Name: Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj szybką metodę enzymatyczną amplifikacji minimalnych liniowych matryc DNA do prototypowania białek w systemach bezkomórkowych. Protokół wykorzystuje izotermiczną amplifikację rolling circle, umożliwiając szybsze przygotowanie szablonów niż tradycyjne klonowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują NIH 1R35GM138265-01 i NSF 2029532 za częściowe wsparcie tego projektu.

1. Projektowanie fragmentu genu
UWAGA: Fragment genu powinien zawierać wszystkie niezbędne elementy genetyczne do transkrypcji/translacji, w tym promotor, miejsce wiązania rybosomów (RBS), kodon start, gen będący przedmiotem zainteresowania i terminator. Chociaż terminator nie jest konieczny dla szablonu wyrażenia liniowego (LET), będzie ważny, jeśli użytkownik zdecyduje się wstawić sekwencję do plazmidu. Sekwencje te zostały pobrane z plazmidu pJL1-sfGFP class<="xref">55 (dar z laboratorium Michaela Jewetta), który wykorzystuje promotor T7. Oprócz tych niezbędnych elementów genetycznych, miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego dodaje się sześć par zasad przed promotorem (miejsce cięcia 5') i kolejne sześć par zasad po terminatorze (miejsce cięcia 3'), w tym przypadku przy użyciu HindIII (można użyć innych enzymów restrykcyjnych, ale pomocna jest standaryzacja sekwencji za pomocą jednego enzymu restrykcyjnego o wysokiej wierności, aby zmniejszyć liczbę potrzebną do przechowywania w bibliotece). Miejsca podkładu są dodawane dziesięć par zasad przed miejscem cięcia 5' i dziesięć par zasad poniżej miejsca cięcia 3', w tym przypadku przy użyciu znormalizowanych sekwencji starterów M13 (startery są niedrogimi pozycjami magazynowymi). Miejsce enzymu restrykcyjnego i użyte startery zależą od uznania użytkownika. Użytkownik musi jednak upewnić się, że sekwencje nie są obecne nigdzie indziej w szablonie (nie chce tworzyć niechcianych cięć lub miejsc inicjacji amplifikacji). Sekwencje szablonów użytych w tej pracy są szczegółowo opisane w materiale dodatkowym. Te kroki służą do modyfikowania na podstawie tego szablonu podstawowego.
<ol>
	<li>Określić pożądany gen, który ma ulec ekspresji, i uzyskać sekwencję aminokwasów lub sekwencję genetyczną, jeśli uległa ekspresji w E. coli.</li>
	<li>Jeśli jest to sekwencja aminokwasowa, przeprowadź optymalizację kodonów dla E. coli, korzystając z jednego z wielu standardowych narzędzi dostawców56. W przypadku korzystania z szablonu dostarczonego w suplemencie upewnij się, że zoptymalizowana sekwencja nie ma miejsc ograniczeń HindIII (AAGCTT). W takim przypadku kontynuuj optymalizację sekwencji, aż nie będzie już witryny HindIII.</li>
	<li>Skopiuj sekwencję i wklej ją do dostarczonego szablonu dla Sekwencji Uzupełniającej #1, w której wskazany jest interesujący gen. Jeśli wyraża sfGFP, użyj Sekwencji Uzupełniającej #1 bez zmian. W przypadku wyrażania subtylizyny należy użyć Sekwencji Uzupełniającej #2 w takiej postaci, w jakiej jest.</li>
	<li>Zamów minimalny szablon i niezbędne startery w preferowanej usłudze syntezy DNA.</li>
</ol>
2. Ponowne zawieszenie fragmentu genu i starterów
UWAGA: Po otrzymaniu fragmentu genu, postępuj zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi ponownego zawieszenia lub skorzystaj z tego prostego przewodnika, aby stworzyć zapas DNA.
<ol>
	<li>Odwirować probówkę (300 x g przez 5 s), aby zebrać osad DNA na dnie.</li>
	<li>Dodać podwójnie destylowaną wodę (ddH2O), aby uzyskać końcowe stężenie 10 ng/μl matrycy DNA.</li>
	<li>Wiruj roztwór na podłożu przez 5-10 sekund.</li>
	<li>Rozpuścić cały osad przez inkubację w temperaturze 50 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Na krótko znowu wir</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 sekund, aby zebrać roztwór na dnie probówki.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C lub stosować w PCR.</li>
	<li>Przygotuj zapas starterów 100 μM, ponownie zawieszając je w wodzie wolnej od nukleaz. Aby określić ilość wody do dodania, pomnóż liczbę nanomoli liofilizowanego startera przez 10. Na przykład, jeśli probówka zawiera 45 nM liofilizowanego startera, dodaj 450 μl ddH2O i zwiruj roztwór.</li>
	<li>Roztwory podstawowe startera należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub kontynuować amplifikację.</li>
</ol>
3. Amplifikacja fragmentu genu metodą PCR
UWAGA: Zdecyduj, który zestaw do PCR jest odpowiedni dla interesującego genu. Mniejsze geny (<1000 kb) mogą być bardziej podatne na tańszą polimerazę Taq, podczas gdy większe geny (≥1000 kb) mogą skorzystać z polimerazy o wysokiej wierności w celu zmniejszenia błędów. Ważne jest, aby pamiętać, że ta początkowa amplifikacja PCR nie jest konieczna, jeśli użytkownik nie jest zainteresowany zachowaniem początkowego fragmentu genu (zapewnia wiele prób cyrkularyzacji i pozwala na badania porównawcze produktu LET i RCA). Ważne jest również, aby pamiętać, że ten LET z amplifikacją PCR może być stosowany bezpośrednio w reakcjach; Jednak, jak wspomniano we wstępie, pozwoliłoby to na ograniczoną liczbę reakcji, gdyby dalsze kroki amplifikacji zostały zignorowane. Trawienie i ligację można przeprowadzić bezpośrednio na zawieszonym fragmencie genu57 (jeśli ktoś jest pewien, nie będzie potrzebował więcej LET do wykonania dodatkowych zapasów cyrkularyzacji). W takim przypadku pomiń sekcję 3 i przejdź do sekcji 4. Aby wykonać PCR, wykonaj następujące kroki.
<ol>
	<li>Użyj zapasów 100 μM z kroku 2.8, aby utworzyć roztwory robocze 10 μM. Wiele protokołów zestawów PCR wymaga roztworów starterów o wielkości 10 μM.</li>
	<li>Zaprogramuj termocykler tak, aby przeprowadzał reakcję zgodnie z protokołami producenta zestawu. Różne zestawy wymagają nieco zróżnicowanych parametrów rowerowych. Dla zestawu wymienionego w tabeli materiałów warunki wynoszą 94 °C przez 30 s początkowej denaturacji; 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s denaturacji, 45 °C przez 30 s wyżarzania podkładu i 68 °C przez 60 s przedłużania; z końcowym przedłużeniem w temperaturze 68 °C przez 5 minut; i wreszcie bezterminowe utrzymywanie w temperaturze 10 °C.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wybrałeś właściwy czas elongacji (zmienny w zależności od długości genu, który ma być amplifikowany). Mają czas wydłużenia wynoszący 1 minutę na każde 1 000 pz.</li>
		<li>Upewnij się, że wprowadzono prawidłową temperaturę wyżarzania dla podkładów. Skorzystaj z internetowego kalkulatora Tm, który wykorzystuje oba startery jako dane wejściowe do określenia najlepszej temperatury wyżarzania58. Temperatura wyżarzania wynosząca 45 °C jest wystarczająca w przypadku stosowania podkładów M13.</li>
		<li>Przy określaniu liczby cykli należy zapoznać się z protokołem producenta, ale 30 cykli najczęściej spowoduje wystarczające wzmocnienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli wykonujesz PCR, rozmrozić i odwirować dNTP. Użyj buforu PCR dostarczonego w zestawie.</li>
	<li>W jednej probówce do PCR połącz wszystkie elementy zestawu zgodnie z zaleceniami w protokole producenta. Aby zapewnić pomyślną amplifikację, dodać 1 μl zawieszonego materiału wyjściowego DNA (krok 2.6).</li>
	<li>Delikatnie homogenizować mieszaninę, wirując na pożywce przez 5-10 s. Alternatywnie, odpipetuj połowę objętości w górę i w dół 10-20 razy, aby uzyskać wir.</li>
	<li>Wykonaj reakcję PCR.</li>
	<li>Jeżeli protokół PCR nie obejmował końcowego etapu chłodzenia, przed usunięciem należy pozostawić reakcję do ochłodzenia przez 5 minut w temperaturze 10 °C w celu skierowania kondensatu na dno probówki.</li>
	<li>Oczyść reakcję za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy.
