Name: In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans za pomocą fluorescencyjnie znakowanego białka EBP. Technika ta umożliwia analizę orientacji i zachowania mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yishi Jin i Andrew Chisholm za początkowe wsparcie i szczep użyty w badaniu. Szczep bakteryjny OP50 został komercyjnie wykorzystany w Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finansowanym przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dziękujemy również Dharmendrze Puri za standaryzację procedur eksperymentalnych. Badanie jest finansowane z grantu podstawowego Narodowego Centrum Badań nad Mózgiem (wspieranego przez Departament Biotechnologii rządu Indii), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) dla S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) dla A.G.-R oraz grantu z Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) do A.G.-R.

1. Szczep reporterski: Hodowla i utrzymanie
UWAGA: Aby zmierzyć dynamikę i orientację mikrotubul w neuronach PLM, użyliśmy szczepu robaka wyrażającego EBP-2::GFP pod promotorem specyficznym dla neuronów dotykowych mec-4 (allel juIs338)18,25,26. Używamy standardowych metod hodowli i konserwacji robaków dla tego szczepu27.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do wzrostu nicieni (3,0 g/l chlorku sodu, 2,5 g/l peptonu, 20,0 g/l agaru, 10 mg/l cholesterolu (rozcieńczonego z roztworu podstawowego 10 mg/ml)) w wodzie i autoklawować mieszaninę.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę krótko przez 10-15 minut, a następnie uzupełnić ją 1 mM chlorku wapnia, 1 mM siarczanu magnezu i 25,0 mM fosforanu potasu jednozasadowego o pH 6,0.</li>
	<li>Wlać około 9 ml mieszaniny na szalki Petriego o średnicy 60 mm za pomocą sterylnego dozownika, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej i sterylnych warunkach przez jeden dzień, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 50 ml bulionu B (5,0 g/l chlorku sodu, 10,0 g/l bakto-tryptonu), autoklaw i schłodzić przed zaszczepieniem pojedynczą kolonią Escherichia coli (szczep OP50).</li>
	<li>Hodować bakterie w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Doprowadź schłodzone płytki NGM do temperatury pokojowej w celu wysiewu i za pomocą wysterylizowanego rozsiewacza szkła rozsmaruj bakterie OP50 na płytce NGM.</li>
	<li>Utrzymuj zaszczepione płytki NGM w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, co pozwoli na utworzenie bakteryjnego trawnika do hodowli C. elegans. Płytki te można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Umieść szczep transgeniczny na wysiewanych płytkach NGM.</li>
	<li>Wysterylizuj platynowy druciany szpikulec na płomieniu i wybierz 20-25 grawitacyjnych dorosłych hermafrodytów do przeniesienia na świeżo wysiany talerz.</li>
	<li>Po przeniesieniu przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 20 °C na 1 godzinę. Następnie wyciągnij dorosłe osobniki z tych talerzy. Te talerze będą teraz zawierały jaja, które są dopasowane do wieku.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 20 °C w celu odchowu do momentu osiągnięcia fazy rozwojowej będącej przedmiotem zainteresowania, którą w tym przypadku jest stadium L4 po 43,5 godziny po złożeniu jaj. Aby uzyskać więcej robaków, przyłóż wiele tablic, aby uniknąć zatłoczenia.</li>
	<li>Na pożądanym etapie rozwoju, robaki te mogą być zamontowane w celu obrazowania komet EBP-2::GFP.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki: Montaż robaków do obrazowania komet EBP-2
UWAGA: Aby umożliwić obserwację komet EBP na żywo w neuronach PLM, umieściliśmy robaki na poduszkach agarozowych, aby zminimalizować ich ruchliwość, nie naruszając jednocześnie fizjologii neuronu. Spośród różnych metod unieruchomienia wybraliśmy rozwiązanie z kulkami polistyrenowymi 0,1 μm, które są łatwo dostępne na rynku. Przedstawiliśmy procedurę montażu używaną specjalnie do obserwacji EBP-2::GFP.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 10% agarozy, topiąc 0,2 g agarozy w 2 ml 1x buforu M9 (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) w szklanej probówce o pojemności 5 ml nad płomieniem. Ta probówka może z łatwością zmieścić się w bloku grzewczym, który utrzymuje agarozę w stanie stopionym do momentu użycia.</li>
	<li>Za pomocą zakraplacza z szerokim otworem dozuj kroplę (około 100 μl) tej stopionej agarozy na czyste szkiełko o wymiarach 35 mm x 25 mm.</li>
	<li>Gdy jest w stanie stopionym, dociśnij kroplę innym szkiełkiem, aby utworzyć cienką warstwę agarozy między szkiełkami. Agaroza krzepnie w postaci filmu o grubości około 0,5 - 1,0 mm w ciągu około 30 sekund.</li>
	<li>Gdy agaroza zastygnie, przytrzymaj dolny szkiełko w ręce niedominującej, a górne szkiełko w ręce dominującej. Podnieś górną prowadnicę, trzymając dolną prowadnicę stabilnie, w wyniku czego podkładka agarozowa przykleja się do jednego z dwóch slajdów.</li>
	<li>Jeśli uformowana podkładka z agarozy jest większa niż rozmiar szkiełka nakrywkowego (18 mm x 18 mm), należy przyciąć krawędzie podkładki, aby uzyskać wymagane wymiary, aby zapewnić prawidłowe ułożenie szkiełka nakrywkowego. Te płatki agarozowe są przeznaczone do natychmiastowego użycia i nie mogą być przechowywane.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo podkładkę agarozową pod kątem gładkiej powierzchni, która jest wilgotna i nadaje się do montażu. Jeśli podkładka agarozowa zostanie wystawiona na działanie powietrza i wyschnie, powierzchnia podkładki agarozowej wydaje się pomarszczona. W takim scenariuszu przygotuj świeżą podkładkę z agarozy, jak wspomniano w krokach 2-6 tej sekcji.</li>
	<li>Na podkładkę agarozową umieść 2 μl roztworu kulek polistyrenowych o stężeniu 0,1 μm jako medium montażowe.</li>
	<li>Zbierz 3-4 robaki za pomocą platynowego drucianego kilofa i przenieś je na nieobsianą płytkę NGM. Proces ten zapewnia usunięcie bakterii powierzchniowych, które utrudniają unieruchomienie podczas montażu.</li>
	<li>Gdy robaki wypełzną z ich powierzchni, podnieś je do montażu za pomocą platynowego drucianego szpikulca i ponownie zawieś w kropli kulek polistyrenowych na podkładce agarozowej.</li>
	<li>Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na robakach. Aby zapobiec patroszeniu zamontowanych ślimaków, nie przesuwaj szkiełka nakrywkowego po umieszczeniu.</li>
	<li>Zamontuj przygotowane szkiełko na mikroskopie w celu obrazowania.</li>
</ol>
3. Konfiguracja i akwizycja obrazowania
UWAGA: Komety EBP poruszają się z przybliżoną prędkością 0,22 μm/s, jak zaobserwowano w neuronach ssaków i PLM C. elegans16,18. Aby optymalnie próbkować zdarzenia w akwizycji poklatkowej zgodnie z kryteriami Nyquista28, wymagane są skale przestrzenne i czasowe odpowiednio 0,09 μm i 0,43 s. W celu zapobiegania fototoksyczności lub fotowybielaniu zastosowaliśmy akwizycję Spinning Disk. Poniżej opisaliśmy naszą konfigurację obrazowania i ustawienia akwizycji.
<ol>
	<li>Uchwyć obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w obracający się dysk i kamerę. Włącz konfigurację zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Włącz oprogramowanie, które steruje konfiguracją.</li>
	<li>Ponieważ jest to mikroskop odwrócony, umieść szkiełko z zamontowanymi robakami na stoliku z obiektywem o małym powiększeniu (5x lub 10x) z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół.</li>
	<li>Ustaw ścieżkę światła do oka lub tryb widzialny, który wykorzystuje oświetlenie z lampy halogenowej dla światła przechodzącego i lampy łukowej rtęciowej dla światła odbitego.</li>
	<li>Ustaw ostrość i wyśrodkuj robaka w polu widzenia pod jasnym polem.</li>
	<li>Nałóż olejek immersyjny i zmień powiększenie na 63x (1,4 NA/olej) i ponownie ustaw ostrość ogona robaka w jasnym polu dla neuronów PLM.</li>
	<li>Włącz fluorescencję lampy łukowej rtęciowej, aby na krótko przeogniskować neurony PLM. Umieść odpowiedni zestaw odbłyśnika (AF488) na ścieżce światła w celu wizualizacji GFP.</li>
	<li>Ustaw mikroskop na akwizycję kamery, kierując ścieżkę światła do kamery. 
	UWAGA: Sterowanie wyżej wymienionymi krokami 4-7 za pomocą ekranu tranzystora cienkowarstwowego (TFT) mikroskopu jest szybkie i zapobiega niepotrzebnemu narażeniu na oświetlenie. Alternatywnie steruj oświetleniem, odbłyśnikiem za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Po zogniskowaniu neuronu PLM w polu widzenia, w interfejsie oprogramowania wybierz oświetlenie lasera 488 nm o mocy 30% i ekspozycji 300 ms dla kamery o wartości wzmocnienia zwielokrotnienia elektronów (EM) 70. W zależności od wyrażenia reportera należy zmieniać te parametry zgodnie z wymaganiami. Zapisz ustawienia jako konfigurację dla kolejnych sesji obrazowania.</li>
	<li>Na karcie Kanały przechowywane są ścieżki, z których każda ma określone ustawienie oświetlenia i kamery. Podświetlona ścieżka umożliwia wizualizację na żywo, natomiast w celu uzyskania obrazu ścieżka musi być zaznaczona. Podświetl kanał za pomocą jasnego pola (DIC), aby na żywo wyświetlić ogon robaka w obszarze roboczym. Próbka jest zogniskowana i wyśrodkowana w oknie obrazowania na żywo w przestrzeni roboczej.</li>
	<li>Podświetl kanał za pomocą wzbudzenia laserowego 488 nm, aby szybko ustawić ostrość neuronu PLM w oknie obrazowania na żywo. Po ustawieniu fokusu rozpocznij akwizycję poklatkową, ustawiając parametry szeregów czasowych, jak wspomniano w następnym kroku.</li>
	<li>Korzystając z oświetlenia laserowego 488 nm, skonfiguruj eksperyment z szeregami czasowymi na 2 minuty i bez odstępu czasu między klatkami. Aby utrzymać skale czasowe akwizycji obrazu, uzyskaliśmy tylko fluorescencję GFP.</li>
	<li>Korzystając z karty Rozpocznij eksperyment, rozpocznij pobieranie. Użycie 63-krotnego powiększenia ogranicza rozdzielczość przestrzenną do 0,21 μm, która jest próbkowana przez kamerę przy rozmiarze piksela 0,09 μm. Uzyskaj upływ czasu z prędkością 3,3 klatki/s, aby optymalnie próbkować zdarzenie. Zdjęcie poklatkowe zawierało 396 klatek czasowych wykonanych w czasie 2 minut. Po pobraniu zapisz obraz w formacie domyślnym, do którego można później uzyskać dostęp za pomocą domyślnego oprogramowania lub ImageJ.</li>
</ol>
4. Obserwacja i analiza
<ol>
	<li>Wyświetl podgląd akwizycji poklatkowej w domyślnym oprogramowaniu lub otwórz ją w Image J za pomocą wtyczki Bioformats. 
	UWAGA: Proces analizy obrazu opisaliśmy w Obrazie J.</li>
	<li>Zainstaluj wtyczkę Bioformats w ImageJ.
	<ol>
		<li>Alternatywnie wyeksportuj plik w formacie domyślnym do .tif w celu zapewnienia zgodności plików w ImageJ. Funkcja eksportu w ZEN2 powoduje, że poszczególne klatki obrazu są osobnymi plikami .tif. Unikamy tej metody, aby zapobiec tworzeniu dużej liczby plików.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz obraz w formacie ".czi" bezpośrednio na obrazie J za pomocą wtyczki "Bioformats". Obraz zostanie otwarty jako stos wielu obrazów. Jeśli korzystasz z funkcji "eksportuj" domyślnego oprogramowania, odtwórz obrazy jako stos wielu obrazów, korzystając z następującego przepływu pracy w ImageJ: ImageJ Program > Menu obrazu > Podmenu Stosy > Obrazy do ułożenia w stos.</li>
	<li>Podgląd obrazu jako filmu można wyświetlić za pomocą ikony Odtwórz w lewym dolnym rogu okna obrazu. Komety mogą być postrzegane jako jasne, ruchome punkty w ciele komórki i procesy neuronu PLM. Jeśli komety są wyraźnie widoczne, przejdź do kroku 8, w przeciwnym razie wykonaj kroki 5-7 z tej sekcji.</li>
	<li>Przekonwertuj profil kolorów obrazu za pomocą tabeli przeglądowej (LUT) na obraz w skali szarości: program ImageJ > menu Obraz > podmenu Tabele przeglądów > Wybierz odcienie szarości.</li>
	<li>Odwróć profil LUT obrazu, aby ułatwić wizualizację: Program ImageJ > menu Obraz > podmenu Tabele przeglądowe > Odwróć LUT.</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby zobaczyć komety: Program ImageJ > menu Obraz > podmenu Dostosuj > Jasność/Kontrast.
	<ol>
		<li>Przesuń suwaki Minimum, Maksimum, Jasność i Kontrast, aby uzyskać żądane skalowanie intensywności na obrazie. Określiliśmy ilościowo obrazy z wyraźnie widocznymi kometami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podstawowa wersja ImageJ ma narzędzia startowe reprezentowane jako ikony. Zlokalizuj i kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę z linią, aby otworzyć menu rozwijane i wybierz linię podzieloną na segmenty. Narysuj linię podzieloną na segmenty w obszarach zainteresowania (ROI), które mają swój początek w ciele komórki neuronu lub w jej pobliżu.
	<ol>
		<li>Do późniejszych rozważań zapisz podzielony na segmenty zwrot z inwestycji za pomocą menedżera zwrotu z inwestycji, korzystając z następującego przepływu pracy: ImageJ > Analyze > Tools > Menedżer ROI > Wybierz narysowany ślad na obrazie i kliknij przycisk Dodaj w oknie Menedżer ROI > Więcej w oknie menedżera ROI > Zapisz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed wygenerowaniem kimografu, ponieważ skale przestrzenne i czasowe są różne, usuń skalowanie, aby uzyskać pomiary w pikselach, korzystając z następujących metod: 
	ImageJ > Analizuj > Ustaw skalę > Kliknij, aby usunąć skalę > Ok.</li>
	<li>Korzystając z funkcji Reslice w menu rozwijanym Image > Stacks (Obraz stosy), wygeneruj kimograf. Kymograf jest reprezentacją segmentowego zwrotu z inwestycji w czasie. Oś pozioma reprezentuje odległość, a oś pionowa reprezentuje czas. Ślady po przekątnej reprezentują poruszające się komety. Ogólnie rzecz biorąc, kimograf przyjmuje profil kolorów obrazu, w przeciwnym razie przypisuje profil kolorów zgodnie z opisem w poprzednich krokach 5-6 w celu wizualizacji śladów po przekątnej.</li>
	<li>Korzystając z funkcji Linia prosta w menu rozwijanym narzędzia Linia (patrz krok 9 w tej sekcji), narysuj linie proste na każdym ze śladów ukośnych i dołącz je w menedżerze ROI.</li>
	<li>Na karcie Analiza przejdź do pozycji Ustaw pomiary i wybierz parametry Średnia intensywność i Prostokąt ograniczający do pomiaru śladów.</li>
	<li>W oknie menedżera ROI kliknij przycisk Zmierz, co spowoduje otwarcie okna Wynik, w którym uzyskane zostaną średnie intensywności ROI, współrzędne X i Y śladów linii, szerokość, wysokość, kąt i długość śladów linii. To okno można zapisać w formacie .csv, a następnie zaimportować do programu do analizy danych.</li>
	<li>W programie arkusza kalkulacyjnego otwiera się okno wyników z wartościami rozłożonymi w wierszach i kolumnach. Odpowiednimi wartościami są szerokość, wysokość i kąt ścieżek. Szerokość oznacza przemieszczenie śladu, wysokość określa czas trwania, a kąt reprezentuje wektor. Ponieważ wartości szerokości i wysokości są wyrażone w pikselach, pomnóż je odpowiednio przez skale przestrzenne i czasowe, aby uzyskać standardowe mierzalne parametry.</li>
	<li>Ponieważ lewa strona kimografu jest bliższa ciału komórki, w zależności od kąta, klasyfikuj komety jako plus-koniec-koniec lub minus-koniec-koniec (tj. odpowiednio od ciała komórki lub w kierunku ciała komórki). Klasyfikuj kąty od 1° do -89° i od -91° do -179° odpowiednio jako plus-koniec-koniec i minus-koniec. Zbierz dane z wielu kimografów w arkuszu kalkulacyjnym na potrzeby badania i przedstaw je statystycznie.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zrozumienie dynamiki mikrotubul było od lat kluczowym celem w dziedzinie badań nad cytoszkieletem. Mikrotubule ulegają zarodkowaniu i katastrofie wraz z ciągłym procesem dynamicznej niestabilności 44,45,46,47. Wiele z tych informacji uzyskano za pomocą testów in vitro, takich jak odczyty rozpraszania światła wolnej i spolimeryzowanej tubuliny, testy wzrostu mikrotub...

Neurony mają skomplikowaną architekturę z wyspecjalizowanymi przedziałami, takimi jak dendryty, ciała komórkowe, aksony i synapsy. Cytoszkielet neuronalny składa się z mikrotubul, mikrofilamentów i neurofilamentów, a ich odrębna organizacja wspiera przedziały neuronalne strukturalnie i funkcjonalnie1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Z biegiem lat organizacja mikrotubul została zidentyfikowana jako kluczowy czynnik determinujący polaryzację i funkcję neuronów. Ponieważ neurony przechodzą przebudowę strukturalną podczas rozwoju lub regeneracji, dynamika i orientacja mikrotubul determinują tożsamość, spolaryzowany transport, wzrost i rozwój różnych przedziałów neuronalnych7. Dlatego konieczna jest ocena dynamiki i orientacji mikrotubul in vivo, aby skorelować z procesem przebudowy neuronów.
Mikrotubule składają się z protofilamentów α i β heterodimerów tubuliny z dynamicznymi końcami dodatnimi i względnie stabilnymi końcami ujemnymi11,12. Odkrycie kompleksu końcówki dodatniej i związanych z nim białek wiążących końce umożliwiło stworzenie platformy do oceny organizacji mikrotubul13. Białka wiążące końce (EBP) przejściowo wiążą się z rosnącymi końcami dodatnimi mikrotubuli, a ich dynamika asocjacji jest skorelowana ze wzrostem protofilamentów mikrotubul14,15. Ze względu na częste asocjacje i dysocjację kompleksu końcówki dodatniej z mikrotubulą, funkcja rozrzutu punktowego EBP oznaczonego GFP pojawia się jako "kometa" w filmie poklatkowym15,16. Od czasu pionierskiej obserwacji w neuronach ssaków16, białka wiążące końce oznaczone białkami fluorescencyjnymi są używane do określania dynamiki mikrotubul w różnych systemach modelowych i typach neuronów17,18,19,20,21,22,Lokal mieszkalny 23.
Ze względu na swój prosty układ nerwowy i przezroczyste ciało, C. elegans okazał się doskonałym modelowym systemem do badania przebudowy neuronów podczas rozwoju i regeneracji in vivo. W tym miejscu opisujemy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamiki i wzrostu mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronów dotykowych u C. elegans. Używając genetycznie kodowanego EBP-2::GFP, zobrazowaliśmy mikrotubule w neuronie PLM, co pozwoliło nam określić polaryzację mikrotubul w dwóch różnych neurytach tego neuronu24. Metoda ta pozwala na obserwację i kwantyfikację komet EBP jako miary dynamiki mikrotubul w różnych kontekstach komórkowych, na przykład lokalne zmiany w zachowaniu mikrotubul, które inicjują regenerację aksonów po aksotomii, można ocenić za pomocą naszego protokołu. Test ten można dostosować do badania regulacji dynamiki mikrotubul w różnych procesach komórkowych w różnych typach komórek i tłach genetycznych.

<table><tbody><tr><td>CZ18975 szczep robaka</td><td>Yishi Jin lab</td><td>CZ18975</td><td>Wygenerowany przez Anindya Ghosh-Roy</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Ślimaki montażowe</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm)</td><td>Zeiss</td><td>474030-9010-000</td><td>Ślimaki montażowe</td></tr><tr><td>Sucha kąpiel z blokiem grzewczym</td><td>Neolab</td><td></td><td>Ślimaki montażowe</td></tr><tr><td>Prowadnice szklane (35 mm x 25 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Ślimaki montażowe</td></tr><tr><td>Roztwór kulek polistyrenowych (4,55 x 10^13 cząstek/ml w środowisku wodnym z minimalną ilością środka powierzchniowo czynnego)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876</td><td>Ślimaki montażowe</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td><td>Ślimaki montażowe</td></tr><tr><td>Szczep bakteryjny OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>Obsługa robaków</td></tr><tr><td>60mm płytki Petriego</td><td>Praveen Scientific</td><td>20440</td><td>Obsługa robaków</td></tr><tr><td>Aspirator/kapilara</td><td>VWR</td><td>53432-921</td><td>Inkubator do obsługi robaków</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MIR554E</td><td>Obsługa ślimaków</td></tr><tr>Drut <td></td><td></td><td>platynowy</td><td>Obsługa ślimaków</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z przystawką fluorescencyjną</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>Obsługa robaków</td></tr><tr><td>0,3% Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>0,25% Pepton</td><td>T M Media</td><td>1506</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>10 mg / ml Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>1mM Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>1mM Siedmiowodny siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>2% Agar</td><td>T M Pożywka</td><td>1202</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>25mM Monozasadowy diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>Pożywka dla nicieni</td></tr><tr><td>0,1 M Monozasadowy diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>1X Bufor</td></tr><tr><td>M9 0,04 M Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>1X M9 bufor</td></tr><tr><td>0,1 M Chlorek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>21405</td><td>1X M9 bufor</td></tr><tr><td>0,2M dwuzasadowy wodorofosforan disodowy siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>1X Bufor M9</td></tr><tr><td>Butelki szklane</td><td>Borosil</td><td></td><td>Przechowywanie buforowe</td></tr><tr><td>Laser 488 nm</td><td>Obiektyw Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>5X</td><td>Obiektyw Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>63X</td> Aparat <td>do obrazowania</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fotometria</td><td>Evolve 512 Delta</td><td></td></tr><tr><td>Imaging System komputerowy do jednostki Spinning Disk</td><td>HP</td><td>Intel &reg; Xeon CPU E5-2623 Obrazowanie 3,00 GHz</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Lampa halogenowa</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Lampa łukowa rtęci</td><td>Obrazowanie Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirująca jednostka dyskowa</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>ZEN2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>J (Fidżi Wersja)</td><td></td><td></td><td>Analiza i przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>Adobe Creative Cloud</td><td>Adobe</td><td></td><td>Analiza i przetwarzanie obrazów</td></tr><tr><td>System komputerowy do analizy obrazu</td><td>Dell</td><td>Intel &reg; Rdzeń i handel; Procesor i7-9700 3,00 GHz</td><td>Przetwarzanie/reprezentacja obrazu</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach caenorhabditis elegans

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

W neuronach orientacja mikrotubul była kluczowym czynnikiem do identyfikacji aksonów, które mają mikrotubule na końcu plusa i dendryty, które zazwyczaj mają orientację mieszaną. W tym miejscu opisujemy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamiki i wzrostu mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronów dotykowych u C. elegans. Używając genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów końcówek mikrotubul, zobrazowaliśmy mikrotubule aksonalne. Lokalne zmiany w zachowaniu mikrotubul, które inicjują regenerację aksonów po aksotomii, można określić ilościowo za pomocą tego protokołu. Test ten można dostosować do innych neuronów i tła genetycznego w celu zbadania regulacji dynamiki mikrotubul w różnych procesach komórkowych.

Jako reprezentatywny przykład opisaliśmy obserwacje in vivo komet EBP w aksonach w stanie stacjonarnym oraz regenerujących się neuronów PLM. Neurony PLM znajdują się w regionie ogona nicienia, posiadając długi wypust przedni, który tworzy synapsę, oraz krótki wypust tylny. Neurony PLM rosną w kierunku przednio-tylnym w pobliżu nabłonka i odpowiadają za odczuwanie lekkiego dotyku u nicieni. Ze względu na uproszczoną strukturę oraz podatność na obrazowanie i mikrochirurgię, neurony PLM były szeroko badane pod kątem cytoszk...

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Celem tej procedury jest ocena organizacji i dynamiki mikrotubul in vivo. Neurony to spolaryzowane komórki z wyraźnymi przedziałami aksonalnymi, dendrytycznymi i synaptycznymi, utrzymywanymi przez leżący pod nimi cytoszkielet. Mikrotubule stanowią większość cytoszkieletu neuronalnego, a dynamika i orientacja determinują kluczowe zdarzenia podczas rozwoju i dojrzewania neuronów.Mikrotubule składają się z heterodimerów alfa i beta tubuliny i są z natury spolaryzowane z wysoce dynamicznymi końcami dodatnimi i stabilnymi końcami ujemnymi. Podczas polimeryzacji na końcach dodatnich wielocząsteczkowy kompleks białek wiążących końce przejściowo łączy się z protofilamentami i sprzyja składaniu dimerów tubuliny. Ta technika pomoże nam uwidocznić mikrotubule neuronalne in vivo.Za pomocą tej techniki można określić orientację i inne parametry dynamicznych mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronu C.elegans. Zwykle używamy tego reportera do wizualizacji dynamiki mikrotubul w neuronach czuciowych. Można jednak wyrazić ten reporter w innych typach komórek, takich jak mięśnie i skóra, aby uwidocznić dynamiczne mikrotubule w tych komórkach.Znakowane fluorescencyjnie białka wiążące końce, ta

in-vivo-assessment-microtubule-dynamics-orientation-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę obrazowania dynamiki mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans za pomocą fluorescencyjnie znakowanego białka EBP. Technika ta umożliwia analizę orientacji i zachowania mikrotubul podczas rozwoju i regeneracji neuronów.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów