 5 ml z kwasem, guanidyny-fenolem.</li>
		<li>Homogenizuj tkanki w impulsach 30 s, utrzymując na lodzie podczas i między impulsami. Powtarzaj, aż tkanka wizualnie się rozpuści lub maksymalnie przez pięć impulsów 30 s. 
		UWAGA: Niektóre tkanki włókniste (np. mięśnie) mogą nie ulegać całkowitej homogenizacji.</li>
		<li>Inkubować rozpuszczoną tkankę na lodzie i przejść do następnej próbki.
		<ol>
			<li>Wyczyść homogenizator zgodnie z opisem w kroku 4.2.1. Upewnij się, że kawałki tkanek nie pozostały w zębach sondy; W razie potrzeby usuń sterylnymi kleszczami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po homogenizacji wszystkich próbek, inkubować na lodzie w kwasie-guanidyno-fenolu przez dodatkowe 20 minut.</li>
		<li>Przenieść próbki z probówek okrągłodennych do wstępnie oznakowanych i schłodzonych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA z tkanek
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje niebezpieczne substancje chemiczne, takie jak fenol, chloroform i izopropanol. Całą pracę należy wykonywać w dygestorium chemicznym.
UWAGA: Sprzęt i odczynniki są zarezerwowane tylko do pracy z RNA i muszą być odpowiedniej klasy chemicznej do zastosowań molekularnych (tj. sterylne, wolne od nukleaz). Protokół ten zastępuje zarówno części 4.1, jak i 4.2 protokoły homogenizacji tkanek. Dokładnie wyczyść wszystkie urządzenia i powierzchnie, które mają być używane, 70% etanolem (moczyć przez co najmniej 10 minut), a następnie przeprowadzić odkażanie RNazą (moczyć przez co najmniej 10 minut). Spłucz wodą uzdatnioną DEPC, wytrzyj pozostałą ciecz czystym, niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym, a następnie ponownie spryskaj lub namocz 70% etanolem.
<ol>
	<li>Odwirować probówki do mikrowirówek o sile 10000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: W przypadku tkanek tłuszczowych warstwa lipidowa czasami będzie obecna na górze. Unikaj przenoszenia tego poprzez przekłuwanie warstwy z boku rurki końcówką pipety.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 200 μl chloroformu na 1 ml roztworu kwasowo-guanidynowo-fenolowego. Potrząsaj energicznie probówkami ręcznie przez 30 sekund, aby wymieszać. Następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po odwirowaniu utworzą się trzy warstwy: faza wodna zawierająca RNA, interfaza białego DNA i różowa faza białkowa na dole.</li>
	<li>Przenieść ~500 μL górnej, wodnej fazy do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Nie zakłócaj interfazy i frakcji białkowych. Przechowywać te fazy w temperaturze -80 °C do przyszłej izolacji DNA lub białka.</li>
	<li>Dodać równą objętość roztworu kwasu-guanidyny-fenolu do przeniesionej fazy wodnej, wymieszać, odwracając probówkę 8-10 razy. Inkubować probówkę na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 200 μl chloroformu na 1 ml roztworu kwasowo-guanidynowo-fenolowego. Wstrząsaj energicznie ręcznie przez 30 sekund, aby wymieszać, a następnie inkubuj na lodzie przez 2 minuty.</li>
	<li>Odwirować próbki przy 10000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść <500 μl fazy wodnej do świeżej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie zanieczyścić próbki innymi fazami. 
	UWAGA: Pozostałe fazy należy wyrzucić odpowiednimi metodami usuwania materiałów niebezpiecznych.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać równą objętość (jako fazę wodną) 100% izopropanolu. Wymieszaj, odwracając rurkę 8-10 razy. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 μl kostrącu glikogenu do każdej próbki, aby pomóc w zlokalizowaniu osadu RNA po odwirowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 12000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zlokalizuj granulkę w probówce (jeśli używasz współrecipitantu, będzie ona niebieska). Ostrożnie odlej supernatant.</li>
	<li>Umyj osad, dodając 1 ml lodowatego 75% etanolu do każdej próbki, przekręć wir, aby usunąć osad z dna probówki. 
	UWAGA: Przygotuj 75% etanolu, używając czystego etanolu o czystości cząsteczkowej i wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Wirować przy 7000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odlać sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.13 i 5.14 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Szybkie wirowanie (<2000 x g przez 5 s), aby sprowadzić resztki płynu na dno tuby. Użyj pipety P20, aby usunąć resztki etanolu z dna probówek.
	<ol>
		<li>Unikać dotykania osadu RNA końcówką pipety. Zmieniaj końcówki między próbkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przy otwartych nakrętkach probówek suszyć próbki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 min. 
	UWAGA: Pellet może stać się przezroczysty po wyschnięciu. Upewnienie się, że wszystkie resztki etanolu odparowały, poprawi czystość RNA.</li>
	<li>Dodaj 25 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki, aby rozpuścić osad.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać RNA.</li>
	<li>Podwielokrotność 5 μl próbki do świeżej probówki w celu przeprowadzenia analizy w ramach kontroli jakości (część 6). Pozostałe 20 μl należy przechowywać w temperaturze -80 °C do oznaczania ekspresji genów.</li>
</ol>
6. Kontrola jakości
<ol>
	<li>Określić stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określić integralność RNA za pomocą urządzenia do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Rozcieńczyć RNA, aby mieścił się w zakresie granic wykrywalności chipa.</li>
</ol>

<ol><li>Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGupton%2C+M+%22Anatomy%2C+Bony+Pelvis%2C+and+Lover+Limb%2C+Knee%22">Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee</a>. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).</li>
<li>Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Synovial+joint+and+articular+cartilage+formation%3A+recent+advances%2C+but+many+lingering+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).</li>
<li>Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGupton%2C+M+%22Anatomy%2C+Hinge+Joints%22">Anatomy, Hinge Joints</a>. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+Toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044(2017).</li>
<li>Murphy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+risk+of+symptomatic+knee+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis.</a> Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).</li>
<li>O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+epidemiology%2C+risk+factors+and+disease+outcomes+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis.</a> Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).</li>
<li>Nguyen, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+prevalence+of+knee+pain+and+symptomatic+knee+osteoarthritis%3A+survey+and+cohort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data.</a> Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).</li>
<li>Deshpande, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+persons+with+symptomatic+knee+osteoarthritis+in+the+us%3A+impact+of+race+and+ethnicity%2C+age%2C+sex%2C+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity.</a> Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).</li>
<li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomical+basis+for+a+novel+classification+of+osteoarthritis+and+allied+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders.</a> Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).</li>
<li>Bannuru, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OARSI+guidelines+for+the+non-surgical+management+of+knee%2C+hip%2C+and+polyarticular+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).</li>
<li>Kolasinski, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+College+of+Rheumatology%2FArthritis+Foundation+Guideline+for+the+Management+of+Osteoarthritis+of+the+Hand%2C+Hip%2C+and+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee.</a> Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).</li>
<li>Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology%2C+etiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+%C3%84rzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee.</a> Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).</li>
<li>Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+total+joint+replacement+in+the+United+States%3A+Future+projections+to+2020-2040+using+the+national+inpatient+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample.</a> Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).</li>
<li>Gemayel, A. C., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+Knee+Replacement+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Total Knee Replacement Techniques.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).</li>
<li>Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+and+long-term+quality+of+life+after+total+knee+replacement%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+%28American+Volume%29%22%5BJournal%5D)">Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).</li>
<li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Atdc5+cells%3A+an+optimised+model+for+rapid+and+physiological+matrix+mineralisation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).</li>
<li>Chuang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+enhanced+the+angiogenic+capability+of+human+chondrocytes+by+regulating+Gi%2FNf-Kb-dependent+angiogenic+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression.</a> PLoS One. 9 (5), 95180(2014).</li>
<li>Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+for+the+study+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">In vitro models for the study of osteoarthritis.</a> Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).</li>
<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28dmm%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvev+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+horse+as+a+model+of+naturally+occurring+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+%26+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis.</a> Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).</li>
<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Osteoarthritis%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+promising%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).</li>
<li>Goldenberg, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRB+practices+and+policies+regarding+the+secondary+research+use+of+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Medical+Ethics%22%5BJournal%5D)">IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens.</a> Bmc Medical Ethics. 16, 32(2015).</li>
<li>Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+methods+for+preparation+and+characterization+of+total+rna+from+cartilage+samples+to+uncover+osteoarthritis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo.</a> BMC Research Notes. 3, 7(2010).</li>
<li>Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cnx.org/content/col11496/1.6/">http://cnx.org/content/col11496/1.6/</a> (2021).</li>
<li>Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+total+RNA+from+small+samples+of+hypocellular%2C+dense+connective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues.</a> BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).</li>
<li>Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+human+knee+menisci%3A+structure%2C+composition%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function.</a> Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).</li>
<li>Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+science+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Basic science of articular cartilage.</a> Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).</li>
<li>Le Bleu, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+high-quality+RNA+from+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage.</a> Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).</li>
<li>Ali, S. A., Alman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+extraction+from+human+articular+cartilage+by+chondrocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation.</a> Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rin%3A+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+rna+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+assessment+of+transcriptome+profiling+using+RNA-seq+in+the+abrf+next-generation+sequencing+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study.</a> Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).</li>
<li>Nazarov, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+and+transcriptome+arrays+analyses+show+opposing+results+for+alternative+splicing+in+patient+derived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 443(2017).</li>
<li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung%2C+spleen%2C+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), (2019).</li>
<li>Scholes, A. N., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+isolation+methods+on+RNA-seq%3A+implications+for+differential+expression+and+meta-analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses.</a> BMC Genomics. 21 (1), 249(2020).</li>
<li>Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Rheumatology+Journal%22%5BJournal%5D)">The normal synovium.</a> Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).</li>
<li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing and analysis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).</li>
<li>Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+deep+phenotyping+in+osteoarthritis%3A+how+can+high+throughput+omics+technologies+advance+our+understanding+of+the+cellular+and+molecular+taxonomy+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage+Open%22%5BJournal%5D)">The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony protokół okazał się skuteczny w przypadku pobrania siedmiu pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów w celu ekstrakcji RNA (Tabela 1) i przetwarzania histologicznego (Figura 4). Przed pobraniem próbek od pacjentów konieczne jest ustalenie protokołu zatwierdzonego przez IRB, najlepiej we współpracy z chirurgiem lub zespołem chirurgicznym. Zastosowanie ustandaryzowanego protokołu pobierania próbek (np. resekcja ze spójnych lokalizacji in situ...

Kolano to największy staw maziowy w ludzkim ciele, składający się ze stawu piszczelowo-udowego między kością piszczelową a kością udową oraz stawu rzepkowo-udowego między rzepką a kością udową1. Kości w kolanie są wyściełane chrząstką stawową i wspierane przez różne tkanki łączne, w tym łąkotki, tłuszcz, więzadła i mięśnie, a błona maziowa otacza cały staw, tworząc jamę wypełnioną płynem maziowym1,2,3 (Rysunek 1). Zdrowe kolano funkcjonuje jako ruchomy przegub zawiasowy, który umożliwia ruch bez tarcia w płaszczyźnie czołowej1,3. W stanach patologicznych ruch może stać się ograniczony i bolesny. Najczęstszą chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego jest choroba zwyrodnieniowa stawów (OA)4. Wiadomo, że różne czynniki ryzyka predysponują do rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów, w tym między innymi starszy wiek, otyłość, płeć żeńska, urazy stawów i genetyka5,6. Obecnie szacuje się, że w USA jest 14 milionów osób z objawową chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego, przy czym częstość występowania wzrasta ze względu na rosnący wiek populacji i wskaźniki otyłości7,8. Początkowo uważana za chorobę chrząstki, obecnie jest rozumiana jako choroba całego stawu9. Do powszechnie obserwowanych zmian patologicznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów należą: erozja chrząstki stawowej, tworzenie się osteofitów, pogrubienie kości podchrzęstnej oraz zapalenie błony maziowej9,10. Ponieważ nie jest znane lekarstwo na chorobę zwyrodnieniową stawów, leczenie koncentruje się przede wszystkim na leczeniu objawów (np. bólu)11,12, a gdy choroba zwyrodnieniowa stawów postępuje do końcowego stadium, często zaleca się operację wymiany stawu13.
Operacje wymiany stawu mogą być częściową lub całkowitą wymianą stawu kolanowego, z całkowitą endoprotezoplastyką stawu kolanowego (TKA) obejmującą wymianę całego stawu piszczelowo-udowego i stawu rzepkowo-udowego. Od 2020 roku w USA każdego roku wykonywanych jest około 1 miliona TKAs14. Podczas TKA chirurg ortopeda wykonuje resekcję górnej części płaskowyżu piszczelowego i dolnych kłykci kości udowej (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A, 2B) w celu dopasowania implantów protetycznych. Czasami błędnie interpretowane przez pacjentów, w TKA tylko 8-10 mm jest wycinane od końca każdej kości, która jest następnie pokrywana lub ponownie wynurzana metalem. Umieszczona wkładka polietylenowa tworzy powierzchnię nośną (tj. wyściółkę) między dwoma metalowymi implantami. Ponadto kilka elementów tkanek miękkich stawu jest całkowicie lub częściowo wycinanych, aby uzyskać prawidłową równowagę stawu. Wśród tych tkanek znajdują się łąkotki przyśrodkowe i boczne (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 2C), poduszeczka tłuszczowa podrzepkowa (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 2D), więzadło krzyżowe przednie (ACL; <silna klasa="xfig">Rysunek 2E), błona maziowa (<silna klasa="xfig">Rycina 2F) i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy (VMO; <silna klasa="xfig">Rysunek 2G)15. Chociaż TKAs są zazwyczaj skuteczne w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów, około 20% pacjentów zgłasza nawrót bólu po operacji16. Wraz z wysokimi kosztami i względną inwazyjnością zabiegu, ograniczenia te wskazują na potrzebę dalszych badań w celu zidentyfikowania alternatywnych metod leczenia w celu złagodzenia postępu choroby zwyrodnieniowej stawów.
Aby zbadać mechanizmy chorobowe w chorobie zwyrodnieniowej stawów, które mogą stanowić nowe możliwości interwencji terapeutycznej, można użyć systemów eksperymentalnych, w tym komórek, eksplantatów tkanek i modeli zwierzęcych. Komórki są zwykle hodowane w monowarstwie i pochodzą z pierwotnych tkanek ludzkich lub zwierzęcych (np. chondrocytów wyizolowanych z chrząstki) lub komórek unieśmiertelnionych (np. ATDC517 i CHON-00118). Chociaż komórki mogą być przydatne do manipulowania zmiennymi eksperymentalnymi w kontrolowanym środowisku hodowli, nie rejestrują warunków naturalnego stawu, o których wiadomo, że wpływają na fenotypy komórek19. Aby lepiej podsumować złożoną kaskadę chemicznej, mechanicznej i międzykomórkowej komunikacji leżącej u podstaw choroby zwyrodnieniowej stawów, alternatywę znaleziono w pierwotnych próbkach tkanek ludzkich lub zwierzęcych, zarówno świeżych, jak i hodowanych ex vivo jako eksplantaty, w celu zachowania struktury tkankowej i mikrośrodowiska komórki20. W celu zbadania stawu in vivo przydatne są również małe (np. mouse21) i duże (np. horse22) modele zwierzęce pod kątem choroby zwyrodnieniowej stawów (np. poprzez indukcję chirurgiczną, zmiany genetyczne lub starzenie się). Jednak translacja z tych modeli na chorobę ludzką może być ograniczona między innymi przez różnice anatomiczne, fizjologiczne i metaboliczne23. Biorąc pod uwagę zalety i wady systemów eksperymentalnych, kluczowe zalety specyficzności gatunkowej i utrzymania niszy zewnątrzkomórkowej oferowanej przez pierwotne ludzkie tkanki zwyrodnieniowe zwyrodnieniowe zwiększają potencjał translacyjny wyników badań.
Pierwotne ludzkie tkanki zwyrodnieniowe stawów można łatwo uzyskać po TKA, co sprawia, że wysoka częstotliwość TKAs jest cennym źródłem do badań. Wśród potencjalnych zastosowań eksperymentalnych znajdują się ekspresja genów i analizy histologiczne. Aby zdać sobie sprawę z potencjału pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów dla tych i innych podejść badawczych, należy wziąć pod uwagę następujące kluczowe kwestie. Po pierwsze, wykorzystanie próbek od pacjentów podlega regulacjom etycznym, a protokoły muszą być zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB)24. Po drugie, nieodłączna heterogeniczność pierwotnych tkanek chorobowych człowieka oraz wpływ zmiennych, takich jak między innymi wiek i płeć, stwarzają potrzebę starannej selekcji pacjentów (tj. stosowania kryteriów kwalifikacyjnych) i interpretacji danych. Po trzecie, unikalne właściwości biologiczne różnych tkanek w stawie (np. niska komórkowość chrząstki i łąkotki25) mogą stanowić wyzwanie podczas eksperymentów (np. izolowanie wysokiej jakości i ilości RNA). Niniejszy raport odnosi się do tych rozważań i przedstawia protokół selekcji pacjentów, przetwarzania próbek, homogenizacji tkanek, ekstrakcji RNA i kontroli jakości (tj. oceny czystości i integralności RNA; <silna klasa="xfig">Rysunek 3) zachęcanie do wykorzystywania pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów w środowisku naukowym.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>05 402</td><td>Sterylne, bez nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.</td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Cardinal Health</td><td>C4320-101</td><td>Przechowywać w szafce chemicznej, gdy nie jest używany.</td></tr><tr><td>100% chloroform (klasa biologii molekularnej)</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19400290</td><td>Sterylny, bez nukleaz. Zarezerwowany tylko do pracy z RNA, przechowuj w komorze chemicznej, gdy nie jest używany.</td></tr><tr><td>100% etanol (klasa biologii molekularnej)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td>Sterylny, wolny od nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA, podczas rozcieńczania należy użyć DEPC/wody wolnej od nukleaz</td></tr>.<tr><td>100% Isopropanol (klasa biologii molekularnej)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327272500</td><td>Sterylny, wolny od nukleaz. Zarezerwowany tylko do pracy z RNA, przechowuj w komorze chemicznej, gdy nie jest używany.</td></tr><tr><td>100% odczynnik Alcohol</td><td>Cardinal Health</td><td>C4305</td><td>Rozcieńczony do 70% z dH2O do celów czyszczenia.</td></tr><tr><td>Sterylne naczynia hodowlane 15 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-003</td><td>Sterylne, bez nukleaz.</td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe (Falcon) 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14 959 53A</td><td>Sterylne, wolne od nukleaz.</td></tr><tr><td>2 ml kriowiale (z gwintem zewnętrznym)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10 500 26</td><td>Sterylne, bez nukleaz.</td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne 5 ml</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Sterylne, bez nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.</td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe (Falcon) 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12 565 271</td><td>Sterylne, wolne od nukleaz.</td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Do pomiaru integralności RNA.</td></tr><tr><td>Gabinet bezpieczeństwa biologicznego Ogólny</td><td>sprzęt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjny Obcinacze do kości</td><td>Fisher Scientific</td><td>08 990</td><td>Sterylizowane 70% EtOH.</td></tr><tr><td>Wyciąg chemiczny Ogólny</td><td>sprzęt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjny Skalpele jednorazowe (nr 10)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120032</td><td>Sterylne, bez nukleaz.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15-576-028</td><td>10% roztwór z dH2O.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td>sterylizowany 70% EtOH.</td></tr><tr><td>Glycoblue Coprecipitant</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td>Zarezerwowany wyłącznie do pracy z RNA, przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot Dewar</td><td>Ogólny sprzęt laboratoryjny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Zarezerwowane tylko do pracy z RNA, sterylizowane zgodnie z protokołem.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Do pomiarów czystości i wydajności RNA.</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz/uzdatniona DEPC</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Sterylna, bez nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.</td></tr><tr><td>PBS (sterylne)</td><td>Gibco</td><td>20 012 050</td><td>Sterylne, wolne od nukleaz.</td></tr><tr><td>Pipety (2 i mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L) & wskazówki</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td>Sterylne, wolne od nukleaz.</td></tr><tr><td>Zestaw miRNA Plasma/Serum Zaawansowany zestaw</td><td>Qiagen</td><td>217204</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo Scientific</td><td>50 197 8158</td><td>Sterylne, wolne od nukleaz.</td></tr><tr><td>RNAse Away/RNAseZap</td><td>Fisher Scientific</td><td> 7002</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka (rozmiar półmikro)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.</td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy</td><td>Pro Scientific</td><td>01-01200</td><td>Zarezerwowany tylko do pracy z RNA, sterylizowany zgodnie z protokołem.</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 596 026</td><td>Sterylne, wolne od nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.</td></tr></tbody></table>

pobieranie tkanek i ekstrakcja rna z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest przewlekłą i zwyrodnieniową chorobą stawów, najczęściej dotykającą kolano. Ponieważ obecnie nie ma lekarstwa, całkowita endoprotezoplastyka stawu kolanowego (TKA) jest powszechną interwencją chirurgiczną. Eksperymenty z wykorzystaniem pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów uzyskanych z TKA dają możliwość zbadania mechanizmów chorobowych ex vivo. Podczas gdy wcześniej sądzono, że choroba zwyrodnieniowa stawów wpływa głównie na chrząstkę, obecnie wiadomo, że wpływa na wiele tkanek w stawie. Protokół ten opisuje selekcję pacjentów, przetwarzanie próbek, homogenizację tkanek, ekstrakcję RNA i kontrolę jakości (w oparciu o czystość, integralność i wydajność RNA) z każdej z siedmiu unikalnych tkanek w celu wsparcia badania mechanizmu choroby w stawie kolanowym. Za świadomą zgodą pobrano próbki od pacjentów poddawanych TKA z powodu choroby zwyrodnieniowej stawów. Tkanki zostały wypreparowane, umyte i przechowywane w ciągu 4 godzin od operacji poprzez błyskawiczne zamrażanie w celu utrwalenia RNA lub formaliny do histologii. Pobrano tkanki, w tym chrząstkę stawową, kość podchrzęstną, łąkotkę, podrzepkową poduszeczkę tłuszczową, więzadło krzyżowe przednie, błonę maziową i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy. Protokoły ekstrakcji RNA zostały przetestowane dla każdego typu tkanki. Najbardziej znacząca modyfikacja dotyczyła metody dezintegracji stosowanej w przypadku tkanek twardych o niskiej liczbie komórek i wysokiej macierzy (uważanych za chrząstki, kości i łąkotki) w porównaniu ze stosunkowo wysokokomórkowymi tkankami miękkimi o niskiej macierzy (uważanymi za poduszeczkę tłuszczową, więzadła, błonę maziową i mięśnie). Stwierdzono, że proszkowanie jest odpowiednie dla tkanek twardych, a homogenizacja jest odpowiednia dla tkanek miękkich. Zaobserwowano skłonność niektórych osób do uzyskiwania wyższych wartości liczby integralności RNA (RIN) niż u innych osób w wielu tkankach, co sugeruje, że czynniki podstawowe, takie jak nasilenie choroby, mogą wpływać na jakość RNA. Zdolność do izolowania wysokiej jakości RNA z pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów stanowi fizjologicznie istotny model dla wyrafinowanych eksperymentów z ekspresją genów, w tym sekwencjonowania, które mogą prowadzić do wglądu klinicznego, który jest łatwiej przekładany na pacjentów.

Dostępnych jest siedem unikalnych rodzajów tkanek stawu kolanowego człowieka do pobrania od pacjentów poddawanych zabiegowi TKA z powodu OA (Rysunek 1). W niniejszym protokole każda z tych tkanek została zidentyfikowana i poddana obróbce w ciągu 4 h od usunięcia chirurgicznego (Rysunek 2). Postępując zgodnie z krokami opisanymi w Rycina 3, fragmenty każdej tkanki utrwalono w formalinie w celu oceny histologicznej (<strong class="xfi...

Pierwotne tkanki uzyskane od pacjentów po całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego dostarczają eksperymentalnego modelu do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów z maksymalną kliniczną przekładalnością. Protokół ten opisuje, w jaki sposób identyfikować, przetwarzać i izolować RNA z siedmiu unikalnych tkanek kolana w celu wsparcia badań mechanistycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów u ludzi.

Pobieranie tkanek i ekstrakcja RNA z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Protokół ten zachęca do wykorzystania pierwotnych tkanek ludzkich jako klinicznie istotnego modelu do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów. Przeprowadzanie analiz ekspresji genów i histologicznych w tych tkankach może dostarczyć nowych informacji mechanistycznych. Technika ta standaryzuje metody identyfikacji i przetwarzania elementów stawu kolanowego człowieka.Umożliwia ekstrakcję wysokiej jakości RNA, które spełnia wymagania dla dalszych testów ekspresji genów. Uzyskanie wysokiej jakości RNA z chorych tkanek stawowych jest wyzwaniem, dlatego nie należy lekceważyć znaczenia pozornie nieistotnych kroków, takich jak utrzymywanie wszystkiego w czystości i chłodzie. Procedurę zademonstrują Thomas Wilson, pracownik naukowy i Navdeep Kaur, doktor habilitowany z mojego laboratorium.Zacznij od zidentyfikowania tkanek twardych, w tym chrząstek, kości i łąkotki oraz tkanek miękkich, w tym poduszeczki tłuszczowej podrzepkowej, więzadła krzyżowego przedniego, błony maziowej i mięśnia skośnego obszernego przyśrodkowego z próbki na podstawie różnic w rozmiarze, kształcie, kolorze i teksturze. Pokrój każdą z tkanek na trzy sekcje. Opłucz skrawki tkanki sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości lub zanieczyszczenia.W celu ekstrakcji RNA pokrój każdy z trzech odcinków tkanki na około jedną do dwóch milimetrowych kostek. Przenieś mniejsze kawałki do dwumililitrowej fiolki kriogenicznej. Po szczelnym zabezpieczeniu nakrętek, błyskawicznie zamroź fiolki, zanurzając je w ciekłym azocie na 30 sekund, a następnie przenieś fiolkę do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania i powtórz tę procedurę dla wszystkich tkanek.Zhomogenizuj twardą tkankę za pomocą moździerza i tłuczka. Przed homogenizacją schłodzić moździerz, tłuczek i szpatułkę za pomocą ciekłego azotu, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Przetwarzaj tylko jedną próbkę na raz.Przenieść próbkę tkanki do zaprawy za pomocą schłodzonej szpatułki. Wlej ciekły azot na wierzch tkanki. Po odparowaniu ciekłego azotu zmiażdż tkankę tłuczkiem.Wielokrotnie dodawaj ciekły azot podczas mielenia tkanki, aby uzyskać drobny proszek tkankowy. Przenieś drobny proszek tkankowy do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, wstępnie schłodzonej, zanurzając ją w ciekłym azocie na 30 sekund. Dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu fenolu guanidyny kwasowej do każdej probówki i inkubuj probówki na lodzie przez 20 minut.Przed homogenizacją różnych twardych tkanek należy dokładnie oczyścić moździerz, tłuczek i szpatułkę 70% etanolem, następnie odkażaniem RNazy, a następnie wodą uzdatnioną DEPC. Namocz moździerz, tłuczek i szpatułkę w 70% etanolu, a następnie wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Homogenizuj tkankę miękką za pomocą homogenizatora tkankowego.W celu dezynfekcji homogenizatora umyj sondę, uruchamiając rurki z 70% etanolem i odkażaczem RNazy przez 30 sekund na mycie, a następnie przemyć wodą uzdatnioną DEPC, a następnie dodatkowym 70% etanolem, każda przez 30 sekund. Wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Dodaj jeden mililitr kwaśnego roztworu fenolu guanidyny do wstępnie oznakowanych, pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem i przenieś próbkę tkanki do probówki.Umieść probówkę na lodzie przez cały zabieg i homogenizuj tkankę przez maksymalnie pięć 32. impulsów lub do momentu, gdy tkanka zostanie wizualnie rozpuszczona. Inkubować homogenizowaną tkankę na lodzie, aż wszystkie próbki tkanek zostaną przetworzone. Zdezynfekować i oczyścić homogenizator przed przetworzeniem następnej próbki tkanki.Za pomocą sterylnych kleszczy usuń wszelkie kawałki tkanki znajdujące się w zębach sondy. Inkubuj całą homogenizowaną tkankę na lodzie przez dodatkowe 20 minut, a następnie przenieś próbkę tkanki do wstępnie oznakowanej, wstępnie schłodzonej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Siedem unikalnych tkanek ludzkiego stawu kolanowego uzyskanych od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów poddano obróbce w ciągu czterech godzin od chirurgicznego usunięcia.Tkanki zostały zidentyfikowane wizualnie i potwierdzone przez barwienie histologiczne H&E. Wycinki tkanek twardych, chrząstki stawowej, kości podchrzęstnej i łąkotki wybarwione metodą H&E uwidoczniono w sześciokrotnym i 40-krotnym powiększeniu. Podobnie, wybarwione H&E skrawki tkanek miękkich, podrzepkową poduszeczkę tłuszczową, więzadło krzyżowe przednie, mięsień maziowy i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy uwidoczniono w sześciokrotnym powiększeniu, a następnie w 40-krotnym powiększeniu.Ocena jakości wyekstrahowanego RNA wykazała obecność próbek wysokiej jakości w oparciu o integralność, wydajność i czystość, a także próbek niskiej jakości, co sugeruje, że pomimo zastosowania zoptymalizowanej metody, czynniki zewnętrzne, takie jak nasilenie choroby, mogą wpływać na jakość RNA w różnych tkankach tego samego pacjenta. Prawidłowa identyfikacja każdego typu tkanki jest niezbędna, aby umożliwić porównania wewnątrz- i międzytkankowe w obrębie próbek pobranych od pacjentów i między nimi, zwłaszcza biorąc pod uwagę znaczną niejednorodność tkanek pierwotnych chorobowych. Technologie sekwencjonowania szybko się rozwijają, a izolacja wysokiej jakości RNA jest kluczowym warunkiem wstępnym do wykorzystania tych technologii do rozwikłania mechanizmów specyficznych dla tkanek w złożonych, przewlekłych chorobach, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów.

tissue-collection-rna-extraction-from-human-osteoarthritic-knee

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Prezentujemy metodę badania wczesnych zmian zwyrodnieniowych stawów na poziomie komórkowym w chrząstce stawowej za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do wykrywania wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów

Ten protokół opisuje przygotowanie, badania biotribologiczne i analizę cylindrów kostno-chrzęstnych ślizgających się po metalowym materiale implantu. Miarami wyników zawartymi w tym protokole są aktywność metaboliczna, ekspresja genów i histologia.

Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Mikrosekcja mózgu szczura z podziałem na poszczególne obszary jest niezwykle istotna dla badania różnych chorób neurodegeneracyjnych. Niniejszy film demonstruje mikrosekcję czterech głównych obszarów mózgu, w tym oparyczu węchowego, kory czołowej, prążkowia oraz hipokampa w świeżej tkance mózgowej szczura. Przedstawiono pomocne wskazówki dotyczące szybkiego usuwania poszczególnych regionów, aby zapobiec degradacji RNA i białek w tkance.

Mikrodysekcja mózgu szczura w celu ekstrakcji RNA lub białek ze specyficznego obszaru mózgu

Izolacja RNA z komórek neuroprecursorowych z wykorzystaniem zestawu Bio-Rad Total RNA Kit

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Poznaj metodę ekstrakcji wysokiej jakości RNA z tkanek ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów i badania mechanizmów choroby.

Pobieranie tkanek i ekstrakcja RNA z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów

Przeglądaj więcej filmów