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj bufor wiążący DNA i próbkę PCR w stosunku odpowiednio 5:1.</li>
		<li>Przenieść tę mieszaninę do kolumny wirowej i odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu do przemywania DNA do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
		<li>Wirować przez 1 minutę przy 16 000 x g i odrzucić przepływ.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.8.3 i 2.8.4 bez etapu inkubacji trwającego 1 minutę.</li>
		<li>Wirować przez dodatkowe 1-2 minuty przy 16 000 x g, aby usunąć pozostały bufor.</li>
		<li>Eluować DNA w 46 μl ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić ilościowo oczyszczone DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Przechowywać oczyszczone DNA w temperaturze -20 °C lub przejść do następnego etapu.</li>
</ol>
4. Trawienie i cyrkularyzacja
UWAGA: Dalsza amplifikacja może być osiągnięta poprzez cyrkularyzację DNA, a następnie RCA. Strawić DNA, aby przygotować matrycę do cyrkularyzacji. Spowoduje to usunięcie sekwencji starterów i utworzenie lepkich końców zarówno na końcach 5', jak i 3' szablonu. Ponownie przymocuj te końce w reakcji podwiązania.
<ol>
	<li>W probówce do PCR połącz 5 μl niezbędnego buforu, 20 μl HindIII i 45 μl oczyszczonego DNA z kroku 3.8.</li>
	<li>Delikatnie homogenizuj tę mieszaninę za pomocą pipety.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w termocyklerze przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Inaktywować HindIII na gorąco przez inkubację przez 20 minut w temperaturze 80 °C.</li>
	<li>Pozostawić reakcję do ostygnięcia do 10 °C przed usunięciem w celu sprowadzenia kondensatu na dno rurki.</li>
	<li>Dodać 5 μl buforu ligazy T4 i 800 j. ligazy T4 do nowo strawionego DNA.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby użyj ligazy T7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie homogenizuj tę mieszaninę za pomocą pipety.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w celu przeprowadzenia reakcji cyrkularyzacji.</li>
	<li>Oczyść reakcję za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Użyj tego samego protokołu, który został opisany w kroku 3.8.</li>
	<li>Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru. Oczekiwane wartości to ~20 ng/μL.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
5. Izotermiczne wzmocnienie okręgu tocznego
UWAGA: Wzmocnienie Rolling circle (RCA) może być wykonane przy użyciu zestawu komercyjnego lub z indywidualnie zakupionych komponentów. Postępowanie zgodnie z protokołem producenta zapewni udane wzmocnienie. Zestawy zazwyczaj zawierają bufor próbki, bufor reakcyjny i polimerazę wypierającą nić, taką jak polimeraza φ29. Wiele probówek reakcyjnych można łączyć w celu wytworzenia dużej ilości DNA do ekspresji bezkomórkowej (4 μg z 20 pg materiału wyjściowego). Następujący protokół działa wydajnie.
<ol>
	<li>W pojedynczej probówce połączyć 20 μl buforu próbki, 20 μl buforu reakcyjnego, 0,8 μl enzymu i 1 μl okrągłej matrycy ekspresji (CET) z kroku 4.9. 
	UWAGA: Będzie to miało całkowitą masę DNA ~ 20 ng, ale RCA może pracować z ilościami pikogramów, umożliwiając w ten sposób rozcieńczenie CET i ekstremalną amplifikację enzymatyczną, jeśli istnieje znaczne zapotrzebowanie na materiał w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym.</li>
	<li>Homogenizować mieszaninę za pomocą pipety i podatkować 10 μl mieszaniny do czterech oddzielnych probówek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4-18 godzin.</li>
	<li>Inaktywować enzym na gorąco przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Zmniejszyć temperaturę do 12 °C na 5 minut, aby zapobiec kondensacji na dnie probówki. 
	UWAGA: Najłatwiej jest połączyć wszystkie kroki temperatury w automatycznym protokole na termocyklerze.</li>
	<li>Rozcieńczyć otrzymany roztwór, dodając 15 μl ddH2O do każdej probówki.</li>
	<li>Połącz wszystkie probówki i dodaj bezpośrednio do reakcji bezkomórkowej.</li>
	<li>W razie potrzeby użyj zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić produkt i eluować go w 36 μl ddH2O w celu określenia ilościowego. Upewnij się, że stężenie matrycy wynosi ~100 ng/μL.</li>
</ol>
6. Reakcja bezkomórkowa
UWAGA: Wykonaj ekspresję bez komórki, łącząc bufor energii, ekstrakt i szablon RCA. Typowa reakcja bezkomórkowa z wykorzystaniem bufora energetycznego PANOx-SP składa się z 1,2 mM ATP, po 0,85 mM GMP, UMP i CMP, 30 mM fosfoenolopirogenianianu, 130 mM glutaminianu potasu, 10 mM glutaminianu amonu, 12 mM glutaminianu magnezu, 1,5 mM spermidyny, 1 mM putrescyny, 34 μg/ml kwasu folinowego, 171 μg/ml mieszaniny tRNA E. coli, 2 mM każdy z 20 nieznakowanych aminokwasów, 0,33 mM NAD, 0,27 mM koenzymu A (CoA), 4 mM szczawianu potasu, 57 mM buforu HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% objętości ekstraktu E. coli i zmienne ilości DNA23,49. Objętość reakcji może się różnić, ale 15 μl reakcji pozwala zaoszczędzić na zużyciu odczynnika i jest wystarczająco małe, aby można je było zastosować w mikropłytce o czarnych ściankach 38449,50.
<ol>
	<li>W przypadku ekspresji białka fluorescencyjnego, takiego jak sfGFP, należy przygotować czytnik płytek do odczytu przy pożądanym wzbudzeniu/emisji, temperaturze i mieszaniu.</li>
	<li>W przypadku stosowania płytki 384-dołkowej należy wprowadzić 60 μlH2Odo studzienek graniczących z pustą studzienką na próbkę, aby utrzymać wilgotność i zmniejszyć efekt krawędzi.</li>
	<li>Dodaj różne wymagane składniki do probówki dla każdej próbki. Dodaj tyle, aby wykonać trzy próby. Powtórzenia w obrębie płytki mogą pomóc w zidentyfikowaniu przyczyn zmienności.
	<ol>
		<li>Dodaj ekstrakt, bufor energetyczny, a następnie DNA.</li>
		<li>Rozcieńczyć do ostatecznej pożądanej objętości za pomocą ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie wymieszać ten roztwór, pipetując połowę objętości roztworu w górę i w dół 10-20 razy.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną w 15 μl podwielokrotności do żądanych dołków na płytce do mikromiareczkowania.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę bezbarwną folią uszczelniającą, aby utrzymać wilgotność i zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Umieścić zapieczętowaną płytkę w czytniku płytek i poczekać, aż reakcja się zakończy.
	<ol>
		<li>W przypadku ekspresji białka, które nie ma możliwości monitorowania na żywo, należy użyć innego urządzenia o kontrolowanej temperaturze, takiego jak termoblok, do inkubacji płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Test subtylizyny
UWAGA: Jeśli w Sekwencji Uzupełniającej #2 dochodzi do ekspresji genu subtylizyny BPN' (SBT(n)) postępuj zgodnie z tym protokołem, aby ocenić aktywność.
<ol>
	<li>Przygotować 10 μM roztwór podstawowy p-nitroanilidu N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe w dimetyloformamidzie (DMF).</li>
	<li>Ustawić czytnik płytek tak, aby mierzył absorbancję przy 410 nm co 20 s przez 10 minut, utrzymując temperaturę 25 °C.</li>
	<li>Na płaskiej, bezbarwnej 96-dołkowej płytce, podwielokrotność 94 μl ddH2O i 1 μl N-sukcynylo-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilidu z kroku 7.1.</li>
	<li>Dodać 5 μl gotowej reakcji bezkomórkowej z kroku 6.7 i odczytać za pomocą czytnika płytek ustawionego na protokół opisany w kroku 7.2.</li>
</ol>

Nigel Reuel zasiada w naukowej radzie doradczej BigHat Biosciences Inc., firmy, która wykorzystuje systemy bezkomórkowe do projektowania przeciwciał.

Interesującym genem może być dowolne pożądane białko, ale najlepiej jest zacząć od białka fluorescencyjnego jako wygodnego reportera do odczytu w czasie rzeczywistym lub punktu końcowego na czytniku płytki studziennej dla nowych użytkowników tej metody. W przypadku nowych sekwencji białek skopiuj sekwencję aminokwasową żądanego białka i wklej ją do żądanego narzędzia do optymalizacji kodonów 61,62. W narzędziu do optymalizacji kodonów zwykle dostępnych jest wiele...

Ekspresja genów bez komórek (CFE) stała się potężnym narzędziem o wielu zastosowaniach. Do takich zastosowań należą wykrywanie chorób1,2,3,4,5,6, wykrywanie mikroelementów i małych cząsteczek7,8,9,10,11,12, biomanufacturing13,14,15,16,17,18, education19,20,21, produkcja trudnych białek17,22,23,24,25,26,27, oraz screening23,28,29,30,31,32,33. Wynika to z otwartego charakteru systemów bezkomórkowych i elastyczności, jaką zapewniają. Wiele świetnych artykułów przeglądowych oferuje edukację historyczną i przyszłe perspektywy na technologię34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
Typowa reakcja bezkomórkowa składa się z trzech głównych składników: ekstraktu komórkowego, mieszanki energetycznej i szablonu genetycznego. Aktywny ekstrakt komórkowy zawiera wszystkie niezbędne mechanizmy do transkrypcji i translacji (TXTL) i może być przetwarzany na wiele sposobów36. Glikolityczne produkty pośrednie, elektrolity, aminokwasy i kofaktory w miksie energetycznym wspomagają proces TXTL. Jest to główne źródło zmienności w eksperymentach bezkomórkowych45 i może być przygotowany na wiele sposobów34,46. Przygotowanie matrycy genetycznej przyniosło mniej ulepszeń, ponieważ tradycyjne metody klonowania dają plazmidy o doskonałych właściwościach ekspresji. Wadą tych tradycyjnych metod jest czas realizacji i ilość wiedzy biologicznej potrzebnej do ich skonstruowania i rozmnażania. Ostatnie działania optymalizacyjne zaowocowały prostymi, 24-godzinnymi przepływami pracy w celu przygotowania ekstraktu komórkowego47,48, które można wykonywać równolegle z przygotowaniem mieszanki energetycznej49,50. Jednak tradycyjne klonowanie dodaje wiele dni do osi czasu prototypowania CFE (Tabela 1)23. Szybko amplifikowane produkty PCR z komercyjnego fragmentu genu mogą być używane bezpośrednio51, ale ogranicza to liczbę eksperymentów prototypowych, ponieważ wytwarzany jest tylko 1 μg DNA, co odpowiada około pięciu reakcjom (tradycyjne objętości 15 μL). Dzięki tym dodatkowym etapom cyrkularyzacji i amplifikacji izotermicznej możliwe jest uzyskanie większej niż miligram ilości DNA (~5000 reakcji na 1 mg). To znacznie zwiększa liczbę testów, które można wykonać w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych białek lub kombinatorycznych sieci enzymatycznych (bezkomórkowa inżynieria metaboliczna); pozwala również na skuteczne zachowanie biblioteki matryc liniowych w postaci DNA o wysokim stężeniu. Co więcej, zwiększona ilość matrycy byłaby niezbędna do prototypowania większych ilości białka potrzebnego do zastosowań w materiałoznawstwie (włókna na bazie białek i hydrożele). Niektóre ograniczenia szablonów liniowych można pokonać, używając ekstraktu z BL21 DE3 Star lub korzystając z niedawno odkrytych metod ochrony szablonów liniowych przed degradacją52,53,54. Nie dotyczy to jednak posiadania ograniczonych zapasów DNA wyprodukowanego przez dostawców do amplifikacji PCR ani kwestii wiedzy biologicznej i sprzętu potrzebnego do klonowania.
