Ekstrakcja kofaktora F₄₂₀ do analizy długości ogona poliglutaminianu z czystych kultur metanogennych i próbek środowiskowych

Metoda ekstrakcji kofaktora F₄₂₀ z czystych kultur została zoptymalizowana do separacji metodą chromatografii cieczowej i analizy długości ogona F₄₂₀ w czystych kulturach i próbkach środowiskowych.

Kofaktor F420 odgrywa ważną rolę w pierwotnym i wtórnym metabolizmie wielu prokariontów. Pomiar tej cząsteczki w próbkach środowiskowych umożliwia głębsze zrozumienie jej występowania i funkcji. Technika ta umożliwia analizę kofaktora w trudnych materiałach próbnych, takich jak szlam i gleba.

W związku z tym liza materiału i wstępne oczyszczanie przed analizą są centralnymi etapami. Protokół obejmuje różne etapy przygotowania próbki. Kroki te muszą być bardzo dobrze zaplanowane i przygotowane przed rozpoczęciem przetwarzania próbki.

Na przykład ważne jest przygotowanie świeżych. Aby rozpocząć lizę próbki, umieść pięć gramów próbki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj pięć mililitrów buforu do lizy 2X do próbek i doprowadź objętość do 10 mililitrów wodą destylowaną, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 grama na mililitr.

Rozcieńczone próbki należy wirować przez 20 sekund, a następnie sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza. W przypadku próbek suchych, takich jak gleba leśna, po autoklawowaniu doprowadzić do końcowej objętości 20 mililitrów wodą destylowaną i ponownie wirować rozcieńczoną próbkę przez 20 sekund, jak pokazano. Po ostygnięciu próbek odwirować lizat próbki przez pięć minut przy 11 000 x g i zebrać supernatant.

Przygotować pięciomililitrową kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej lub SPE wypełnioną 100 miligramami słabego anionowego sorbentu polimerowego w trybie mieszanym, kondycjonując anionitor trzema mililitrami metanolu. Następnie zrównoważyć wymieniacz anionowy z trzema mililitrami wody destylowanej. Załadować do dziewięciu mililitrów supernatantu z odwirowanego lizatu na kolumnę SPE.

Kolejno przemyj zanieczyszczenia z kolumny pięcioma mililitrami 25-milimolowego octanu amoniaku i pięcioma mililitrami metanolu. Po przemyciu eluować kofaktor F420 jednym mililitrem buforu elucyjnego. Ustaw piekarnik na 40 stopni Celsjusza i ustaw detektor fluorescencji na długość fali ekstynkcji 420 nanometrów i długość fali emisji 470 nanometrów.

Następnie przefiltrować wymytą próbkę z SPE do fiolek HPLC za pomocą filtra PTFE o wielkości porów 0,22 mikrona. Wstrzyknąć 50 mikrolitrów przefiltrowanej próbki do systemu HPLC i oddzielić kofaktor F420 w trybie gradientowym, stosując kombinację faz ruchomych, jak opisano w manuskrypcie. Przeanalizuj skład i stężenie kofaktora F420.

Wzrost czystych kultur metanogenów zweryfikowano za pomocą mikroskopii. W mikroskopii z kontrastem fazowym widoczne są aglomeraty metanogenów, które emitują niebieskawe światło, gdy kofaktor F420 jest wzbudzany światłem ultrafioletowym. Analizowano obszar piku odzyskanego kofaktora F420 po SPE z różnymi objętościami kultur Methanoculleus thermophilus.

W strategii dezintegracji w autoklawie osiągnięto najwyższy obszar piku, co pozwoliło uzyskać maksymalną wydajność ekstrakcji przy użyciu obróbki ciśnieniowo-temperaturowej. Analiza rozkładu długości ogona ujawniła różnice w ogólnym stężeniu kofaktora F420 i rozkładzie długości ogona F420 w kulturach czystych metanogenów w próbkach środowiskowych. Stosując tę procedurę, należy pamiętać, aby całkowicie zebrać całkowitą objętość buforu elucyjnego lub zapisać dokładną objętość przepływu.

Technika ta toruje drogę do eksploracji kofaktora F420 w bardziej złożonych próbkach, takich jak gleba i szlamy, oraz umożliwia głębszy wgląd w wpływ tej cząsteczki na środowisko.