Name: Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologicznej analizy aktywności neuronów rdzenia kręgowego z udziałem astrocytów pochodzących z ludzkich komórek iPSC. Technika ta umożliwia badanie chorób neurodegeneracyjnych, w tym ALS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt został poparty następującymi dokumentami: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Nagroda za rozwój kariery naukowca klinicznego (CWH) Fundacji Charytatywnej Doris Duke. 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Dziękujemy dr Raha Dastgheyb i dr Normanowi Haugheyowi za dostarczenie platformy MEA i oprogramowania do analizy danych, które wykorzystaliśmy do walidacji opisanej platformy elektrofizjologicznej. Chcielibyśmy podziękować Khalilowi Rustowi za pomoc w demonstracji protokołu i filmowaniu.

<ol><li>Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Induced+pluripotent+stem+cells+and+the+search+for+new+cell-specific+ALS+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets.</a> Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multi-electrode+array+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li>
<li>Klapper, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+lineage+cells+are+essential+for+functional+neuronal+differentiation+and+synapse+maturation+in+human+iPSC-derived+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks.</a> Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+C9orf72+human+iPSC-derived+astrocytes+cause+non-cell+autonomous+motor+neuron+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology.</a> Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).</li>
<li>Almad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+in+astrocytes+contributes+to+motor+neuron+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).</li>
<li>Wainger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+membrane+hyperexcitability+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient-derived+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons.</a> Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).</li>
<li>Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+astrocytes%3A+Specification+and+relevance+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders.</a> Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).</li>
<li>Imaizumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+regional+identity+of+hPSC-derived+neurons+to+uncover+neuronal+subtype+specificity+of+neurological+disease+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).</li>
<li>Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+evaluation+of+convulsant+and+anticonvulsant+drugs+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+using+an+MEA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).</li>
<li>Haidet-Phillips, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocyte+progenitors+following+spinal+cord+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).</li>
<li>Roybon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+with+defined+mature+or+reactive+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes.</a> Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).</li>
<li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).</li>
<li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D+and+3D+neural+induction+methods+for+the+generation+of+neural+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li>
<li>Liu, H., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neuronal+and+glial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).</li>
<li>Borghese, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cells+delays+G1%2FS+phase+transition+and+accelerates+neuronal+differentiation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Do tej pory metody oparte na hiPSC i MEA do elektrofizjologicznych zapisów kokultur astrocytów i neuronów znalazły ograniczone zastosowanie w dziedzinie ALS6 i nadal nie na platformach w pełni ludzkich, w przeciwieństwie do ich bardziej rozpowszechnionego zastosowania do modelowania padaczki in vitro 9. Platforma ta ma jednak potencjał, aby odpowiedzieć na patofizjologicznie istotne pytania w badaniach nad ALS, takie jak mechanizmy nadpobudliwości neuronów, udział ...