Ta praca przedstawia protokół wyraźnie zaprojektowany w celu zwiększenia ilości szablonu ekspresji, który można uzyskać z małych ilości fragmentów genów wyprodukowanych przez dostawcę (zazwyczaj 500-1000 ng liofilizowanego proszku). Opisana metoda nie wymaga umiejętności niezbędnych do wykonywania tradycyjnego klonowania w plazmidach czy transformacji i namnażania w żywych komórkach. Po otrzymaniu fragmentu genu w wiadomości e-mail, użytkownik może wytworzyć wystarczającą ilość szablonów dla wielu reakcji bezkomórkowych, stosując izotermiczną amplifikację toczącego się koła (RCA) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)23. Chociaż ilość DNA otrzymana od dostawcy może być wystarczająca do ograniczonych wysiłków związanych z badaniami przesiewowymi, szybko się wyczerpuje, a ponowny zakup fragmentów genów jest czasochłonny i kosztowny. Metoda ta jest również szczególnie odpowiednia w przypadku genów, które są toksyczne i trudne do sklonowania w E. coli.

<table><tbody><tr><td>Alalina</td><td>Formedium</td><td>DOC0102</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian amonu</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP21805951</td><td></td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Formedium</td><td>DOC0106</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Formedium</td><td>DOC0114</td><td></td></tr><tr><td>Kwas asparaginowy</td><td>Formedium</td><td>DOC0118</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca Axygen</td><td>Corning</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>Koenzym A</td><td>Sigma</td><td>C3144</td><td></td></tr><tr><td>Bufor CutSmart</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>Dostarczany z HindIII</td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Formedium</td><td>DOC0122</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>Służy do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma (Roche) 10109541001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Fragment genu</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy</td><td>Formedium</td><td>DOC0134</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Formedium</td><td>DOC0130</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DOC0138</tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma</td><td>G8377</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td></td></tr><tr><td>Histydyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0142</td><td></td></tr><tr><td>Izoleucyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0150</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0154</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0158</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian magnezu</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Formedium</td><td>DOC0166</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do mikromiareczkowania (384 dołki)</td><td>Płytka do mikromiareczkowania Greiner</td><td>781906</td><td></td></tr><tr><td>(96 dołków)</td><td></td>Wielomodowy czytnik płytek <td>Greiner</td> 655809 <td></td></tr><tr><td></td><td>BioTek</td><td>Synergy Neo2</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td>N8535</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotometr</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>M0480</td><td></td></tr><tr><td>Probówka PCR</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>Fenyloalanina</td><td>Formedium</td><td>DOC0170</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolopirogronian</td><td>Sigma (Roche)</td><td>10108294</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Szczawian potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P273</td><td></td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Formedium</td><td>DOC0174</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Formedium</td><td>DOC0178</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA NEB</td><td></td><td>B0202S Dostarczany</td> z zestawem do amplifikacji <td>ligazy DNA T4</td></tr><tr><td>TempliPhi</td><td>Cytiva</td><td>25640010</td><td>używany do</td></tr><tr><td>termocyklera</td><td>RCA Biorad</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer FP</td><td></td></tr><tr><td>Treonina</td><td>Formedium</td><td>DOC0182</td><td></td></tr><tr><td>Tryptofan</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DOC0186</tr><tr><td>Tyrozyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0190</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma</td><td>U6375</td><td></td></tr><tr><td>Walina</td><td>Formedium</td><td>DOC0194</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

Ten protokół opisuje projekt minimalnej matrycy DNA i etapy enzymatycznej amplifikacji, umożliwiając szybkie prototypowanie możliwych do przetestowania białek w czasie krótszym niż 24 godziny przy użyciu ekspresji bezkomórkowej. Po otrzymaniu DNA od dostawcy, fragment genu jest amplifikowany metodą PCR, cięty, okrężny i kriobankowany. Niewielka ilość zbankowanego DNA jest następnie rozcieńczana i znacznie amplifikowana (do 10,6x) za pomocą izotermicznej amplifikacji toczącego się koła (RCA). RCA może otrzymać mikrogramowe ilości matrycy minimalnej ekspresji z poziomów pikogramów materiału wyjściowego (poziomy mg, jeśli stosuje się cały wyjściowy fragment syntetyczny). W tej pracy początkowa ilość 20 pg dała 4 μg produktu końcowego. Otrzymany produkt RCA (konkatener minimalnego szablonu) może być dodany bezpośrednio do reakcji bezkomórkowej bez etapów oczyszczania. Ze względu na to, że metoda ta jest całkowicie oparta na PCR, może ona umożliwić przyszłe badania przesiewowe o wysokiej przepustowości w połączeniu ze zautomatyzowanymi systemami obsługi cieczy.

Ekspresja sfGFP z matryc RCA była porównywalna do ekspresji z plazmidu pJL1 przy zastosowaniu zaledwie 0,30 µL nieoczyszczonego DNA RCA w 15 µL reakcji (Rycina 2A). W rzeczywistości podwojenie i potrojenie ilości matrycy nie wydaje się przynosić żadnych korzyści w ekstrakcie z szczepu BL21 DE3 Star, co sugeruje, że poziomy matrycy są już nasycone przy 0,30 µL na reakcję. Z kolei zwiększenie ilości matrycy RCA wydaje się być korzystne w przypadku dodania jej do ekstraktu komórkowego pochodząc...

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ szczegółowo opisuje, jak szybko wygenerować duże ilości matrycy DNA do wykorzystania w reakcjach bezkomórkowych z małego fragmentu genu otrzymanego z zakładu syntezy. Amplifikacja toczącego się koła może generować duże ilości DNA szybciej niż tradycyjne klonowanie. Dzięki temu obsługuje cykle projektowania i testowania o wyższej przepustowości z bibliotek syntetycznego DNA.Techniki te mogą mieć dużą nieodłączną zmienność dla nowych użytkowników ze względu na wiele wymaganych kroków i małe ilości. Należy zwrócić szczególną uwagę na technikę, a praktyka czyni mistrza. Aby rozpocząć, dodaj wszystkie składniki z zestawu do PCR w jednej probówce do PCR.Następnie dodaj jeden mikrolitr zawieszonego fragmentu genu. Delikatnie homogenizuj mieszaninę, wirując na średnim poziomie przez pięć do 10 sekund. Po zaprogramowaniu termocyklera zgodnie z protokołem producenta zestawu, uruchom PCR.Po zakończeniu PCR użyj zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić DNA z mieszaniny reakcyjnej. W probówce o pojemności 1,5 mililitra dodaj bufor wiążący DNA i próbkę PCR w stosunku pięć do jednego. Przenieść tę mieszaninę do kolumny wirowej i odwirować przy 16 000 razy G prz

rapid-enzymatic-methods-for-amplification-minimal-linear-templates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie bakteryjnego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek opartego na surowym lizacie Vibrio natriegens do przeprowadzenia sprzężonej transkrypcji i translacji in vitro. Skupia się na przygotowaniu głównej mieszanki z niezbędnymi składnikami i stopniowej syntezie funkcjonalnych białek z matrycy DNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu ekstraktu z surowych komórek bakteryjnych

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Bezkomórkowe systemy ekspresji są potężnymi i opłacalnymi narzędziami do wysokoprzepustowej syntezy i badań przesiewowych ważnych białek. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bezkomórkowego systemu ekspresji białek przy użyciu natriegenów Vibrio do szybkiej produkcji białek przy użyciu plazmidowego DNA, liniowego DNA i matrycy mRNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

System OnePot PURE bezkomórkowy

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj szybką metodę enzymatyczną amplifikacji minimalnych liniowych matryc DNA do prototypowania białek w systemach bezkomórkowych. Protokół wykorzystuje izotermiczną amplifikację rolling circle, umożliwiając szybsze przygotowanie szablonów niż tradycyjne klonowanie.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów