Name: Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę pomiaru pH, zdarzeń redoks i degradacji białek w makropinosomach żywych komórek za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem. Technika ta ujawnia heterogeniczność na poziomie organelli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Uniwersytetowi w Calgary za wsparcie. Chcielibyśmy również podziękować dr Robinowi Yatesowi za dostęp do odczynników, sprzętu i przydatne dyskusje.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hoduj komórki Raw264.7 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do 70% konfluencji w RPMI uzupełnione 10% surowicą inaktywowaną termicznie.</li>
	<li>Dzień przed testem wysiewaj komórki Raw264.7 o gęstości 5 x 104 komórek na dołek na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że każda studzienka zawiera 100 μl pożywki wzrostowej. Upewnij się, że płytka 96-dołkowa ma czarne boki i szklane dno do obrazowania. 
	UWAGA: W tym przypadku do obrazowania użyto 96-dołkowych płytek. Płytki 96-dołkowe pozwalają na użycie mniejszych ilości komórek i odczynników w stosunku do większych komór obrazowania. Można jednak użyć dowolnej komory przeznaczonej do obrazowania żywych komórek, a odczynniki można odpowiednio skalować.</li>
	<li>W dniu próby sprawdź, czy studzienki są zlewające się w co najmniej 70%.</li>
</ol>
2. Pomiar pH makropinosomów
<ol>
	<li>Przygotuj komórki jak w rozdziale 1.</li>
	<li>Przemyć wszystkie studzienki 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wypełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS zawierającego 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego TMR i 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego fluoresceiną.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć komórki z inkubatora i umyć je 6x 100 μl HBSS.</li>
	<li>Napełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą.</li>
	<li>Dostosuj parametry wzbudzenia/emisji dla każdego fluoroforu zgodnie z potrzebami. 
	UWAGA: Idealne warunki do uzyskania obrazu będą się różnić w zależności od użytych fluoroforów i indywidualnych ustawień mikroskopu. W tym przypadku obrazy zostały uzyskane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. TMR został wzbudzony za pomocą linii laserowej 543, a emisja została zebrana w zakresie od 610 nm do 650 nm. Fluoresceina została wzbudzona za pomocą linii laserowej 488, a emisja została zebrana w zakresie od 500 nm do 550 nm. Użyto obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x i uzyskano objętość Z 10 μm w odstępach 0,5 μm.</li>
	<li>Uzyskaj obraz z każdej studzienki, naprzemiennie między fluoroforami między każdą studzienką.</li>
	<li>Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie dołki pozostały ostre na całej płycie.</li>
	<li>Rób zdjęcia każdej studni w odstępach 1-15 minut przez żądany okres czasu.</li>
</ol>
3. Kalibracja pH makropinosomów in situ
<ol>
	<li>Podczas akwizycji obrazu należy przygotować 1 l roztworu bogatego w potas (bogatego w K+) zawierającego 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 i 5 mM glukozy. Uzupełnij jedną objętość 400 ml roztworu bogatego w K+ 25 mM HEPES (z 1 M roztworu podstawowego o pH 7,2) i oddzielną objętość 400 ml roztworem podstawowym 25 mM MES (z 0,5 M roztworu podstawowego o pH 6,0).</li>
	<li>W razie potrzeby dostosować 50 ml podwielokrotności roztworu bogatego w K+ buforowanego 25 mM HEPES do pH 7,5 przy użyciu 10 M HCl lub 10 M KOH.</li>
	<li>Dostosuj trzy oddzielne 50 ml podwielokrotności roztworu bogatego w K+ buforowanego 25 mM MES do pH 6,5, pH 5,5 i pH 5,0 przy użyciu 10 M HCl lub 10 M KOH w zależności od potrzeb. 
	UWAGA: Bufor octanowo-octowy może być preferowany w przypadku roztworów o niższym pH.</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji obrazu usuń HBSS z 96-dołkowej płytki zawierającej komórki i zastąp ją roztworem bogatym w K+ o pH 7,5.</li>
	<li>Dodać nigerycynę do końcowego stężenia 10 μg/ml. 
