Izolowany system perfuzji płuc w modelu królika
15 lipca 2021
Preparat z izolowanych płuc królika jest złotym standardem w badaniach płuc. Niniejsza publikacja ma na celu opisanie techniki opracowanej do badania fizjologicznych i patologicznych mechanizmów związanych z reaktywnością dróg oddechowych, zachowaniem płuc oraz badaniami przedklinicznymi w zakresie transplantacji płuc i obrzęku płuc.
Technika ta jest przydatna w charakterystyce fizjologii i patologii płuc poprzez pomiar aktywności metabolicznej i funkcji oddechowych. Izolowany system perfuzji płuc pozwala na pracę z kompletnym funkcjonalnym narządem, umożliwiając badanie ciągłej funkcji fizjologicznej przy jednoczesnym odtworzeniu wentylacji i perfuzji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat charakterystyki nieoddechowych zdolności tkanek płucnych, takich jak aktywność metaboliczna i aktywność różnych składników, takich jak makrofagi pęcherzykowe i tkanka śródbłonka.
Na początek zmontuj aparaturę roboczą, upewniając się, że zawiera główną stalową kolumnę zamontowaną na płycie podstawy podtrzymującej sztuczną klatkę piersiową z pneumotachometrem i przetwornikiem masy umieszczonymi nad kolumną i za cewką podgrzewającą z pułapką bąbelkową. Podłącz wszystkie przetworniki do centralnej jednostki elektronicznej i przygotuj system wentylacji oprócz aparatu. Po ogoleniu miejsca operacyjnego znieczulonego królika należy wykonać brzuszne nacięcie linii środkowej o długości od trzech do pięciu centymetrów od mostka do szyi.
Za pomocą nożyczek operacyjnych przeciąć przednią część 2/3 tchawicy między pierścieniami chrząstki. Przełóż pięciomilimetrową kaniulę tchawicy przez błonę włóknistą tchawicy i ostrożnie przymocuj kaniulę jedwabnym szwem 4-0. Umieść kleszcze lub pęsetę pod tchawicą, aby upewnić się, że kaniula nie zgina się na tchawicy.
Podłącz pompę oddechową do kaniuli tchawicy, ustaw objętość oddechową na 10 mililitrów na kilogram i rozpocznij wentylację szybko po tracheotomii i przed otwarciem klatki piersiowej, aby utrzymać dodatnie ciśnienie w płucach w celu zapobiegania zapadnięciu się płuc podczas operacji. Aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej, użyj skalpela lub nożyczek, aby otworzyć ścianę klatki piersiowej i wykonać sternotomię przyśrodkową do górnej jednej trzeciej klatki piersiowej. Trzymaj połówki klatki piersiowej otwarte za pomocą dwóch zwijaczy.
Zlokalizuj żyłę główną górną i dolną i oznacz je nitkami. Przed wykrwawieniem zwierzęcia należy zidentyfikować prawą komorę i wstrzyknąć 1 000 jednostek międzynarodowych na kilogram heparyny. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy podwiązać żyłę główną górną i dolną za pomocą wstępnie zapętlonej nici.
Przeciąć manubrium mostek, aby przedłużyć sternotomię przyśrodkową w kierunku kaniuli tchawicy, uwalniając tchawicę po obu stronach z tkanki łączącej. Teraz wytnij tchawicę powyżej kaniuli tchawicy i delikatnie pociągnij kaniulę do góry w osi czaszkowo-ogonowej. Po wykrwawieniu w celu pobrania bloku krążeniowo-oddechowego należy użyć bezpośredniej dyssekcji cyfrowej lub nożyczek sprężynowych, aby oddzielić tkankę łączną i usunąć płuca z klatki piersiowej.
Następnie przeanalizuj naczynia krwionośne i przełyk. Wyjąć izolowane płuca z klatki piersiowej i ostrożnie umieścić płuca na sterylnej gazie na szalce Petriego. Aby zapobiec niedodmie, przewietrz płuca za pomocą wentylacji nadciśnieniowej z dodatnim końcowym ciśnieniem wydechowym ustawionym na dwa centymetry słupa wody.
Odetnij komory serca na poziomie rowka przedsionkowo-komorowego. Po otwarciu dwóch komór wprowadzić kaniulę tętnicy płucnej przez prawą tętnicę płucną, a lewą kaniulę przedsionka przez zastawkę mitralną do lewego przedsionka. Przymocuj kaniule za pomocą jedwabnego szwu 4-0, w tym otaczających tkanek w ligaturach tętnicy płucnej i lewego przedsionka, aby uniknąć rozdęcia strukturalnego.
Wstrzyknij 250 mililitrów izotonicznego roztworu soli fizjologicznej przez kaniulę tętniczą, aby wypłukać pozostałą krew z łożyska naczyniowego. Aby uzyskać konfigurację perfuzji, ostrożnie umieść izolowane płuca w komorze płuc. Przymocuj tchawicę do przetwornika na pokrywie komory i podłącz kaniulowane naczynia do systemu perfuzyjnego, a następnie zamknij i zabezpiecz komorę za pomocą zamka obrotowego.
Następnie załóż pokrywę komory i przekręć kurek, aby przełączyć się z wentylacji dodatniej na podciśnieniową. Perfuzjuj płuca 200 mililitrami sztucznego, bezkrwistego perfuzatu, zaczynając od przepływu w tempie trzech mililitrów na minutę na kilogram, a następnie powoli zwiększaj przepływ przez pięć minut do pięciu mililitrów na minutę na kilogram. Przez następne pięć minut pozwól, aby przepływ osiągnął osiem mililitrów na minutę na kilogram, a następnie maksymalny strumień 10 mililitrów na minutę na kilogram przez pięć minut.
Przewietrzyć płuca nawilżonym powietrzem z częstotliwością 30 uderzeń na minutę, objętością oddechową 10 mililitrów na kilogram i końcowym ciśnieniem wydechowym wynoszącym dwa centymetry słupa wody. Aby osiągnąć warunki strefy trzeciej, odczekaj od 10 do 15 minut, aby uzyskać równowagę charakteryzującą się stanem grawimetrycznym ISO, zapewniając, że ciśnienie żylne jest stabilne w całym rejestrze. Upewnij się, że masa płuca pozostaje stała, a ciśnienie w tętnicy i lewym przedsionku jest stabilne, aby osiągnąć warunki strefy trzeciej, aby otworzyć maksymalną liczbę naczyń płucnych i utrzymać zawartość łożyska mikronaczyniowego podczas eksperymentu.
W celu elektronicznego sterowania i przetwarzania sygnałów należy upewnić się, że przepływ oddechowy, zmiany masy, ciśnienie mikronaczyniowe, objętość oddechowa, opór naczyniowy, między innymi, są rejestrowane w wielu centralnych jednostkach elektronicznych, które integrują sygnały pochodzące z przetworników i wyświetlają je w systemie oceny. Oceniono stężenie 5-HT i monoaminooksydazy biorących udział w metabolizmie płuc i przepuszczalności naczyń krwionośnych. Stężenie 5-HT i monoaminooksydazy osiągnęło szczyt po 15 minutach przechowywania, a następnie spadło w ciągu następnych sześciu godzin.
Następnie poziomy perfuzji wykazały nieistotny statystycznie wzrost do 24 godzin. Szybkość uwalniania 5-HT i oksydazy monoaminowej wskazała, że w ciągu pierwszej godziny konserwacji poziomy 5-HT wzrosły wyżej niż monoaminooksydazy i zmniejszyły się w ciągu sześciu godzin po ponownym wychwyceniu przez komórki śródbłonka i płytki krwi, a także katabolizm za pośrednictwem oksydazy monoaminowej. Aktywność neutralnej endopeptydazy wzrastała po dziewięciu godzinach, a następnie zmniejszała się i utrzymywała się na stałym poziomie przez 12 do 24 godzin.
Aktywność konwertazy angiotensyny zmniejszyła się po czterech godzinach, a następnie wzrosła i pozostała stabilna przez 24 godziny. Wpływ zachowania płuc na przepuszczalność naczyń włosowatych oceniano przez 24 godziny, co wskazuje, że perfuzja płuc doznała postępującego wzrostu współczynnika filtracji kapilarnej. Sprawdzono wpływ różnych dodatków na przepuszczalność kapilarną izolowanego systemu perfuzji płuc w różnych warunkach i zaobserwowano maksymalny wzrost przepuszczalności w przypadku atropiny.
Najważniejszym manewrem jest prawidłowe umieszczenie płuc w komorze płucnej i połączenie naczyń kaniulowanych z systemem perfuzyjnym. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku interakcji między substancjami krążącymi a skutkami substancji wdychanych lub perfuzjonowanych, takich jak testy narkotykowe i różne patologie płuc.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Preparat izolowanych płuc królika jest kluczowym narzędziem w badaniach pulmonologicznych, umożliwiającym analizę mechanizmów fizjologicznych i patologicznych. Technika ta ułatwia charakterystykę fizjologii i patologii płuc poprzez pomiar aktywności metabolicznej oraz funkcji oddechowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad płucami
- Fizjologia
- Patologia
Wprowadzenie
- System izolowanej perfuzji płuc umożliwia badanie kompletnego, funkcjonalnego narządu.
- Metoda ta odtwarza wentylację i perfuzję w celu ciągłej analizy funkcji fizjologicznych.
- Zapewnia ona wgląd w pozadychawicze możliwości tkanek płucnych.
- Kluczowe elementy obejmują aktywność makrofagów pęcherzykowych oraz tkanek śródbłonka.
Cel badania
- Opisanie techniki izolacji preparatu płuca królika.
- Zbadanie reaktywności dróg oddechowych oraz konserwacji płuc.
- Wsparcie badań przedklinicznych w zakresie transplantacji płuc i obrzęku płuc.
Zastosowane metody
- Montaż aparatury roboczej wraz z niezbędnymi komponentami.
- Podłączenie przetworników do centralnej jednostki elektronicznej.
- Przygotowanie systemu wentylacji.
- Wykonanie procedur chirurgicznych na znieczulonym króliku.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia szczegółowy pomiar funkcji oddechowych.
- Zwiększa ona zrozumienie procesów metabolicznych w tkankach płucnych.
- Ułatwia badanie różnych komponentów płuc.
- Zapewnia wiarygodny model do badań przedklinicznych.
Wnioski
- Izolowany preparat płuca królika stanowi cenne narzędzie badawcze.
- Wnosi on istotny wkład w zrozumienie fizjologii i patologii płuc.
- Metoda ta jest niezbędna dla rozwoju badań nad chorobami płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System izolowanej perfuzji płuc umożliwia bezpośrednią ocenę reakcji płuc na związki farmakologiczne w fizjologicznie istotnym modelu ex vivo. Podejście to wspomaga walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez pomiar aktywności metabolicznej, przepuszczalności naczyniowej i funkcji oddechowych w kompletnym systemie narządowym. Zapewnia ono pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów w procesie odkrywania leków na choroby układu oddechowego, symulując fizjologię płuc istotną dla ludzi bez zmienności charakterystycznej dla całych organizmów zwierząt.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie stopnia zaangażowania celów płucnych poprzez ocenę aktywności metabolicznej makrofagów pęcherzykowych i tkanki śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów płucnych poprzez pomiar mechaniki oddechowej i odpowiedzi naczyniowych w czasie rzeczywistym.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację współczynnika filtracji kapilarnej (Kfc) w celu oceny tworzenia się obrzęków oraz integralności bariery.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych danych z rozdzielczością czasową na temat enzymów metabolicznych płuc, takich jak kinetyka uwalniania 5-HT i monoaminooksydazy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje parametry perfuzji i wentylacji (np. objętość oddechowa 10 mL/kg, PEEP 2 cm H₂O) w celu uzyskania powtarzalnych wyników testowania związków.
- Gotowość do analizy: Umożliwia ocenę wpływu substancji wziewnych lub perfuzyjnych na fizjologię płuc w kontrolowanych warunkach strefy trzeciej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Modeluje dynamikę perfuzji ludzkich płuc w celu wsparcia oceny przedklinicznej kandydatów na leki pulmonologiczne.
- Zgodność biomarkerów: Śledzi zmiany aktywności enzymatycznej (np. konwertazy angiotensyny, endopeptydazy neutralnej) jako translacyjnych biomarkerów preservecji płuc.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Umożliwia podłużną ocenę żywotności płuc (okno 5–8 h) w celu określenia kryteriów go/no-go w rozwoju terapii pulmonologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
System izolowanej perfuzji płuc mieści się w kontinuum procesów badawczych, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne dopracowywanie kandydatów na leki pulmonologiczne w oparciu o odczyty funkcjonalne na poziomie organu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących celów płucnych poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym parametrów metabolicznych i oddechowych.
- Przesiew: Dostarcza standaryzowanych, ilościowych danych dotyczących perfuzji i wentylacji, niezbędnych do zapewnienia powtarzalności testów oraz rankingu związków.
- Analityka: Generuje mierzalne punkty końcowe, w tym współczynnik filtracji kapilarnej (Kfc), opór naczyniowy, objętość oddechową oraz szybkość uwalniania enzymów do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną fazę odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie procesów konserwacji płuc i progresji uszkodzeń istotnych dla człowieka.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania wielu związków lub warunków w określonym oknie żywotności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedzi leku w płucach.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom kanulacji, perfuzji i wentylacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie wad płucnych, co redukuje odsetek niepowodzeń w późnych fazach badań.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o odczyty funkcjonalne i bezpieczeństwo płucne.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik chirurgicznych u gryzoni, kaniulacji naczyń oraz pobierania bloków sercowo-płucnych.
- Zależne od precyzyjnej aparatury, w tym pneumotachometru, przetwornika masy oraz centralnej jednostki elektronicznej do integracji sygnałów.
- Wymaga standaryzacji przepływów perfuzyjnych (3–10 mL/min/kg) oraz parametrów wentylacji (30 bpm, objętość oddechowa 10 mL/kg) pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji dla różnych gatunków lub modeli chorobowych ze względu na gatunkowe różnice w odpowiedziach naczyniowych i metabolicznych.
- Ograniczone przez postępujący wzrost współczynnika filtracji kapilarnej w czasie, co ogranicza czas trwania eksperymentu do 5–8 godzin przed wystąpieniem znacznego obrzęku.
