Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Protokół ten jest istotny, ponieważ szczegółowo opisuje, jak szybko wygenerować duże ilości matrycy DNA do wykorzystania w reakcjach bezkomórkowych z małego fragmentu genu otrzymanego z zakładu syntezy. Amplifikacja toczącego się koła może generować duże ilości DNA szybciej niż tradycyjne klonowanie. Dzięki temu obsługuje cykle projektowania i testowania o wyższej przepustowości z bibliotek syntetycznego DNA.

Techniki te mogą mieć dużą nieodłączną zmienność dla nowych użytkowników ze względu na wiele wymaganych kroków i małe ilości. Należy zwrócić szczególną uwagę na technikę, a praktyka czyni mistrza. Aby rozpocząć, dodaj wszystkie składniki z zestawu do PCR w jednej probówce do PCR.

Następnie dodaj jeden mikrolitr zawieszonego fragmentu genu. Delikatnie homogenizuj mieszaninę, wirując na średnim poziomie przez pięć do 10 sekund. Po zaprogramowaniu termocyklera zgodnie z protokołem producenta zestawu, uruchom PCR.

Po zakończeniu PCR użyj zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić DNA z mieszaniny reakcyjnej. W probówce o pojemności 1,5 mililitra dodaj bufor wiążący DNA i próbkę PCR w stosunku pięć do jednego. Przenieść tę mieszaninę do kolumny wirowej i odwirować przy 16 000 razy G przez jedną minutę.

Odrzuć przepływ. Dodać 200 mikrolitrów buforu do przemywania DNA do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Ponownie odwirować kolumnę i odrzucić przepływ.

Przemyć kolumnę jeszcze raz buforem do przemywania DNA, jak pokazano. Po odrzuceniu przepływu z drugiego płukania usunąć pozostały bufor, odwirowując kolumnę przez dodatkową jedną do dwóch minut. Aby wymyć DNA, przenieś kolumnę do nowej 1,5-mililitrowej probówki.

Następnie dodaj 46 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do kolumny. Po jednominutowej inkubacji zebrać DNA do probówki przez odwirowanie. I oznacz ilościowo oczyszczone DNA za pomocą spektrofotometru.

Aby trawić i krążyć DNA, połącz pięć mikrolitrów niezbędnego buforu reakcyjnego, 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII i 45 mikrolitrów oczyszczonego DNA w probówce PCR. Za pomocą pipety delikatnie homogenizuj tę mieszaninę. Następnie inkubuj go w termocyklerze przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu inkubacji termiczna dezaktywuj enzym HindIII przez inkubację przez 20 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mikrolitrów buforu ligazy T4 i 800 jednostek ligazy T4 do nowo strawionego DNA. Po delikatnym wymieszaniu pipetą inkubować mieszaninę przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby przeprowadzić reakcję cyrkularyzacji.

Po zakończeniu reakcji oczyść DNA za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, jak pokazano wcześniej. Następnie określ ilościowo DNA. Aby przeprowadzić amplifikację toczącego się koła, połącz wszystkie składniki reakcji i jeden mikrolitr oczyszczonej okrągłej matrycy ekspresyjnej w jednej probówce.

Homogenizować mieszaninę za pomocą pipety i podaszkować 10 mikrolitrów mieszaniny do czterech oddzielnych probówek. Inkubować probówki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery do 18 godzin, a następnie podgrzewać dezaktywować enzym przez inkubację w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inaktywacji ciepła pobudź kondensację na dnie probówki, inkubując w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie rozcieńczyć powstały roztwór, dodając 15 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do każdej probówki. Połączyć zawartość każdej probówki przed oczyszczeniem i określeniem ilościowym DNA, jak wykazano wcześniej. Aby przeprowadzić reakcję bezkomórkową, dodaj różne wymagane składniki do probówki i rozcieńcz do ostatecznej pożądanej objętości wodą podwójnie destylowaną.

Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując połowę roztworu w górę i w dół 10 do 20 razy. Przenieść mieszaninę reakcyjną w podwielokrotnościach o pojemności 15 mikrolitrów do żądanych studzienek na płytce mikromiareczkowej. Następnie uszczelnij płytkę bezbarwną folią uszczelniającą, aby utrzymać wilgotność i zapobiec parowaniu.

Umieścić zapieczętowaną płytkę w czytniku płytek i pozwolić, aby reakcja postępowała do końca. W przypadku ekspresji genu BPN subtylizyny przy użyciu systemu bezkomórkowego, podwielokrotność 94 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i jeden mikrolitr 10 mikromolowych PNA w płaskodennej, bezbarwnej 96-dołkowej płytce. Następnie dodaj pięć mikrolitrów zakończonej reakcji bezkomórkowej i odczytaj płytkę za pomocą czytnika płytek ustawionego na pomiar absorbancji przy 410 nanometrach co 20 sekund przez 10 minut przy zachowaniu temperatury 25 stopni Celsjusza.

Ekspresja Superfoldera GFP w ekstrakcie gwiazdowym BL21 DE3 przy użyciu tylko 3 mikrolitrów nieoczyszczonego DNA RCA w reakcji 15 mikrolitrów jest porównywalna z ekspresją plazmidu PJL1. Podwojenie i potrojenie ilości matrycy wydaje się nie oferować żadnych oczywistych korzyści, co sugeruje już nasycone poziomy matrycy przy 3 mikrolitrach na reakcję. I odwrotnie, wydaje się, że istnieje korzyść ze zwiększenia ilości matrycy RCA podczas korzystania z ekstraktu komórek szczepu shuffle.

Białka wymagające niższych temperatur lub dłuższego czasu składania wpływają na czas potrzebny do ukończenia całego przepływu pracy. Na przykład oznaczanie subtylizyny po czterech godzinach ekspresji prowadzi do nieudanego wyniku, ponieważ cztery godziny nie wystarczą do dojrzewania subtylizyny. Jednak pozostawienie reakcji do 16 godzin prowadzi do wykrywalnych poziomów subtylizyny.

Wszystkie komponenty muszą być dobrze wymieszane, aby ten protokół działał z maksymalną wydajnością. Stosując te metody, można syntetycznie wygenerować dużą bibliotekę potencjalnych białek, a następnie wyrazić je z wydajnością wystarczającą do charakteryzacji. Ta metoda utorowała naszej grupie drogę do opracowania dwóch czujników N-C, które mogą działać w ekstraktach komórkowych, co pozwoliło nam szybko scharakteryzować prototypowe białko.

Umożliwi nam to szybsze i inteligentniejsze prace nad projektowaniem białek w nowych biokatalizatorach i terapiach.