	UWAGA: Nigerycyna to jonofor, który wymienia K+ na H+. Ustawiając stężenie K+ w roztworze bogatym w K+ na wartość zbliżoną do stężenia K+ w cytozolu, można zapewnić, że nigerycyna ograniczy pH makropinosomu do pH cytozolu, co z kolei odzwierciedla pH buforu kalibracyjnego.</li>
	<li>Umieść płytkę z powrotem na mikroskopie i uzyskaj obrazy każdej studzienki przy użyciu tych samych ustawień akwizycji, co powyżej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5 i 3.6 dla każdego bufora kalibracyjnego.</li>
</ol>
4. Analiza danych dla pH makropinosomów
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania FIJI, odejmij tło zarówno od TMR, jak i kanału fluoresceiny.</li>
	<li>Wygeneruj maskę na kanale TMR. Aby wygenerować maskę, przekonwertuj obraz na obraz binarny, wybierając opcję Dostosuj próg > > Zastosuj. Następnie zaznacz obraz binarny i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz maskę.</li>
	<li>Zastosuj go zarówno do obrazów TMR, jak i fluoresceiny. Aby to zrobić, podświetl maskę i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie. Kliknij obraz TMR i naciśnij Shift + E, aby zastosować maskę do kanału TMR. Podobnie kliknij obraz fluoresceiny i naciśnij Shift + E, aby nałożyć maskę na kanał OB.</li>
	<li>Zapisz intensywność TMR i fluoresceiny dla każdego makropinosomu w maskach.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.3 dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.3 dla obrazów zarejestrowanych w kalibracji in situ.</li>
	<li>Podziel intensywność fluoresceiny przez intensywność TMR, aby uzyskać stosunek fluoresceiny do TMR.</li>
	<li>Wykreślić pH w stosunku do stosunku fluoresceiny do TMR dla obrazów kalibracyjnych.</li>
	<li>Dopasuj krzywą do danych kalibracji.</li>
	<li>Interpoluj dane dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu, aby uzyskać bezwzględne wartości pH.</li>
</ol>
5. Pomiar zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomach
<ol>
	<li>Przygotuj komórki jak w rozdziale 1.</li>
	<li>Na dzień przed badaniem należy przygotować H2DCFDA ester sukcynimidylowy znakowany dekstranem 70 kDa poprzez ponowne zawieszenie 10 mg dekstroaminy o stężeniu 70 kDa w 1 ml 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu (pH 8,3). Dodać 1 mg estru sukcynimidylowego H2DCFDA do roztworu dekstro-aminowego i inkubować przez 1 godzinę. Dializuj znakowany H2DCFDA dekstran 70 kDa w stosunku do PBS. Nie przechowywać dłużej niż 1 dzień, ponieważ dekstran 70 kDa oznaczony H2DCFDA utlenia się podczas przechowywania.</li>
	<li>W dniu przeprowadzenia testu przemyć wszystkie studzienki 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę 100 μl HBSS zawierającej 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego TMR i 0,025 mg/ml znakowanego H2DCFDA dekstranu 70 kDa.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć komórki z inkubatora i umyć je 6x 100 μl HBSS.</li>
	<li>Napełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą i dostosuj parametry wzbudzenia/emisji dla każdego fluoroforu zgodnie z potrzebami. 
	UWAGA: Idealne warunki do uzyskania obrazu będą się różnić w zależności od użytych fluoroforów i indywidualnych ustawień mikroskopu. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. TMR został wzbudzony za pomocą linii laserowej 543, a emisja została zebrana w zakresie od 610 nm do 650 nm. H2DCFDA został wzbudzony za pomocą linii laserowej 488, a emisja została zebrana w zakresie od 500 nm do 550 nm. Użyto obiektywu zanurzającego w oleju 63x i uzyskano objętość Z 10 μm w odstępach 0,5 μm.</li>
	<li>Uzyskaj obraz z każdej studzienki, naprzemiennie między fluoroforami między każdą studzienką.</li>
	<li>Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie dołki pozostają ostre na całej płycie.</li>
	<li>Rób zdjęcia każdej studni w odstępach 1-15 minut przez żądany okres czasu.</li>
</ol>
6. Analiza danych dla zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomach
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania FIJI, odejmij tło zarówno od kanału TMR, jak i H2DCFDA.</li>
	<li>Wygeneruj maskę na kanale TMR. Aby wygenerować maskę, przekonwertuj obraz na obraz binarny, wybierając opcję Dostosuj próg > > Zastosuj. Następnie zaznacz obraz binarny i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz maskę.</li>
	<li>Zastosuj maskę zarówno do obrazów TMR, jak i H2DCFDA. Aby to zrobić, podświetl maskę i wybierz Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie. Kliknij obraz TMR i naciśnij Shift + E, aby zastosować maskę do kanału TMR. Podobnie kliknij H2DCFDA obraz i naciśnij Shift + E, aby zastosować maskę do kanału H2DCFDA.</li>
	<li>Zapisz intensywność TMR i H2DCFDA dla każdego makropinosomu w maskach.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.3 dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu.</li>
	<li>Podziel intensywność H2DCFDA przez intensywność TMR, aby uzyskać stosunek H2DCFDA: TMR.</li>
	<li>Wykreśl stosunek H2DCFDA do TMR w czasie.</li>
</ol>
7. Pomiar trawienia białek w makropinosomach
<ol>
	<li>Przygotuj komórki jak w rozdziale 1.</li>
	<li>W dniu przeprowadzenia testu przepłukać wszystkie studzienki 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozpuścić albuminę jaja kurzego znakowaną bodipy do stężenia 4 mg/ml w HBSS.</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę 100 μl HBSS zawierającej 0,025 mg/ml dekstranu 70 kDa znakowanego TMR i 0,2 mg/ml albuminy jaja kurzego znakowanej BODIPY.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć komórki z inkubatora i umyć je 6x 100 μl HBSS.</li>
	<li>Napełnić każdą studzienkę 100 μl HBSS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą i dostosuj parametry wzbudzenia/emisji dla każdego fluoroforu zgodnie z potrzebami. 
	UWAGA: Idealne warunki do uzyskania obrazu będą się różnić w zależności od użytych fluoroforów i indywidualnych ustawień mikroskopu. W tym przypadku obrazy zostały uzyskane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. TMR został wzbudzony za pomocą linii laserowej 543, a emisja została zebrana w zakresie od 610 nm do 650 nm. BODIPY został wzbudzony za pomocą 488-laserowej linii, a emisja została zebrana w zakresie od 500 nm do 550 nm. Użyto obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x i uzyskano objętość Z 10 μm w odstępach 0,5 μm.</li>
	<li>Uzyskaj obraz z każdej studzienki, naprzemiennie między fluoroforami między każdą studzienką.</li>
	<li>Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie dołki pozostają ostre na całej płycie.</li>
	<li>Rób zdjęcia każdej studni w odstępach 1-15 minut przez żądany okres czasu.</li>
</ol>
8. Analiza danych dotyczących trawienia białek w makropinosomach
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania FIJI, odejmij tło zarówno od kanałów TMR, jak i BODIPY.</li>
	<li>Wygeneruj maskę na kanale TMR i zastosuj ją zarówno do obrazów TMR, jak i BODIPY, jak w krokach 6.2 i 6.3 powyżej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Zapisz intensywność TMR i BODIPY dla każdego makropinosomu w maskach.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.3 dla każdego punktu czasowego z przebiegu czasu.</li>
	<li>Podziel intensywność BODIPY przez intensywność TMR, aby uzyskać stosunek BODIPY:TMR.</li>
	<li>Wykreśl stosunek BODIPY:TMR w czasie.</li>
</ol>

<ol><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis%3A+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li>
<li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766(2017).</li>
<li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).</li>
<li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li>
<li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180(2020).</li>
<li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li>
<li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li>
<li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li>
<li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153(2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2%2FARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li>
<li>Lee, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li>
<li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li>
<li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+by+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li>
<li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li>
<li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284(2016).</li>
<li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment%3A+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li>
<li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLIT2%2FROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112(2020).</li>
<li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+phagocytes%3A+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).</li>
<li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156(2019).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-gated+monovalent+ion+fluxes+regulate+endocytic+traffic+and+support+immune+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance.</a> Science. 367, 301-305 (2020).</li>
<li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).</li>
<li>Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+multiple+lumenal+parameters+of+individual+phagosomes+using+high-content+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging.</a> Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li>
<li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lysosomal+pH+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).</li>
<li>Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamic+radii+of+macromolecules+and+their+effect+on+red+blood+cell+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation.</a> Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).</li>
<li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pathways of antigen processing.</a> Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).</li>
<li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).</li>
<li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112, 4712-4722 (2008).</li>
<li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+DNGR-1+signals+for+phagosomal+rupture+to+promote+cross-presentation+of+dead-cell-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens.</a> Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).</li>
<li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+macropinocytosis+in+prostate+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts.</a> Bio-Protocol. 9, (2019).</li>
<li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).</li>
<li>Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+macropinosomes+in+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).</li>
<li>Swanson, J. A., King, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breadth+of+macropinocytosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The breadth of macropinocytosis research.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Chociaż istnieje wiele protokołów zarówno do nisko-, jak i wysokoprzepustowych pomiarów wychwytu makropinocytarów w makrofagach, fibroblastach, a nawet Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, podjęto bardzo niewiele prób zmierzenia biochemii światła tych dynamicznych przedziałów. Jest to prawdopodobnie spowodowane niedostatkiem sond, które można skutecznie u...

Makropinocytoza odnosi się do pobierania dużych ilości płynu zewnątrzkomórkowego do połączonych błoną organelli cytoplazmatycznych zwanych makropinosomami1,2. Jest to wysoce konserwatywny proces wykonywany przez wolno żyjące organizmy jednokomórkowe, takie jak ameba Dictyostelium spp. 3, a także anthozoans4 i metazoans2. W większości komórek makropinocytoza jest zdarzeniem indukowanym. Podwiązanie receptorów na powierzchni komórki indukuje wysunięcie się napędzanych aktyną rozszerzeń błony plazmatycznej, zwanych falbanami. Część tych falban, za sprawą jakiegoś słabo poznanego mechanizmu, uszczelnia się na swoich dystalnych końcach, tworząc makropinosomy (chociaż poza zakresem tego artykułu metodologicznego, szczegółowe przeglądy mechaniki makropinocytozy można znaleźć w bibliografii1,2,5,6,7). Bodźcem zewnątrzkomórkowym indukującym makropinocytozę jest najczęściej rozpuszczalny czynnik wzrostu5,8. W związku z tym zdarzenie makropinocytarne pozwala na spożycie bolusa materiału zewnątrzkomórkowego, z którego komórka może czerpać użyteczne metabolity ułatwiające wzrost. Niestety, ta ścieżka dostarczania składników odżywczych może również napędzać patologię. Niektóre komórki rakowe zawierają mutacje, które powodują ciągłą lub konstytutywną makropinocytozę. Ciągłe dostarczanie składników odżywczych ułatwia niekontrolowaną proliferację komórek rakowych i jest powiązane ze szczególnie agresywnymi nowotworami9,10,11,12,13. Podobnie, wirusy mogą indukować makropinocytozę, aby uzyskać dostęp do komórek gospodarza, napędzając w ten sposób patologię wirusową14.
Makropinocytoza również przyczynia się do utrzymania odporności na patogeny. Niektóre wrodzone komórki odpornościowe, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne, angażują się w konstytutywne i agresywne pobieranie próbek płynu zewnątrzkomórkowego za pomocą makropinocytozy6,15,16. Ten rodzaj makropinocytozy jest niezwykle aktywny, a pojedyncza komórka dendrytyczna może nabrzmiewać objętością płynu zewnątrzkomórkowego równą jej własnej wadze co godzinę17. Pomimo tego konstytutywnego pobierania próbek, makrofagi i komórki dendrytyczne nie replikują się w niekontrolowany sposób, tak jak komórki nowotworowe, zamiast tego wydają się przetwarzać materiał zewnątrzkomórkowy w taki sposób, że można wydobyć informacje informujące o obecności lub nawet braku potencjalnych zagrożeń. Informacje są pozyskiwane jako i) wzorce molekularne związane z patogenami, które mogą być odczytane przez wewnątrzkomórkowe receptory rozpoznające patogeny oraz ii) krótkie odcinki aminokwasów, które można załadować do głównych cząsteczek zgodności tkankowej w celu przeprowadzenia badań przesiewowych przez komórki adaptacyjnego układu odpornościowego16,18,19. To, czy patogeny zakłócają ten szlak przetwarzania informacji przez komórki odpornościowe, jest obecnie niejasne.
Pomimo tych dobrze zdefiniowanych i krytycznych ról makropinocytozy zarówno w utrzymaniu odporności, jak i homeostazy, a także w przeciwieństwie do innych, częściej badanych sposobów endocytozy, niewiele wiadomo o wewnętrznych (luminalnych) funkcjach makropinosomów. Opracowanie ustandaryzowanych protokołów i narzędzi do badania biochemii luminalnej makropinosomów nie tylko pomoże nam lepiej zrozumieć ich unikalną biologię, ale także dostarczy informacji, które można wykorzystać do nowych strategii terapeutycznych, w tym dostarczania leków20. Niniejszy manuskrypt metody skupi się na niedawno opracowanych narzędziach do analizy, na poziomie pojedynczych organelli, różnych aspektów biochemii luminalnej makropinosomów.
Fluorofory mogą być używane do pomiaru specyficznych biochemii organelli, jeśli i) rozdzielają się preferencyjnie na interesujący nas przedział i/lub ii) ulegają zmianom widmowym w odpowiedzi na interesujący ich parametr. Na przykład w przypadku pH słabe zasady fluorescencyjne, takie jak pomarańcz akrydynowy, fiolet krezylowy i barwniki LysoTracker, gromadzą się preferencyjnie w kwaśnych organellach. Dlatego ich względna intensywność jest przybliżonym wskaźnikiem, że oznakowane organelle są kwaśne. Inne fluorofory reagujące na pH, takie jak fluoresceina, pHrodo i cypHer5e, ulegają zmianom widmowym po związaniu się z protonami (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A-C). Zmiany w emisji fluorescencji fluoroforów wrażliwych na pH mogą zatem stanowić użyteczne przybliżenie pH. Stosowanie pojedynczych fluoroforów ma jednak szereg wad. Na przykład zmiany w płaszczyźnie ogniskowej, fotowybielanie i zmiany objętości poszczególnych organelli, powszechne zjawisko w makropinosomach21, mogą indukować zmiany w intensywności fluorescencji pojedynczych fluoroforów, a tego nie można łatwo skorygować dla22. Oceny pojedynczej długości fali, choć przydatne do wizualizacji przedziałów kwasowych, są zatem czysto jakościowe.
Bardziej ilościowym podejściem jest celowanie w wrażliwy na parametry fluorofor wraz z fluoroforem referencyjnym do interesujących organelli. Fluorofor referencyjny jest idealnie niewrażliwy na zmiany biochemiczne w organellach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D-F) i dlatego może być używany do korygowania zmian w płaszczyźnie ogniskowej, objętości organellarów i, do pewnego stopnia, fotowybielania23. Stosując to podejście, określane jako fluorescencja ratiometryczna podwójnego fluoroforu, korekcję można osiągnąć poprzez wygenerowanie stosunku emisji fluorescencji fluoroforu wrażliwego na parametry do fluoroforu referencyjnego.
Tutaj protokół będzie wykorzystywał zasadę obrazowania ratiometrycznego z podwójnym fluoroforem do pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i degradacji białek w makropinosomach. W każdym przypadku zostanie wybrany fluorofor, który jest wrażliwy na interesujący nas parametr oraz fluorofor referencyjny. W celu ukierunkowania fluoroforów specyficznie na makropinosomy, zostaną one kowalencyjnie sprzężone z dekstranem o sile 70 kDa, który jest preferencyjnie włączony do makropinosomów24. Wszystkie testy zostaną przeprowadzone w komórkach Raw264.7, ale można je dostosować do innych typów komórek. Tam, gdzie to możliwe, współczynniki fluorescencji zostaną skalibrowane względem krzywej odniesienia w celu uzyskania wartości bezwzględnych. Co ważne, wszystkie pomiary będą wykonywane w żywych komórkach w celu dynamicznej i ilościowej oceny środowiska świetlnego makropinosomów.
Przy wyborze fluoroforów wrażliwych na pH, należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Pierwszym z nich jestpK a fluoroforu, który wskazuje zakres wartości pH, przy których sonda będzie najbardziej czuła. Jeśli założymy, że wkrótce po utworzeniu pH makropinosomu będzie zbliżone do pH podłoża zewnątrzkomórkowego (~pH 7,2) i że będzie on stopniowo zakwaszał się poprzez interakcje z późnymi endosomami i lizosomami (~pH 5,0), należy wybrać sondę o pKa, która jest czuła w tym zakresie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Fluorofor fluoresceina, który mapK a 6,4, jest optymalnie czuły w tym zakresie. Był szeroko stosowany do pomiaru innych podobnych organelli, takich jak fagosomy, i będzie fluoroforem z wyboru w tym manuskrypcie22,25. Jako fluorofor referencyjny zostanie użyta tetrametylorodamina, która jest niewrażliwa na pH (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1E). Inne fluorofory, takie jak pHrodo i cypHer5e, mogą być zastąpione fluoresceiną, jeśli właściwości spektralne fluoresceiny pasują do innych zmiennych eksperymentalnych. Niektóre sugerowane fluorofory referencyjne dla pHrodo i cypHer5e są pokazane na Rysunek 1.
Drugą kwestią jest metoda, za pomocą której te dwa fluorofory będą kierowane konkretnie do makropinosomów. Dekstran o wielkości 70 kDa, który ma promień hydrodynamiczny około 7 nm, nie przykleja się niespecyficznie do komórek i jest wbudowywany w makropinosomy, ale nie w jamach pokrytych klatryną lub kaweolach, a zatem oznacza makropinosomy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B)16,24,26. W tym protokole dekstran 70 kDa znakowany fluoresceiną i dekstran 70 kDa znakowany tetrametylorodaminą (TMR) zostaną użyte odpowiednio jako sondy wrażliwe na pH i referencyjne.
W wrodzonych komórkach odpornościowych, makropinocytoza i fagocytoza reprezentują dwie główne drogi internalizacji materiału egzogennego do przetworzenia i późniejszej prezentacji komórkom adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej27. Staranna i skoordynowana kontrola składu chemicznego redoks światła fagosomów i makropinosomów ma kluczowe znaczenie dla kontekstowego przetwarzania materiału egzogenicznego. Być może najlepiej zbadanym regulatorem zdarzeń oksydacyjnych w fagosomach jest oksydaza NADPH, duży kompleks wielopodjednostkowy, który wytwarza duże ilości reaktywnych form tlenu (ROS) w świetle fagosomów28. Rzeczywiście, jego aktywność ma kluczowe znaczenie dla odpowiedniego przetwarzania antygenu w fagosomach29,30. Jednak aktywność oksydazy NADPH na błonach makropinosomalnych nie została zbadana.
W tym protokole, H2DCFDA ester sukcynimidylu jest używany do pomiaru zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomie. Jest to zmodyfikowana forma fluoresceiny (dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny), która jest minimalnie fluorescencyjna w swojej zredukowanej formie. Po utlenieniu jego emisja fluorescencji znacznie wzrasta. Warto jednak zwrócić uwagę na istotne zastrzeżenie H2DCFDA - ponieważ opiera się na fluoroforze fluoresceinie, jego fluorescencja jest również wygaszana w komorach kwaśnych i należy zadbać o kontrolę tej zmiennej podczas projektowania eksperymentów28. Podobnie jak w przypadku podejścia do pomiaru pH, H2DCFDA ester sukcynimidylowy zostanie kowalencyjnie przyłączony do dekstranu 70 kDa, a dekstran 70 kDa znakowany TMR zostanie użyty jako fluorofor referencyjny (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3A).
Fluorescencyjna albumina jaja kurzego będzie używana do pomiaru degradacji białek w makropinosomach. Zastosowana tutaj albumina jaja kurzego jest gęsto znakowana barwnikiem FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY), który ulega samogaszeniu. Po trawieniu uwalniane są silnie fluorescencyjne peptydy znakowane barwnikiem. Ponieważ albuminy jaja kurzego nie można łatwo sprzęgnąć z dekstranem 70 kDa, komórki z dekstranem 70 kDa znakowanym TMR i albuminą jaja kurzego w fazie płynnej będą inkubowane. Sygnał TMR zostanie wykorzystany do wygenerowania maski makropinosomu podczas analizy po obrazowaniu, a sygnał uwolniony z strawionej albuminy jaja kurzego zostanie zmierzony w masce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).

<table><tbody><tr><td>Czarnościenna 96-dołkowa płytka</td><td>PerkinElmer</td><td>6005430</td><td></td></tr><tr><td>CypHer5e, NHS ester</td><td>Cytiva</td><td>PA15401</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran-amino 70 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1862</td><td></td></tr><tr><td>DQ-albumina jaja kurzego</td><td>Invitrogen</td><td>D12053</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dekstran 70 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>OxyBurst Green-SE</td><td>Invitrogen</td><td>D2935</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red, SE</td><td>Invitrogen</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Raw264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SP5 Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-dekstran 70 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Antena</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar ph, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

W ostatnich latach dziedzina makropinocytozy szybko się rozwinęła. Makropinocytoza stała się centralnym mechanizmem, dzięki któremu wrodzone komórki odpornościowe utrzymują homeostazę i odporność organizmu. Jednocześnie, w przeciwieństwie do swojej roli homeostatycznej, może również napędzać różne patologie, w tym raka i infekcje wirusowe. W przeciwieństwie do innych trybów endocytozy, narzędzia opracowane do badania dojrzewania makropinosomów pozostają słabo rozwinięte. W tym miejscu protokół opisuje nowo opracowane narzędzia do badania środowiska redoks w świetle wczesnych i dojrzewających makropinosomów. Opisano metodyki wykorzystania ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej do oceny pH, produkcji reaktywnych form tlenu oraz zdolności degradacyjnej w świetle poszczególnych makropinosomów w żywych komórkach. Pomiary pojedynczych organelli mają tę zaletę, że ujawniają niejednorodność czasoprzestrzenną, która często jest tracona w przypadku podejść populacyjnych. Nacisk kładziony jest na podstawowe zasady podwójnej fluoroforowej mikroskopii ratiometrycznej, w tym wybór sondy, oprzyrządowanie, kalibrację oraz metody oparte na pojedynczych komórkach i populacji.

Podczas pomiaru pH makropinosomów występuje okres czasu, w którym dynamika zakwaszania nie może być mierzona. Okres ten odpowiada fazie ładowania dekstranu (szare pole na Rysunku 2C oraz Rysunku 3C,D) i będzie różnić się w zależności od użytego typu komórek. Długość fazy ładowania zależy od (i) aktywności makropinocytozy komórek oraz (ii) czułości użytego przyrządu. Zaleca się dostosowanie tego okresu na początku każdego eksperymentu w taki spos...

Opisujemy protokoły pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i trawienia białek w poszczególnych makropinosomach w żywych komórkach. Nacisk kładziony jest na mikroskopię ratiometryczną z podwójnym fluoroforem i zalety, jakie oferuje w porównaniu z technikami populacyjnymi.

Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Protokół ten pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym różnych procesów i parametrów biochemicznych w świetle poszczególnych makropinosomów. Metody te mogą być stosowane do odkrywania leków w biologii komórkowej makropinocytozy. Protokół ten ma tę zaletę, że ujawnia heterogeniczność zarówno na poziomie komórkowym, jak i organelli.Dzień przed testem wysiewaj komórki Raw264.7 o gęstości pięć razy 10 do mocy komórek w 100 mikrolitrach na studzienkę, na 96-dołkowej płytce ze szklanym dnem i czarnymi bokami. W dniu próby sprawdź, czy studzienki są zlewające się w co najmniej 70%. Następnie umyj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami HBSS, podgrzanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie dodaj 100 mikrolitrów HBSS zawierających 0,025 miligrama na mililitr TMR oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu i 0,025 miligrama na mililitr fluoresceiny oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu w każdym dołku, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po zakończeniu inkubacji wyjąć płytkę z inkubatora i umyć komórki sześciokrotnie 100 mikrolitrami HBSS. Po ostatnim praniu dodaj 100 mikrolitrów podgrzanego HBSS do komórek, a następnie umieść płytkę na mikroskopie z podgrzewanym stolikiem i komorą.Po dostosowaniu parametrów wzbudzenia i emisji dla TMR i fluoresceiny w razie potrzeby, uzyskaj obraz z każdej studzienki naprzemiennie między dwoma fluoroforami pomiędzy każdym dołkiem. Po pierwszej akwizycji sprawdź, czy wszystkie studzienki pozostały ostre na całej płycie, a następnie uzyskaj obrazy każdego dołka w odstępach od jednej do 15 minut przez żądany okres czasu. Podczas akwizycji obrazu dostosuj pH 50-mililitrowej podwielokrotności roztworu bogatego w potas buforowanego 25 milimolowymi kwasami HEPES do 7,5 przy użyciu 10-molowego kwasu solnego lub 10-molowego wodorotlenku potasu, w zależności od potrzeb.Następnie dostosować pH 350 mililitrowych podwielokrotności roztworu bogatego w potas buforowanego 25 milimolowym MES do pH 6,5, pH 5,5 i pH 5,0. Po zakończeniu akwizycji obrazu wyjmij HBSS z 96-dołkowej płytki zawierającej komórki i dodaj roztwór bogaty w potas o pH 7,5. Następnie dodaj nigerycynę w końcowym stężeniu 10 mikrogramów na mililitr.Umieść płytkę z powrotem na mikroskopie i uzyskaj obrazy każdej studzienki przy użyciu tych samych ustawień akwizycji, jak pokazano wcześniej. Aby zmierzyć zdarzenia oksydacyjne w makropinosomach, należy wysiać komórki RAW264.7 na 96-dołkowej płytce na dzień przed testem, jak wykazano wcześniej. Następnie w dniu testu umyj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami HBSS podgrzanym do 37 stopni Celsjusza.Następnie dodaj 100 mikrolitrów HBSS zawierających 0,025 miligrama na mililitr TMR oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu i 0,025 miligrama na mililitr H2DCFDA oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu do każdej studzienki, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po wyjęciu płytki z inkubatora należy przemyć komórki sześciokrotnie 100 mikrolitrami HBSS. Po ostatnim płukaniu dodaj 100 mikrolitrów HBSS do każdej studzienki i umieść płytkę na mikroskopie.Po dostosowaniu parametrów wzbudzenia i emisji dla TMR i H2DCFDA w razie potrzeby, należy uzyskać obrazy każdego odwiertu w odstępach od jednego do 15 minut, jak pokazano wcześniej. Aby zmierzyć trawienie białek w makropinosomach, wysiewaj komórki RAW264.7 na dzień przed testem, jak wykazano wcześniej. Następnie w dniu testu umyj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami HBSS podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie dodaj 100 mikrolitrów HBSS zawierających 0,025 miligrama na mililitr TMR oznaczonego 70 kilodaltonem dekstranu w 0,2 miligrama na mililitr albuminy jaja kurzego znakowanego BODIPY do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po wyjęciu komórek z inkubatora umyj je sześciokrotnie 100 mikrolitrami HBSS.Po ostatnim płukaniu dodaj 100 mikrolitrów HBSS do każdej studzienki, a następnie umieść płytkę na mikroskopie. Po dostosowaniu parametrów wzbudzenia i emisji dla TMR i BODIPY w razie potrzeby, należy uzyskać obrazy każdego odwiertu w odstępach od jednego do 15 minut, jak pokazano wcześniej. Podczas pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych lub degradacji białek w makropinosomach nie można zmierzyć dynamiki zakwaszenia przez pewien okres czasu odpowiadający fazie ładowania dekstranem, która różni się w zależności od użytego typu komórki.Podczas pomiaru pH makropinosomu stosunek fluoresceiny do TMR będzie się stopniowo zmniejszał i ustabilizuje się w ciągu 15 minut od akwizycji. Ten plateau odpowiada pH około pięciu, które w przybliżeniu odpowiada pH lizosomów. Na końcu każdej akwizycji przeprowadzana jest kalibracja in situ.Stosunek fluoresceiny do TMR powinien być największy w buforze kalibracyjnym przy pH 7,5 i stopniowo zmniejszać się, gdy kalibracyjne stają się bardziej kwaśne. Pozwala to na wygenerowanie krzywej kalibracyjnej. Podczas pomiaru zdarzeń oksydacyjnych w makropinosomach stosunek H2DCFDA do TMR będzie stopniowo zwiększał się i prawdopodobnie ustabilizuje się w ciągu pierwszych 20 do 30 minut w aktywowanych komórkach RAW264.7.Podczas pomiaru trawienia białek makropinosomalnych, podczas trawienia albuminy jaja kurzego uwalniany będzie coraz silniejszy sygnał fluoresceiny. W komórkach RAW264.7 wzrost fluorescencji uwolnionej z trawionej albuminy jaja kurzego znakowanej BODIPY ustabilizuje się w ciągu pierwszych 30 minut. Dzięki tej pojawiającej się roli w homeostazie i jej nowo odkrytemu znaczeniu dla patologii raka, obecnie prowadzone są badania nad renesansem makropinocytozy.Metody te dostarczyły zestawu narzędzi do badania wkładu makropinocytozy w te dziedziny badań.

measuring-ph-redox-chemistries-degradative-capacity-macropinosomes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Dostępnych jest kilka metod pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH cytoplazmatycznego i organellarnego. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodologię jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i pęcherzykowego za pomocą obrazowania ratiometrycznego żywych komórek.

Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Poznaj metodę pomiaru pH, zdarzeń redoks i degradacji białek w makropinosomach żywych komórek za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem. Technika ta ujawnia heterogeniczność na poziomie organelli.

Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

Przeglądaj więcej filmów