Ludzkie astrocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-A) i neurony (hiPSC-N) są potężnymi narzędziami do modelowania patofizjologii stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) in vitro i stanowią paradygmat translacyjny dla strategii odkrywania leków1. Naukowcy wykazali, że kokultura hiPSC-A z hiPSC-N zwiększa morfologiczne, molekularne, elektrofizjologiczne i farmakologiczne dojrzewanie obu typów komórek, generując złożone sieci neuronowe i interakcje astrocyty-neurony, które przypominają ich odpowiedniki in vivo2,3. Podobne eksperymenty z kokulturą mogą podsumować cechy charakterystyczne patobiologii ALS, takie jak neurotoksyczność za pośrednictwem astrocytów4,5 i nadpobudliwość neuronalna6. Dodatkowo, dzięki postępom w protokołach różnicowania, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) mogą być różnicowane w regionalnie specyficzne podtypy neuronalne, w tym hiPSC-A i hiPSC-N7,8. Strategie te dają potencjał do modelowania patologii neuronów ruchowych kory mózgowej i rdzenia kręgowego w ALS, a także wpływu astrocytów na oba. Wymaga to jednak powtarzalnego testu funkcjonalnego w celu określenia tych efektów.
Ostatnio pokazano, że zapis z matrycą wieloelektrodową (MEA) jest szczególnie odpowiedni do elektrofizjologicznej charakterystyki kokultur neuronów i astrocytów2. W przeciwieństwie do analiz elektrofizjologicznych pojedynczych komórek, te matryce elektrod o dużej gęstości pasywnie rejestrują potencjały pola zewnątrzkomórkowego z dużych populacji neuronów, nie zakłócając warunków hodowli i zachowując integralność błon komórkowych. Platformy te są szczególnie przydatne do rejestrowania aktywności komórkowej i sieciowej kultur w czasie oraz w odpowiedzi na manipulacje farmakologiczne. Wreszcie, gdy obecność astrocytów jest zmienną hodowlaną, nagrania MEA mogą dostarczyć funkcjonalnego wglądu w dwukierunkowe interakcje astrocyta-neuron2,9.
Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół różnicowania hiPSC na rdzenia kręgowego hiPSC-A i hiPSC-neurony ruchowe (MN), który został wcześniej zweryfikowany2. Protokół różnicowania hiPSC-A rdzenia kręgowego konsekwentnie prowadzi do hodowli astrocytów, które są dodatnie dla białka B wiążącego wapń S100 (S100β), kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i Homeobox B4 (HOXB4) odpowiednio w maksymalnie 80%, 50% i 90% komórek, co wskazuje na dojrzewającą specyfikację gleju i rdzenia kręgowego2,10. Protokół różnicowania hiPSC-MN generuje neurony, które są >90% dodatnie dla acetylotransferazy choliny (ChAT), co sugeruje tożsamość dojrzałego neuronu ruchowego alfa2. Ponadto w protokole opisano techniki generowania kokultur hiPSC-A/MN, w przypadku których wykazano wcześniej, że skutkują neuronami o zwiększonej złożoności morfologicznej za pomocą analizy Scholla i mikroskopii immunofluorescencyjnej w porównaniu z kulturami neuronów bez astrocytów lub z astrocytami gryzoni2. Chociaż opisy te są specyficzne dla rdzenia kręgowego hiPSC-A i hiPSC-N, unikalną zaletą jest to, że początkowa niezależna hodowla astrocytów i neuronów, po której następują kroki do kohodowli w późniejszych punktach czasowych, może zostać przetłumaczona w celu zbadania skutków interakcji neuron-astrocyty z innych określonych regionów, a także komórek specyficznych dla choroby7,8. Wreszcie, protokół opisuje, w jaki sposób hodować te kultury na płytkach MEA, tak aby aktywność funkcjonalna jako czynnik składu kokultury mogła być badana w czasie z możliwością manipulowania składem komórkowym, a także warunkami hodowli.
Celem tych protokołów jest dostarczenie funkcjonalnego testu do badania interakcji astrocytów-neuronów, badania zmian specyficznych dla choroby i testowania leków o potencjale terapeutycznym w dziedzinie ALS. Instrukcje wideo są dostępne dla najtrudniejszych kroków tego protokołu.

<table><tbody><tr><td>10 cm sterylne płytki hodowlane</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 sterylne kolby</td><td>hodowlane Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Thermofisher</td><td>21985023</td><td>Stężenie robocze 110 &mikro; M</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mikro; m CA System filtrów</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe sterylne płytki hodowlane</td><td>Falcon</td><td>3046</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Stężenie robocze 2,0 i mu; g / ml</td></tr><tr><td>Anionowy detergent z enzymem proteazy - Terg-A-Zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>Stężenie robocze 1% m/v</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy (ASAC)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>Rozpuść 100 mg w 250 ml dH2O, aby uzyskać 0,4 mg / ml zapasu. Sterylny filtr przez 0,22 &mikro; m przefiltrować, podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 0,4 i mikro; g/ml).</td></tr><tr><td>Płytki Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)</td><td>Platforma Axion</td><td>OPT-24</td><td></td></tr><tr><td>Axion Edge MEA</td><td>Matryca membranowa Axion</td><td>Maestro Edge</td><td></td></tr><tr><td>Basement - Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Szczegóły w protokole</td></tr><tr><td>Mikroskop stacjonarny (sterylny pod kapturem do hodowli komórkowych)</td><td>Zeiss</td><td>415510-1100-000</td><td>Primo Vert</td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14340</td><td>Stężenie robocze10 &mu; M</td></tr><tr><td>Rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)</td><td>Peprotech</td><td>450-13</td><td>Rozpuścić 100 &mikro; g w 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 &mikro; g/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).</td></tr><tr><td>Zbiorniki CO2 i reduktor do Axion Edge</td><td>AirGas/Harris</td><td>9296NC</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Abcam</td><td>ab142164</td><td>Rozpuszczanie 250 &mikro; g w 2.0387 mL DMSO, aby uzyskać 250 &mikro; M zapasów. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:2000 do użycia. (stężenie robocze 125 nM).</td></tr><tr><td>Cyjankiksalina&nbsp; (CNQX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C239</td><td>Stężenie robocze 50 &mu; M</td></tr><tr><td>Kwas dihydrokainowy (DHK)</td><td>Tocris</td><td>111</td><td>Stężenie robocze 50 &mu; M oraz 300 &mu; M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>113300</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium + Essential 8 Suplement</td><td>Thermofisher</td><td>A1517001</td><td>Połącz 10 ml Essential 8 (10x)&nbsp; suplementu z 500 ml pożywki wzrostowej Essential 8 (1x)</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermofisher</td><td>16140071</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Rozpuścić 100 &mikro; g w 1 ml PBS do 100 i mikro; g/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 &mikro; g/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Mikroskopia wyborcza Nauki</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Millipore-sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>Rozpuść 200 mg w 100 ml PBS, aby uzyskać roztwór podstawowy 2 mg / mL. Porcjować bulion w 15 ml i 500 &mikro; Rury L. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 2 i mikro; g/ml).</td></tr><tr><td>Kontrolowana wilgotność Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td>ustawiony na 37 &ordm; C, 5 % CO2</td></tr><tr><td>Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)R</td><td>& Systemy D</td><td>291-G1-200</td><td>Rozpuszczanie 200 &mikro; g w 2 ml PBS do 100 i mikro; g / ml, a następnie dodaj 18 ml 0,1% BSA-PBS, aby uzyskać 10 &mikro; g/ml przechowywać w temperaturze -80 „ C. Podwielokrotność i zamrażać w temperaturze -80 „ C. Rozcieńczyć 10  � g/ml zapas w stosunku 1: 1000 do użytku. (stężenie robocze 10 ng/ml).</td></tr><tr><td>Kwas kainc</td><td>Abcam</td><td>ab144490</td><td>Stężenie robocze 5 &mu; </td></tr><tr><td>M Zamiennik surowicy nokautującej (KSR)</td><td>Thermofisher</td><td>10828</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher</td><td>23017-015</td><td>Roztwór podstawowy 1 mg/ml, stężenie robocze 10 i mikro; g/ml (powłoka), 1 i mikro; g/ml (pożywka komórkowa)</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Rozpuścić 2 mg LDN w 500 &mikro; L chloroformu, aby uzyskać 10 mM zapasu. Podziel to i zamroź w temperaturze -80 &ordm;C. Przed użyciem najpierw rozcieńczyć materiał od 1 do 10 w DMSO [do 1 mM], a następnie rozcieńczyć 1:5000 z 1 mM w żądanym medium, aby uzyskać 0,2 i mikro; Roztwór roboczy M</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermofisher</td><td>25030</td><td>Stężenie robocze 100x</td></tr><tr><td>płytki szklane MEA Systemy</td><td>wielokanałowe</td><td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td><td></td></tr><tr><td>Pipet wielokanałowy P200</td><td>Gilson</td><td>PJ22224</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Thermofisher</td><td>11140050</td><td>Stężenie robocze 100x</td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycyna</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Stężenie robocze 100x</td></tr><tr><td>Poliornityna (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td>Rozpuść 100 mg w 1 ml ddW, aby uzyskać 100 mg/ml roztworu podstawowego. Podziel zapas na 100 &mikro; Rury L. (stężenie robocze 100 &mikro; g / ml)</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Stężenie robocze100 mM</td></tr><tr><td>Purmorphamine (PMN)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>540223</td><td>Rozpuść 5 mg w 9,6 ml DMSO, aby uzyskać 1 mM roztworu. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 1 i mikro; M).</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego i mózgu (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Wirować na krótko przed rozpuszczeniem. Rozpuścić 100 &mikro; g w 1 ml PBS do 100 i mikro; g/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 &mikro; g/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).</td></tr><tr><td>Kwas retinowy (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Rozpuść 100 mg w 3,3 ml DMSO, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego. Podziel zapas 100 &mikro; L/probówkę i zamrozić w temperaturze -80 &ordm;C. Weź 200 i mikro; L 100 mM zapasu i rozcieńczyć 10x (dodać 1,8 ml DMSO), aby uzyskać 10 mM zapasu. Porcja 50 &mikro; L/rura&nbsp; i przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:10000 do użycia. (stężenie robocze 2 i mikro; M).</td></tr><tr><td>ROCK-I nhibitor</td><td>Peprotech</td><td>1293823</td><td>Rozpuścić 5 mg w 1480 &mikro; L dH2O, aby uzyskać 10 mM zapasu, podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 &ordm;C. Rozcieńczyć w temperaturze 1: 500 do użycia. (stężenie robocze 20 &mikro; M).</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>Rozpuść 5 mg w 1,3 ml DMSO, aby uzyskać 10 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (Działający Con 10 & Micro; M)</td></tr> <tr><td>Sterylne kaptury do hodowli komórkowych</td><td>Baker Company</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B - B27 Suplement</td><td>Thermofisher</td><td>21985023</td><td>Stężenie robocze 50x</td></tr><tr><td>Suplement N - N2 Suplement</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Stężenie robocze 100x</td></tr><tr><td>Wirówka do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>75004261</td><td>Sorvall Legend X1R</td></tr><tr><td>Tworzywo termoplastyczne&nbsp; film - Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza dysocjacji tkanek - Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Rozpuść 1g w 100 ml ddH2O, aby uzyskać zapas 10 mg / mL. Porcję i przechowywać w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 objętości trypsyny do użycia. (stężenie robocze 1 mg/ml).</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Thermofisher</td><td>2530054</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>ThermoFisher</td><td>2332</td><td>Isotemp</td></tr></tbody></table>

stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania als z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Ludzkie astrocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-A) i neurony (hiPSC-N) dostarczają potężnego narzędzia do modelowania patofizjologii stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) in vitro. Zapisy z matrycą wieloelektrodową (MEA) są sposobem na rejestrowanie potencjałów pola elektrycznego z dużych populacji neuronów i analizowanie aktywności sieci w czasie. Wcześniej wykazano, że obecność hiPSC-A, które są różnicowane za pomocą technik promowania fenotypu astrocytów rdzenia kręgowego, poprawiła dojrzewanie i aktywność elektrofizjologiczną regionalnie specyficznych neuronów ruchowych hiPSC rdzenia kręgowego (MN) w porównaniu z tymi hodowanymi bez hiPSC-A lub w obecności astrocytów gryzoni. Opisano metodę kohodowli rdzenia kręgowego hiPSC-A z hiPSC-MN i rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej za pomocą zapisów MEA. Podczas gdy opisane tutaj protokoły różnicowania są specyficzne dla astrocytów i neuronów, które są regionalnie specyficzne dla rdzenia kręgowego, platforma kokulturowania może być stosowana do astrocytów i neuronów zróżnicowanych za pomocą technik specyficznych dla innych losów, w tym korowych hiPSC-A i hiPSC-N. Protokoły te mają na celu dostarczenie testu elektrofizjologicznego w celu poinformowania o interakcjach glej-neuron i zapewnienie platformy do testowania leków o potencjale terapeutycznym w ALS.

Protokół wzorcowania rdzenia kręgowego w celu generowania hiPSC-MN oraz rdzeniowych hiPSC-A przedstawiono na Rysunku 1. W tym protokole hiPSC są hodowane i pasażowane jako kolonie niezrastające się (Rysunek 2A). Neurogenezę inicjuje się (indukcja neuronalna) poprzez podwójne hamowanie SMAD za pomocą dodatku LDN193189 i SB431542, co prowadzi do inaktywacji odpowiednio szlaków białka morfogenetycznego kości (BMP) oraz czynnika wzrostu przekształcającego beta (TGF-...

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

Technika, którą dziś prezentujemy, pozwala na analizę aktywności neuronów rdzenia kręgowego w wyniku wewnętrznego czynnika neuronalnego oraz wpływu otaczających astrocytów. Technika ta niezawodnie generuje zarówno ludzkie neurony, jak i ludzkie astrocyty, które są specyficzne dla rdzenia kręgowego i wykorzystuje funkcjonalną miarę wyjściową, którą można skalować w celu uzyskania odtwarzalności. Przedstawiona przez nas technika pozwala na badanie chorób specyficznych dla neuronów rdzenia kręgowego, takich jak stwardnienie zanikowe boczne, przy użyciu neuronów pochodzących od pacjentów z chorobami sporadycznymi lub genetycznymi.Na początek zbadaj ludzkie płytki iPSC pod kątem wystarczająco gęstych kolonii, tak aby środek kolonii wykazywał rozproszone białe obszary. Następnie, aby rozpocząć pakowanie komórek, narysuj linie siatki na dolnej zewnętrznej powierzchni płytek za pomocą markera, aby ułatwić dokładne pokrycie całej płytki. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym o 10-krotnym powiększeniu w hodowli, aby odłączyć zróżnicowane kolonie poprzez ręczne zeskrobywanie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Następnie dwukrotnie przepłucz płytki PBS. A następnie dodaj pięć mililitrów proteazy dysocjacji tkanek wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do siedmiu minut, aż krawędzie kolonii zaczną się zaokrąglać, przed podniesieniem kolonii z płytki.Ostrożnie odessać proteazę dysocjacyjną i delikatnie przepłukać płytkę dwukrotnie PBS, nie usuwając kolonii. Dodaj pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki iPSC dla ludzi do płytki hodowlanej. Następnie podrap całą płytkę końcówką pięciomililitrowej pipety, wykonując ruchy w przód iw tył od góry do dołu i podnieś kolonie, rozbijając je na mniejsze agregaty komórek.Do różnicowania ludzkiego iPSC w neuronalne komórki progenitorowe. Gdy ludzki iPSC utworzy monowarstwę i stanie się w 90% zlewny, rozpocznij różnicowanie zgodnie z opisem w manuskrypcie. W 12 dniu, po leczeniu trypsyną, jeśli komórki nie są w zawiesinie, odłącz komórki mechanicznie, wyrzucając pożywkę do indukcji neuronów z końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów na komórki ruchem okrężnym, aby pokryć całą powierzchnię.Jeśli hodowle neuronalnych komórek progenitorowych zostały zamrożone, rozmroź je. Po wymianie pożywki i płukaniu PBS zgodnie z opisem w manuskrypcie, zmień pożywkę na pożywkę do różnicowania neuronów ruchowych zawierającą 0,02 mikromolowego arabinozydu cytozyny, a następnie inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, gdy komórki progenitorowe zaangażowane glejowo wyłonią się jako pojedyncze proliferujące płaskie komórki pod postmitotycznymi progenitorami neuronu ruchowego, zagregowane w klastry komórek. Później dokonał wymiany nośnika, jak wskazano w rękopisie.W dniu posiewu lub wcześniej należy rozpocząć powlekanie 24-dołkowych płytek MEA, najpierw rozcieńczając PLO w wodzie lub PBS. Następnie dodaj 15 do 20 mikrolitrów PLO do każdej studzienki, tworząc kroplę na środku studzienki, zakrywając obszar elektrody, upewniając się, że nie uszkodzisz elektrod końcówką pipety. Dodaj wodę do przegródek otaczających studnie, zapewniając odpowiednią wilgotność.I inkubuj PLO w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Następnie za pomocą plastikowej końcówki do mikropipet odessać jak najwięcej PLO bez dotykania elektrod. Następnie umyj studnię trzykrotnie 250 mikrolitrami wody.Za pomocą końcówki do pipet usuń jak najwięcej wody i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia ze zdjętą pokrywką. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów rozcieńczonej lamininy, aby pokryć każdy układ elektrod. Po dodaniu wody do komór wilgotnościowych i założeniu pokrywy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny do nocy.W dniu posiewu, po jednokrotnym przepłukaniu neuronów ruchowych i kultur astrocytów PBS, dodaj 0,05% trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć minut, aby podnieść komórki. Zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej inhibitor trypsyny. I umyj talerze pożywką lub podstawą, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.Granulować komórki przez centrację. A następnie za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ponownie zawiesić neurony ruchowe i astrocyty za pomocą pożywki do kohodowli zawierającej 20 mikromoli inhibitora ROCK, aby wytworzyć jeden mililitr zawiesiny pojedynczej komórki. Za pomocą hemocytometru policz neurony ruchowe i astrocyty.A podczas liczenia zachowaj zawiesiny komórek i umieść je w styropianowym stojaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować jeden mililitr obu zawiesin komórkowych w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Oblicz żądaną objętość i ponownie zawieś granulki.Połączyć wymaganą objętość zawiesin neuronów i astrocytów w równych proporcjach i delikatnie wymieszać, pipetując dwukrotnie, aby dokładnie się połączyć. Następnie usuń lamininę z każdej studzienki płytki i przenieś 10 mikrolitrów końcowej połączonej zawiesiny komórek do każdej studzienki, tworząc małą kropelkę pokrywającą układ elektrod. Inkubować płytki z niezakłóconą kroplą komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aby utworzyć początkowe przyczepy na płytkach.Następnie odpipetować 250 mikrolitrów ciepłej pożywki do współhodowli zawierającej inhibitor ROCK na ściance każdej studzienki i odpipetować tę samą objętość na przeciwległej ściance każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin. Następnego dnia sprawdź płytki pod kątem zanieczyszczeń lub martwych komórek. W razie potrzeby należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do współhodowli zawierającą inhibitor ROCK.W przeciwnym razie wykonuj wymianę połowy pożywki dwa razy w tygodniu, używając pożywki do kohodowli bez inhibitora ROCK, zaczynając od drugiego dnia wspólnej hodowli. Aby przeprowadzić nagranie, rozpocznij jak najszybciej po pierwszym dniu wspólnej hodowli, ustawiając temperaturę na 37 stopni Celsjusza i dwutlenek węgla na 5%Następnie przenieś płytki do maszyny nagrywającej i równoważ przez co najmniej pięć minut przed nagraniem. Rejestruj podstawową aktywność co drugi dzień lub co tydzień przez jedną do 15 minut, w zależności od projektu eksperymentalnego.Aby zbadać przejściowe efekty elektrofizjologiczne związków celujących w neurony lub astrocyty, zdejmij pokrywę płytki, ale trzymaj pokrywę maszyny zamkniętą i rejestruj aktywność wyjściową przez co najmniej jedną minutę. Ręcznie otworzyć pokrywę maszyny bez zatrzymywania zapisu elektrofizjologicznego i wymienić 25 mikrolitrów pożywki na odpowiedni nośnik leku. Następnie zamknij pokrywę ręcznie i w razie potrzeby nagrywaj przez dodatkowe minuty.Podobnie, przetestuj interesujący Cię lek. W tym protokole hiPSC były utrzymywane i pasażowane jako kolonie niezlewające się. Neurogeneza została zainicjowana poprzez podwójne hamowanie SMAD poprzez inaktywację szlaków BMP i TGF-beta.Powstałe w ten sposób neuronalnie nabłonkowe komórki macierzyste podzieliły się i wytworzyły wielowarstwowy nabłonek. Wczesna ekspozycja na neuronalne czynniki wzrostu i glejowy rzęskowy czynnik neurotroficzny wygenerowała mieszaną populację komórek progenitorowych. Neurony wyłoniły się spontanicznie z tej mieszanej populacji.Przełącznik glejowy indukował różnicowanie astrocytów poprzez aktywację szlaku JAK-STAT. Tożsamość rdzenia kręgowego leczonych inhibitorem notch i zróżnicowanych komórek neuronu ruchowego była wspierana przez wysoki poziom ekspresji acetylotransferazy choliny. W 90. dniu po hodowli in vitro ludzkie astrocyty iPSC wykazywały dojrzewający fenotyp, na co wskazuje ekspresja S100 beta i GFAP, podczas gdy ich regionalna tożsamość rdzenia kręgowego była wcześniej wspierana przez ekspresję jastrzębi.Współhodowane komórki przegrupowywały się spontanicznie, a astrocyty tworzyły warstwę pokarmową na dole i neurony łączące sieci na górze. Neurony agregowały się w duże skupiska komórek, gdy były hodowane samodzielnie, podczas gdy wspólna hodowla ludzkich neuronów ruchowych iPSC z ludzkimi astrocytami iPSC skutkowała równomiernie rozmieszczonymi monowarstwami. Ludzkie astrocyty iPSC poprawiły elektrofizjologiczne dojrzewanie ludzkich neuronów ruchowych iPSC, o czym świadczy wyższy stopień aktywności impulsowej i pękającej w kokulturach.Z naszego doświadczenia wynika, że hodowla komórek macierzystych i wczesne różnicowanie NPC są najtrudniejsze i najbardziej podatne na błędy techniczne. Na tym etapie techniki nie mogą być wykonywane z konsekwencją i dokładnością z niewielkim marginesem na rozwiązywanie problemów. Opisane tutaj techniki kohodowli mogą być również stosowane w innych modelach specyficznych dla typu komórki.

establishment-an-electrophysiological-platform-for-modeling-als-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje metodę generowania astrosfer z komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Polega na wzroście i proliferacji komórek macierzystych z pożywkami zawierającymi czynniki wzrostu i inhibitory kinaz. Komórki te następnie agregują się i różnicują w astrocyty, tworząc astrosfery.

Generowanie i utrzymywanie astrosfer przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film prezentuje metodę różnicowania nerwowych komórek progenitorowych rdzenia kręgowego (NPC) w neurony ruchowe. Szczegółowo opisuje proces hodowli NPC na powlekanej płytce hodowlanej przy użyciu specjalistycznych pożywek wzbogaconych specyficznymi inhibitorami, których celem jest ułatwienie różnicowania NPC w dojrzałe neurony ruchowe.

Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych rdzenia kręgowego w neurony ruchowe

Ten film demonstruje ustanowienie wspólnej kultury neuronów i astrocytów do rejestrowania aktywności sieci neuronalnej. Po ustaleniu wspólnej hodowli neuronów ruchowych i astrocytów na płytce z matrycą wieloelektrodową (MEA), synchroniczna rytmiczna aktywność elektryczna sieci neuronalnej została zarejestrowana zewnątrzkomórkowo za pomocą MEA.

Rejestrowanie aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnej w kokulturze neuron-astrocyt

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę elektrofizjologicznej analizy aktywności neuronów rdzenia kręgowego z udziałem astrocytów pochodzących z ludzkich komórek iPSC. Technika ta umożliwia badanie chorób neurodegeneracyjnych, w tym ALS.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów