Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Nasz protokół przedstawia zoptymalizowane narzędzie do badania serca danio pręgowanego in vivo i opisuje techniki unieruchamiania wraz z procesem pozyskiwania i analizy danych do obrazowania serca. Danio pręgowany to modelowy system kardiologiczny o dużym potencjale do zastosowań takich jak badania przesiewowe leków. Protokoły, które umożliwiają delikatne obrazowanie w warunkach fizjologicznych, są kluczowe przy badaniu chorób serca.

Przedstawiony tutaj przepływ pracy koncentruje się na obrazowaniu embrionalnego serca danio pręgowanego, ale zmodyfikowaną wersję można zastosować do różnych innych próbek i eksperymentów, w tym kałamarnic, robaków i hydr. Zacznij od zebrania zarodków uzyskanych z hodowli pożądanych linii transgenicznych. Trzymaj zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza na szalce Petriego wypełnionej podłożem rybnym E3.

Użyj szklanej igły z otworem zamontowanej na mikromanipulatorze i podłączonej do wstrzykiwacza Pico, aby wstrzyknąć 30 pikogramów mRNA alfa-bungarotoksyny do żółtka jednego lub dwóch zarodków w stadium komórkowym w celu unieruchomienia ryby. Jaja należy przechowywać w temperaturze 28 stopni Celsjusza na szalce Petriego wypełnionej pożywką E3 i co 24 godziny przenosić jaja do nowego naczynia zawierającego świeżą pożywkę E3 do momentu wyobrazienia. Aby zapobiec tworzeniu się pigmentu, jeśli tło danio pręgowanego nie jest albinosem, przenieś rybę po 25 godzinach od zapłodnienia do nowego naczynia zawierającego pożywkę E3 z 0,2 milimolowym inhibitorem tyrozynazy 1-fenylo 2-tiomocznikiem, znanym również jako PTU.

Aby wyprostować rurkę z fluorowanym etylenem i propylenem, umieść rurkę w szklanej lub stalowej rurki bezpiecznej w autoklawie o odpowiedniej średnicy wewnętrznej, pasującej do probówek polimerowych i autoklaw w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Gdy rurki osiągną temperaturę pokojową, wyjmij wyprostowaną rurkę polimerową. Do czyszczenia probówki należy użyć strzykawki o średnicy 50 milimetrów, aby dwukrotnie przepłukać probówkę jednym molem wodorotlenku sodu.

Przyciąć probówkę do rozmiaru 50 mililitrowej probówki wirówkowej, umieścić w probówce wirówkowej wypełnionej 0,5 molowym wodorotlenkiem sodu i ultradźwiękami na 10 minut. Przepłucz rurkę fluorowanego etylenu i propylenu wodą podwójnie destylowaną, a następnie 70% etanolem. Probówki transferowe, świeża probówka wirówkowa zawierająca 70% etanolu i ultradźwięki przez 10 minut.

Po ultradźwiękach przepłukać probówkę po raz ostatni wodą podwójnie destylowaną i przechowywać ją w probówce wirówkowej zawierającej podwójnie destylowaną wodę. Po rozpuszczeniu agarozy o niskiej temperaturze topnienia w pożywce E3 wlej stopioną agarozę do szklanej lub plastikowej szalki Petriego, aby uzyskać warstwę o grubości od jednego do dwóch milimetrów. Gdy agaroza zestali się, delikatnie wylej podłoże E3 na wierzch agaru, aby zapobiec wysuszeniu.

Uszczelnij płytkę folią parafinową i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozmrozić roztwór podstawowy trikainy i dodać 0,02% trikainy do podłoża E3 bez błękitu metylowego, aby użyć go jako podłoża do zatapiania. Użyj jednorazowej szklanej pipety, aby przenieść rybę do podłoża do zatapiania.

Sprawdź, czy ryba przestała się poruszać, a serce bije z podobną prędkością w porównaniu do kontroli. Przytnij rurkę z fluorowanym etylenem i propylenem na idealną długość za pomocą żyletki. Przygotuj strzykawkę z kaniulą z końcem.

Napełnić strzykawkę powietrzem, a następnie zamontować rurkę na igle i delikatnie wypłukać pozostałą wodę, opróżniając strzykawkę. Następnie napełnij rurkę z fluorowanym etylenem i propylenem zamontowaną na strzykawce z podłożem. Włóż zarodek do probówki, trzymając głowę ryby blisko końca rurki, unikając tworzenia się pęcherzyków.

Za pomocą żyletki ostrożnie przeciąć rurkę na krawędzi końca kaniuli lub igły. Po wylaniu płynu na wierzch naczynia pokrytego agarem, zanurz probówkę prosto w agarze . Obróć rurkę i wyjmij ją, aby uwolnić korek z łoża agarozy.

Sprawdź, czy na końcu probówki znajduje się zatyczka agarowego. W przypadku długotrwałego obrazowania wytnij od trzech do pięciu otworów w rurce w każdym kardynalnym kierunku, co najmniej pięć milimetrów nad końcem ryby, umieszczając żyletkę prostopadle do osi rurki i wykonaj nacięcie w rurce pod kątem 30 stopni, aż dotrze do nośnika montażowego. Następnie wykonaj drugie nacięcie pod kątem 180 stopni, aby utworzyć otwór i zwiń rurkę, aby wyraźnie uwidocznić nacięcia.

Przenieś zamontowany zarodek do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pożywkę do zatapiania, aż będzie gotowy do obrazowania. Zamontuj probówkę w uchwycie na próbkę i napełnij komorę obrazowania mediami do zatapiania. Umieść uchwyt na próbkę na stoliku tak, aby próbka zanurzała się w komorze.

Sprawdź stan zdrowia osadzonych ryb, wizualnie oceniając tętno, a jeśli bicie serca jest zbyt wolne, wyrzuć próbkę. Zawsze używaj tej samej pozycji próbki do powtarzalnego obrazowania i obracaj rybę tak, aby oba oczy znajdowały się w płaszczyźnie ogniskowej. Następnie obróć rybę o około 20 do 30 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara przez 48 godzin po zapłodnieniu.

Gdy ryba dostosuje się do mocy lasera, wybierz stronę oświetlenia, która zapewnia najlepszą jakość obrazu. Na każdej płaszczyźnie Z nagrywaj od czterech do pięciu uderzeń serca z szybkością 300 klatek na sekundę lub więcej. Aby zarejestrować bicie serca, przesuwaj próbkę krok po kroku przez arkusz światła i użyj odstępu Z wynoszącego od jednego do dwóch mikrometrów, aby pokryć całą głębokość serca.

Załaduj plik 4D do oprogramowania do renderowania 3D, aby eksplorować dane i generować filmy z renderowanym sercem danio pręgowanego. Po 48 godzinach od zapłodnienia serce właśnie przeszło pętlę i ma dwie komory, komorę i przedsionek, ale nie rozwinęły się jeszcze zastawki. Różne struktury serca, takie jak komora, kanał przedsionkowo-komorowy, przedsionek, droga dopływu i droga odpływu, są łatwe do odróżnienia.

Dane wskazywały na precyzyjne bicie i ujawniły złożone interakcje między dwiema warstwami komórek serca, mięśniem sercowym, warstwą mięśnia sercowego z pojedynczą komórką, która kurczy się i generuje siłę, oraz wsierdziem, pojedynczą warstwą komórkową łączącą serce z naczyniami krwionośnymi. Najważniejsze jest, aby zawsze weryfikować stan próbki i stałe bicie serca pod stereoskopem. Podczas gdy konwencjonalne techniki często wpływają na kształt lub funkcję serca, nasze metody dostarczają nam dynamicznych, niezakłóconych danych o bijącym sercu, które pomagają nam zrozumieć podstawy wczesnego embrionalnego serca.