Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych
August 25th, 2021
Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.
Protokół ten stanowi alternatywną metodę in vivo do badania roli zarodkowego śmiertelnego nokautu genu we wzroście nowotworu. Zaletą tej metody jest to, że nokauty genów, które normalnie są śmiertelne dla zarodka, można przeprowadzić w guzach pochodzących z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy w celu zbadania ich skutków utraty funkcji in vivo. Technika ta może być stosowana w chorobach, które wymagają zbadania in vivo roli embrionalnych genów niezbędnych do osiągnięcia w tradycyjnych modelach myszy z nokautem genów.
Wygenerowanie modelu zwierzęcego wymaga czasu i wymagane są badania empiryczne w celu określenia optymalnego MOI dla infekcji adenowirusowej, aby zapewnić odpowiednią rekombinację. Na początek zidentyfikuj mysz z pożądanym genotypem. Kiedy mysz z guzem osiągnie humanitarny punkt końcowy, poddaj ją eutanazji i użyj sterylnego noża skalpela, aby usunąć guz.
Rozbioruj guz na trzy sekcje w kawałkach przypominających bochenek chleba za pomocą noża skalpela, aby wygenerować segmenty tkanki do wiązania formaliny, osadzania parafiny, wczesnego pasażowania, generowania kultur i błyskawicznego zamrażania do analiz analitycznych. Utrwalony w formalinie, zatopiony w parafinie wycinek tkanki o grubości pięciu mikrometrów zabarwić hematoksyliną i eozyną. Gdy patolog potwierdzi guz, wykonaj barwienie immunohistochemiczne, aby potwierdzić diagnozę guza.
Umieść świeżo pobraną złośliwą tkankę guza osłonki nerwów obwodowych w 10 mililitrach lodowatego sterylnego PBS na lodzie, a następnie przenieś ją do sterylnego obszaru roboczego w celu założenia wczesnych kultur pasażowych. Zmiel tkankę nowotworową na kawałki o wielkości od dwóch do czterech milimetrów i rozcieraj od ośmiu do 10 razy w naczyniu do hodowli tkankowej o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych zawierającym 10 mililitrów pożywki wzrostowej. Hoduj te tkanki w pożywce wzrostowej DMEM-10 o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10 nanomolową neureguliną-1 beta i dwoma mikromolowymi forskolinami.
Wysiewaj wcześnie pasażowane komórki nowotworowe o gęstości 1,5 razy 10 do szóstych komórek na jedno 10-centymetrowe naczynie do hodowli tkankowej poddane działaniu środka zawierającego pożywkę wzrostową DMEM-10. Po 12 do 16 godzinach przemyj przylegające kultury dwoma do czterech mililitrów DPBS i zainfekuj komórki adenowirusem w ilości około 400 jednostek tworzących blaszkę na komórkę w 10 mililitrach DMEM bez surowicy. Po 48 godzinach od infekcji krótko sprawdź komórki pod kątem sygnału EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zapewnić skuteczną infekcję około 50 do 100% dodatnich komórek, a następnie FACS sortuje zakażone komórki EGFP.
Po sortowaniu metodą FACS należy pozostawić komórki do regeneracji w inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej 24 do 48 godzin, a następnie przygotować komórki do analiz komórkowych in vitro lub przeszczepów in vivo. Potwierdź delecję Erbb4, wykonując PCR przy użyciu genomowego DNA wyizolowanego z części posortowanych komórek EGFP-dodatnich. Wykonaj testy proliferacji w ciągu następnych siedmiu dni na posortowanych komórkach nowotworowych posianych na 96-dołkowej płytce za pomocą automatycznego cytometru opartego na obrazie.
Wybarwić komórki haczykami i barwnikami jodku propidyny i uchwycić obrazy komórek za pomocą automatycznego czytnika płytek, aby policzyć liczbę żywych i martwych komórek w każdym dołku. Wyizoluj całkowite RNA z posortowanych komórek nowotworowych przy użyciu standardowego kwasu, fenolu guanidyny i metody na bazie chloroformu. Otwórz oprogramowanie, aby wykonać wyrównanie sekwencji RNA, postępując zgodnie z krokami specyficznymi dla programu, korzystając z ustawień domyślnych.
Wybierz metodę analizy, wyszukiwanie RNA, a następnie wybierz genom referencyjny myszy. Prześlij plik BED, jeśli został dostarczony przez rdzeń sekwencjonowania. Prześlij pliki sekwencjonowania FASTQ i przypisz im unikatowe nazwy replikacji.
Grupuj replikację plików FASTQ i wyznaczaj je do zestawu replikacji. W celu przeprowadzenia analizy statystycznej i normalizacyjnej w celu zidentyfikowania różnicowych sygnałów ekspresji genów o solidnej mocy statystycznej, otwórz oprogramowanie analityczne i wybierz pliki GFP FASTQ jako zestaw danych kontrolnych. Następnie wybierz DESeq2 jako metodę statystyczną i normalizacyjną, a następnie rozpocznij montaż i analizę.
Wykorzystaj zestawy danych ontologii genów zintegrowane z ogólnodostępnymi narzędziami do analizy wzbogacenia funkcjonalnego, aby przeprowadzić analizę wzbogacenia funkcjonalnego na zidentyfikowanym statystycznie istotnym DEG za pośrednictwem Erbb4 w celu określenia biologicznego i szlakowego znaczenia utraty genu Erbb4. Wstrzyknij komórki nowotworowe do nerwu kulszowego znieczulonej myszy, aby ocenić potencjał wzrostu przeszczepu allogenicznego in vivo w komórkach po zakażeniu. Gdy guz osiągnie wymagany rozmiar, wypreparuj guz z myszy poddanej eutanazji na dwie-trzy sekcje, jak pokazano wcześniej.
Umocuj jeden fragment tkanki w 4% paraformaldehydzie przez noc, a następnie zanurz utrwalony fragment w parafinie. Po wykonaniu skrawków o grubości pięciu mikrometrów z tkanki FFPE, zamontuj wycinek na szkiełkach i potwierdź obecność komórek nowotworowych w przeszczepionej tkance za pomocą H&E i barwienia immunologicznego, jak wykazano wcześniej. Aby potwierdzić in vivo różnice w ekspresji Erbb4 między dwoma warunkami eksperymentalnymi, należy wybarwić utrwaloną w formalinie, zatopioną w parafinie tkankę przeciwciałami specyficznymi dla Erbb4.
Analizowano transdukcję złośliwych komórek tkanki nowotworowej osłonki nerwu obwodowego z adenowirusem. Komórki wykazujące ekspresję EGFP wykryto za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a całkowitą liczbę komórek określono za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Po ablacji genu za pośrednictwem Cre, w zależności od skuteczności transfekcji, genotypowanie PCR wykazało całkowity nokaut genu i niejednorodną populację komórek indukowanych i nieindukowanych w porównaniu z transdukcją kontrolną.
Charakterystyczna histopatologia stwierdzona w ortotopowych alloprzeszczepach złośliwych tkanek osłonki nerwu obwodowego w porównaniu z guzami pochodzącymi z oryginalnych genetycznie zmodyfikowanych modeli zwierzęcych wykazała różnicę w morfologii komórek. Ablacja Erbb4 zmniejszyła gęstość komórkową i proliferację komórkową w komórkach ablowanych adeno5-CMV-Cre kontrolujących komórki transdukowane adeno5-CMV-GFP. Ekspresja Erbb4 w komórkach nowotworowych transdukowanych adeno5-CMV-Cre lub wirusem EGFP była zmniejszona w wyniku przeszczepów allogenowych transdukowanych adeno5-CMV-Cre w porównaniu z kontrolnymi guzami alloprzeszczepu traktowanymi adeno5-CMV-EGFP.
Gęstość naczyń oceniano za pomocą wykrywania immunoreaktywności dla CD31, a reprezentatywne wyniki wykazały znacznie zmniejszoną gęstość naczyń w przeszczepach allogenicznych komórek transdukowanych adeno5-CMV-Cre w porównaniu z komórkami kontrolnymi transdukowanymi adeno5-CMV-EGFP. Po ablacji genów komórki mogą być wykorzystywane do wielu różnych rodzajów testów komórkowych, takich jak proliferacja, migracja, wzrost 3D lub zmiany mikrośrodowiska, a także do iniekcji ortotopowych in vivo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół zapewnia metodę in vivo do badania roli embrionalnie śmiertelnych knockoutów genów w wzroście nowotworów. Dzięki wykorzystaniu genetycznie zmodyfikowanych modeli mysich, naukowcy mogą badać wpływ tych knockoutów na cechy nowotworowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Genetyka
Tło
- Knockouty genów są zazwyczaj embrionalnie śmiertelne.
- Badanie tych genów w nowotworach oferuje wgląd niemożliwy do uzyskania z tradycyjnych modeli.
- Empiryczne testy są konieczne, aby zoptymalizować infekcję adenowirusową na potrzeby rekombinacji.
- Modele zwierzęce wymagają starannej selekcji na podstawie pożądanych genotypów.
Cel badania
- Ocenić wpływ embrionalnie śmiertelnych knockoutów genów na wzrost nowotworów.
- Zbadać efekty utraty funkcji in vivo.
- Zaoferować metodę badania genów esencjanych w kontekście chorobowym.
Zastosowane metody
- Identyfikacja myszy z pożądanym genotypem.
- Eutanazja myszy z nowotworami w humanitarnych punktach końcowych.
- Wykorzystanie sterylnych technik do usuwania nowotworów w celu analizy.
- Ocenianie wzrostu, proliferacji i innych cech nowotworów po knockoutach.
Główne wyniki
- Wykazano wykonalność badania embrionalnie śmiertelnych knockoutów genów w nowotworach.
- Dostarczono wglądu w zachowanie nowotworów i funkcję genów.
- Podkreślono zalety stosowania genetycznie zmodyfikowanych modeli mysich.
- Pokazano potencjalne zastosowania w rozumieniu mechanizmów chorobowych.
Konkluzje
- Ta metoda umożliwia badanie genów esencjanych in vivo.
- Otwierają nowe drogi dla badań w biologii nowotworów.
- Przyszłe badania mogą budować na tym protokole, aby eksplorować różne czynniki genetyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in target validation: the inability to study embryonic lethal genes in traditional knockout models. By enabling conditional ablation in short-term tumor cultures derived from GEM models, it provides a renewable, low-passage system for de-risking therapeutic targets in solid tumors. The approach supports mechanistic interrogation of gene function in migration, invasion, metastasis, and secretome-mediated communication, directly informing go/no-go decisions in oncology target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of embryonic lethal genes as therapeutic targets in MPNST and related solid tumors.
- Operational Value: Provides a renewable source of low-passage tumor-derived cells with reduced in vitro growth artifacts for consistent target interrogation.
- Predictive Value: Supports assessment of gene ablation effects on proliferation, viability, transcriptome, and orthotopic allograft growth to inform target confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified, EGFP-sorted tumor cells amenable to proliferation, migration, 3D growth, and microenvironment assays.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of cellular proliferation via image-based cytometry and viability via propidium iodide staining for assay standardization.
- Transcriptomic Screening: Facilitates RNA-seq and DESeq2 analysis to identify differentially expressed genes and pathway-level consequences of target ablation.
Translational & Preclinical Research
- In Vivo Validation: Supports orthotopic allograft growth assessment in immunocompromised mice to evaluate tumor growth potential post-ablation.
- Microenvironment Analysis: Permits quantification of vascular density via CD31 immunostaining to assess angiogenic dependencies of the targeted gene.
- Secretome Interrogation: Enables study of intercellular communication and metastasis-related phenotypes in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, particularly for targets where conventional knockout is embryonically lethal. It bridges in vitro mechanistic studies with in vivo functional validation in a physiologically relevant tumor context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis interrogation of gene function in tumorigenesis via ablation of floxed alleles in primary tumor cells.
- Screening: Enables standardized, reproducible cellular assays (proliferation, viability) using FACS-purified, virus-transduced tumor cells.
- Analytics: Generates quantitative molecular and phenotypic readouts including PCR-confirmed knockout, RNA-seq differential expression, and functional enrichment of Erbb4-mediated DEGs.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo allograft models, enabling assessment of tumor growth, cellular density, and vascularization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any embryonic lethal gene in MPNST or analogous tumor models via adenoviral Cre delivery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling loss-of-function studies of essential genes in a tumor-specific context.
- Operational Value: Standardizes tumor dissociation, culture, viral transduction, and FACS purification for reproducible target validation workflows.
- Strategic Value: Improves target prioritization by providing direct evidence of gene function in tumor proliferation, survival, and microenvironment modulation.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by validating targets in a disease-relevant, genetically defined model system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in GEM model handling, tumor dissection, and aseptic tissue culture techniques.
- Dependent on access to fluorescence microscopy, FACS sorting, and automated cytometry for infection efficiency and proliferation analysis.
- Necessitates molecular biology capabilities for genomic DNA isolation, PCR genotyping, and RNA extraction for downstream transcriptomics.
- Requires bioinformatics support for RNA-seq alignment, DESeq2 normalization, and functional enrichment analysis using gene ontology tools.
- Limited to tumors derived from appropriate GEM models; success depends on empirical optimization of adenoviral MOI for efficient Cre-mediated recombination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Tumor Dissection and Staining
1:46
Ex Vivo Ablation of Floxed Erbb4 Alleles in MPNST Cells
3:52
Proliferation Assays in MPNST Cells with Ablated Erbb4 Alleles
4:23
RNA-Seq Analyses and Gene Identification with Altered Expression by Erbb4 Loss
6:04
Orthotopic Allograft of MPNST Cells with Ablated Erbb4 Alleles and Erbb4 Ablation Effects Analysis
7:10
Results: Effect of Adenovirus Transduction on MPNST Cells and Allografts
9:09
Conclusion
