Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

Protokół ten pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym różnych procesów i parametrów biochemicznych w świetle poszczególnych makropinosomów. Metody te mogą być stosowane do odkrywania leków w biologii komórkowej makropinocytozy. Protokół ten ma tę zaletę, że ujawnia heterogeniczność zarówno na poziomie komórkowym, jak i organelli.

Dzień przed testem wysiewaj komórki Raw264.7 o gęstości pięć razy 10 do mocy komórek w 100 mikrolitrach na studzienkę, na 96-dołkowej płytce ze szklanym dnem i czarnymi bokami. W dniu próby sprawdź, czy studzienki są zlewające się w co najmniej 70%. Następnie umyj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami HBSS, podgrzanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów HBSS zawierających 0,025 miligrama na mililitr TMR oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu i 0,025 miligrama na mililitr fluoresceiny oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu w każdym dołku, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po zakończeniu inkubacji wyjąć płytkę z inkubatora i umyć komórki sześciokrotnie 100 mikrolitrami HBSS. Po ostatnim praniu dodaj 100 mikrolitrów podgrzanego HBSS do komórek, a następnie umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą.

Po dostosowaniu parametrów wzbudzenia i emisji dla TMR i fluoresceiny w razie potrzeby, uzyskaj obraz z każdej studzienki naprzemiennie między dwoma fluoroforami pomiędzy każdym dołkiem. Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie studzienki pozostały ostre na całej płycie, a następnie uzyskaj obrazy każdego dołka w odstępach od jednej do 15 minut przez żądany okres czasu. Podczas akwizycji obrazu dostosuj pH 50-mililitrowej podwielokrotności roztworu bogatego w potas buforowanego 25 milimolowymi kwasami HEPES do 7,5 przy użyciu 10-molowego kwasu solnego lub 10-molowego wodorotlenku potasu, w zależności od potrzeb.

Następnie dostosować pH 350 mililitrowych podwielokrotności roztworu bogatego w potas buforowanego 25 milimolowym MES do pH 6,5, pH 5,5 i pH 5,0. Po zakończeniu akwizycji obrazu wyjmij HBSS z 96-dołkowej płytki zawierającej komórki i dodaj roztwór bogaty w potas o pH 7,5. Następnie dodaj nigerycynę w końcowym stężeniu 10 mikrogramów na mililitr.

Umieść płytkę z powrotem na mikroskopie i uzyskaj obrazy każdej studzienki przy użyciu tych samych ustawień akwizycji, jak pokazano wcześniej. Aby zmierzyć zdarzenia oksydacyjne w makropinosomach, należy wysiać komórki RAW264.7 na 96-dołkowej płytce na dzień przed testem, jak wykazano wcześniej. Następnie w dniu testu umyj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami HBSS podgrzanym do 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów HBSS zawierających 0,025 miligrama na mililitr TMR oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu i 0,025 miligrama na mililitr H2DCFDA oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu do każdej studzienki, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po wyjęciu płytki z inkubatora należy przemyć komórki sześciokrotnie 100 mikrolitrami HBSS. Po ostatnim płukaniu dodaj 100 mikrolitrów HBSS do każdej studzienki i umieść płytkę na mikroskopie.

Po dostosowaniu parametrów wzbudzenia i emisji dla TMR i H2DCFDA w razie potrzeby, należy uzyskać obrazy każdego odwiertu w odstępach od jednego do 15 minut, jak pokazano wcześniej. Aby zmierzyć trawienie białek w makropinosomach, wysiewaj komórki RAW264.7 na dzień przed testem, jak wykazano wcześniej. Następnie w dniu testu umyj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami HBSS podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów HBSS zawierających 0,025 miligrama na mililitr TMR oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu w 0,2 miligrama na mililitr albuminy jaja kurzego znakowanego BODIPY do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po wyjęciu komórek z inkubatora umyj je sześciokrotnie 100 mikrolitrami HBSS.

Po ostatnim płukaniu dodaj 100 mikrolitrów HBSS do każdej studzienki, a następnie umieść płytkę na mikroskopie. Po dostosowaniu parametrów wzbudzenia i emisji dla TMR i BODIPY w razie potrzeby, należy uzyskać obrazy każdego odwiertu w odstępach od jednego do 15 minut, jak pokazano wcześniej. Podczas pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych lub degradacji białek w makropinosomach nie można zmierzyć dynamiki zakwaszenia przez pewien okres czasu odpowiadający fazie ładowania dekstranem, która różni się w zależności od użytego typu komórki.

Podczas pomiaru pH makropinosomu stosunek fluoresceiny do TMR będzie się stopniowo zmniejszał i ustabilizuje się w ciągu 15 minut od akwizycji. Ten plateau odpowiada pH około pięciu, które w przybliżeniu odpowiada pH lizosomów. Na końcu każdej akwizycji przeprowadzana jest kalibracja in situ.

Stosunek fluoresceiny do TMR powinien być największy w buforze kalibracyjnym przy pH 7,5 i stopniowo zmniejszać się, gdy kalibracyjne stają się bardziej kwaśne. Pozwala to na wygenerowanie krzywej kalibracyjnej. Podczas pomiaru zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomach stosunek H2DCFDA do TMR będzie stopniowo zwiększał się i prawdopodobnie ustabilizuje się w ciągu pierwszych 20 do 30 minut w aktywowanych komórkach RAW264.7.

Podczas pomiaru trawienia białek makropinosomalnych, podczas trawienia albuminy jaja kurzego uwalniany będzie coraz silniejszy sygnał fluoresceiny. W komórkach RAW264.7 wzrost fluorescencji uwolnionej z trawionej albuminy jaja kurzego znakowanej BODIPY ustabilizuje się w ciągu pierwszych 30 minut. Dzięki tej pojawiającej się roli w homeostazie i jej nowo odkrytemu znaczeniu dla patologii raka, obecnie prowadzone są badania nad renesansem makropinocytozy.

Metody te dostarczyły zestawu narzędzi do badania wkładu makropinocytozy w te dziedziny badań.