Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Technika, którą dziś prezentujemy, pozwala na analizę aktywności neuronów rdzenia kręgowego w wyniku wewnętrznego czynnika neuronalnego oraz wpływu otaczających astrocytów. Technika ta niezawodnie generuje zarówno ludzkie neurony, jak i ludzkie astrocyty, które są specyficzne dla rdzenia kręgowego i wykorzystuje funkcjonalną miarę wyjściową, którą można skalować w celu uzyskania odtwarzalności. Przedstawiona przez nas technika pozwala na badanie chorób specyficznych dla neuronów rdzenia kręgowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne, przy użyciu neuronów pochodzących od pacjentów z chorobami sporadycznymi lub genetycznymi.

Na początek zbadaj ludzkie płytki iPSC pod kątem wystarczająco gęstych kolonii, tak aby środek kolonii wykazywał rozproszone białe obszary. Następnie, aby rozpocząć pakowanie komórek, narysuj linie siatki na dolnej zewnętrznej powierzchni płytek za pomocą markera, aby ułatwić dokładne pokrycie całej płytki. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym o 10-krotnym powiększeniu w hodowli, aby odłączyć zróżnicowane kolonie poprzez ręczne zeskrobywanie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Następnie dwukrotnie przepłucz płytki PBS. A następnie dodaj pięć mililitrów proteazy dysocjacji tkanek wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do siedmiu minut, aż krawędzie kolonii zaczną się zaokrąglać, przed podniesieniem kolonii z płytki.

Ostrożnie odessać proteazę dysocjacyjną i delikatnie przepłukać płytkę dwukrotnie PBS, nie usuwając kolonii. Dodaj pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki iPSC dla ludzi do płytki hodowlanej. Następnie podrap całą płytkę końcówką pięciomililitrowej pipety, wykonując ruchy w przód iw tył od góry do dołu i podnieś kolonie, rozbijając je na mniejsze agregaty komórek.

Do różnicowania ludzkiego iPSC w neuronalne komórki progenitorowe. Gdy ludzki iPSC utworzy monowarstwę i stanie się w 90% zlewny, rozpocznij różnicowanie zgodnie z opisem w manuskrypcie. W 12 dniu, po leczeniu trypsyną, jeśli komórki nie są w zawiesinie, odłącz komórki mechanicznie, wyrzucając pożywkę do indukcji neuronów z końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów na komórki ruchem okrężnym, aby pokryć całą powierzchnię.

Jeśli hodowle neuronalnych komórek progenitorowych zostały zamrożone, rozmroź je. Po wymianie pożywki i płukaniu PBS zgodnie z opisem w manuskrypcie, zmień pożywkę na pożywkę do różnicowania neuronów ruchowych zawierającą 0,02 mikromolowego arabinozydu cytozyny, a następnie inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, gdy komórki progenitorowe zaangażowane glejowo wyłonią się jako pojedyncze proliferujące płaskie komórki pod postmitotycznymi progenitorami neuronu ruchowego, zagregowane w klastry komórek. Później dokonał wymiany nośnika, jak wskazano w rękopisie.

W dniu posiewu lub wcześniej należy rozpocząć powlekanie 24-dołkowych płytek MEA, najpierw rozcieńczając PLO w wodzie lub PBS. Następnie dodaj 15 do 20 mikrolitrów PLO do każdej studzienki, tworząc kroplę na środku studzienki, zakrywając obszar elektrody, upewniając się, że nie uszkodzisz elektrod końcówką pipety. Dodaj wodę do przegródek otaczających studnie, zapewniając odpowiednią wilgotność.

I inkubuj PLO w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Następnie za pomocą plastikowej końcówki do mikropipet odessać jak najwięcej PLO bez dotykania elektrod. Następnie umyj studnię trzykrotnie 250 mikrolitrami wody.

Za pomocą końcówki do pipet usuń jak najwięcej wody i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia ze zdjętą pokrywką. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów rozcieńczonej lamininy, aby pokryć każdy układ elektrod. Po dodaniu wody do komór wilgotnościowych i założeniu pokrywy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny do nocy.

W dniu posiewu, po jednokrotnym przepłukaniu neuronów ruchowych i kultur astrocytów PBS, dodaj 0,05% trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut, aby podnieść komórki. Zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej inhibitor trypsyny. I umyj talerze pożywką lub podstawą, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.

Granulować komórki przez centrację. A następnie za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ponownie zawiesić neurony ruchowe i astrocyty za pomocą pożywki do kohodowli zawierającej 20 mikromoli inhibitora ROCK, aby wytworzyć jeden mililitr zawiesiny pojedynczej komórki. Za pomocą hemocytometru policz neurony ruchowe i astrocyty.

A podczas liczenia zachowaj zawiesiny komórek i umieść je w styropianowym stojaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować jeden mililitr obu zawiesin komórkowych w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Oblicz żądaną objętość i ponownie zawieś granulki.

Połączyć wymaganą objętość zawiesin neuronów i astrocytów w równych proporcjach i delikatnie wymieszać, pipetując dwukrotnie, aby dokładnie się połączyć. Następnie usuń lamininę z każdej studzienki płytki i przenieś 10 mikrolitrów końcowej połączonej zawiesiny komórek do każdej studzienki, tworząc małą kropelkę pokrywającą układ elektrod. Inkubować płytki z niezakłóconą kroplą komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aby utworzyć początkowe przyczepy na płytkach.

Następnie odpipetować 250 mikrolitrów ciepłej pożywki do współhodowli zawierającej inhibitor ROCK na ściance każdej studzienki i odpipetować tę samą objętość na przeciwległej ściance każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin. Następnego dnia sprawdź płytki pod kątem zanieczyszczeń lub martwych komórek. W razie potrzeby należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do współhodowli zawierającą inhibitor ROCK.

W przeciwnym razie wykonuj wymianę połowy pożywki dwa razy w tygodniu, używając pożywki do kohodowli bez inhibitora ROCK, zaczynając od drugiego dnia wspólnej hodowli. Aby przeprowadzić nagranie, rozpocznij jak najszybciej po pierwszym dniu wspólnej hodowli, ustawiając temperaturę na 37 stopni Celsjusza i dwutlenek węgla na 5%Następnie przenieś płytki do maszyny nagrywającej i równoważ przez co najmniej pięć minut przed nagraniem. Rejestruj podstawową aktywność co drugi dzień lub co tydzień przez jedną do 15 minut, w zależności od projektu eksperymentalnego.

Aby zbadać przejściowe efekty elektrofizjologiczne związków celujących w neurony lub astrocyty, zdejmij pokrywę płytki, ale trzymaj pokrywę maszyny zamkniętą i rejestruj aktywność wyjściową przez co najmniej jedną minutę. Ręcznie otworzyć pokrywę maszyny bez zatrzymywania zapisu elektrofizjologicznego i wymienić 25 mikrolitrów pożywki na odpowiedni nośnik leku. Następnie zamknij pokrywę ręcznie i w razie potrzeby nagrywaj przez dodatkowe minuty.

Podobnie, przetestuj interesujący Cię lek. W tym protokole hiPSC były utrzymywane i pasażowane jako kolonie niezlewające się. Neurogeneza została zainicjowana poprzez podwójne hamowanie SMAD poprzez inaktywację szlaków BMP i TGF-beta.

Powstałe w ten sposób neuronalnie nabłonkowe komórki macierzyste podzieliły się i wytworzyły wielowarstwowy nabłonek. Wczesna ekspozycja na neuronalne czynniki wzrostu i glejowy rzęskowy czynnik neurotroficzny wygenerowała mieszaną populację komórek progenitorowych. Neurony wyłoniły się spontanicznie z tej mieszanej populacji.

Przełącznik glejowy indukował różnicowanie astrocytów poprzez aktywację szlaku JAK-STAT. Tożsamość rdzenia kręgowego leczonych inhibitorem notch i zróżnicowanych komórek neuronu ruchowego była wspierana przez wysoki poziom ekspresji acetylotransferazy choliny. W 90. dniu po hodowli in vitro ludzkie astrocyty iPSC wykazywały dojrzewający fenotyp, na co wskazuje ekspresja S100 beta i GFAP, podczas gdy ich regionalna tożsamość rdzenia kręgowego była wcześniej wspierana przez ekspresję jastrzębi.

Współhodowane komórki przegrupowywały się spontanicznie, a astrocyty tworzyły warstwę pokarmową na dole i neurony łączące sieci na górze. Neurony agregowały się w duże skupiska komórek, gdy były hodowane samodzielnie, podczas gdy wspólna hodowla ludzkich neuronów ruchowych iPSC z ludzkimi astrocytami iPSC skutkowała równomiernie rozmieszczonymi monowarstwami. Ludzkie astrocyty iPSC poprawiły elektrofizjologiczne dojrzewanie ludzkich neuronów ruchowych iPSC, o czym świadczy wyższy stopień aktywności impulsowej i pękającej w kokulturach.

Z naszego doświadczenia wynika, że hodowla komórek macierzystych i wczesne różnicowanie NPC są najtrudniejsze i najbardziej podatne na błędy techniczne. Na tym etapie techniki nie mogą być wykonywane z konsekwencją i dokładnością z niewielkim marginesem na rozwiązywanie problemów. Opisane tutaj techniki kohodowli mogą być również stosowane w innych modelach specyficznych dla typu komórki.