Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Procedura opisuje przygotowanie złota koloidalnego i montaż pasków immunochromatograficznych. Po pierwsze, kwas chloroaurowy i cytrynian sodu wykorzystano do syntezy złota koloidalnego. Cytrynian sodu dodawano do roztworu kwasu chloroaurowego i gotowano w celu uzyskania złota koloidalnego o odpowiedniej wielkości cząstek.

Synteza, koniugat przeciwciała koloidalnego złota. Po odwirowaniu cząstki złota koloidalnego rozpuszczono w odpowiednim roztworze, a następnie ponownie zawieszono w celu otrzymania koloidalnego roztworu złota. Zanurz membranę z włókna szklanego w koniugacji, aby przygotować podkładkę sprzężoną.

Upuść sztuczny antygen i przeciwciała drugorzędowe na błonę NC jako linię T i linię C. Przymocuj odpowiednio membranę NC, membranę chłonną, podkładkę na próbkę i membranę z włókna szklanego do płyty PVC. Pokrój zmontowaną tekturę na pasek o szerokości 3,5 milimetra.

Skonfekcjonuj odpowiednio pełny procent roztworu kwasu chlorku złota i 1% roztworu cytrynianu sodu. Włączyć mieszadło magnetyczne i umieścić kolbę na mieszalniku. Dodaj 120 mililitrów wody destylowanej do kolby okrągłodennej i podgrzej ją do wrzenia na termostatycznym mieszadle magnetycznym.

Gotuj dalej i szybko dodaj 0,5 mililitra pełnego procentu kwasu chloroaurowego i pięć mililitrów 1% cytrynianu sodu. Kontynuuj podgrzewanie przez pięć do 10 minut. Obserwuj, jak kolor roztworu zmienia się z bladożółtego na winnoczerwony.

Wyłącz zasilanie termostatycznego miksera magnetycznego, ostudź do temperatury pokojowej i umieść mieszaninę w czystej butelce. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nanocząstki złota wykazują efekt Tyndalla.

Wielkość i morfologię nanocząstek złota określono za pomocą spektroskopii ultrafioletowej i obrazowania pod użyciem transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu do ośmiu probówek. Dostosuj roztwory złota koloidalnego do pH od 5 do 12, używając 0,1 mola na litr węglanu potasu.

Dodaj 100 mikrolitrów koloidalnego roztworu złota do ośmiu probówek zawierających chlorek sodu. Odstaw na post kilka minut po zmiksowaniu. Obserwuj zmianę koloru każdego roztworu z probówki i zapisuj probówkę, która pozostaje czerwona.

Wybierz wartość pH z najmniejszą ilością dodanego węglanu potasu i stabilnym kolorem roztworu jako optymalną wartość pH do przygotowania koniugatu. Zastosowano to samo podejście. Zaobserwowałem zmianę koloru i zapisz rurkę, która pozostaje czerwona.

Jako optymalną ilość mAB należy wybrać ilość przeciwciała o najniższym stężeniu mAB i stabilnym kolorze roztworu. Weź 10 mililitrów roztworu złota koloidalnego i użyj 0,1 mola na litr węglanu potasu, aby dostosować roztwór do optymalnej wartości pH. Powoli dodawać mAB SSd o odpowiednim stężeniu i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Odwirować mieszaninę przy 2000 obr./min przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć osad zawierający zanieczyszczenia wytrąconego złota koloidalnego. Odwirować mieszaninę przy 10 000 obr./min przez 40 minut.

Odrzucić supernatant. Osadem jest koniugat mAB ze złota koloidalnego. Dodać kwas solny Tris, BSA, Tween 20 i PEG 20 000, a następnie dobrze wymieszać, aby przygotować bufor do ponownego zawieszenia.

Dodać bufor do reprodukcji i oddzielić osad. Pasek materiału membrany, w tym membrana z celulozy szklanej, membrana poliestrowo-celulozowa i płyta PCV. Materiał membrany, należy śledzić i oceniać za pomocą sterylnego mikroskopu, aby pozbyć się niejednorodności.

Najpierw umieść membranę NC na płycie PCV dwa centymetry od krawędzi końca sekcji płyty. Po drugie, upuść dwa miligramy na mililitr SSd-BSA na membranę NC na dwa centymetry od górnej krawędzi jako linię testową i upuść 1,5 miligrama na mililitr złota anty-mysiego IgG na membranę NC na dwa centymetry od dolnej krawędzi jako linię kontrolną. Przymocuj wkładkę chłonną do arkusza PVC nad membraną NC i zastąp na membranę NC na dwa milimetry.

Przytnij membranę z włókna szklanego do pięciu centymetrów długości i dwóch centymetrów szerokości i użyj jako podkładki sprzężonej. Zanurz membranę z włókna szklanego w sprzężonym roztworze mAB z nanocząstkami złota. Moczyć przez chwilę, aby nanocząstki złota wchłonęły mAB.

Wysuszyć szeroką membranę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni. Wklej wstępnie obrobioną podkładkę sprzężoną pod membranę NC, a długość nakładania się z membraną NC powinna wynosić 0,1 centymetra. Przytnij membranę Fusion3 do 1,8 centymetra długości i 3,5 centymetra szerokości i użyj jako podkładki na próbkę.

Następnie umieść podkładkę na próbkę na płycie PCV i załóż na nią podkładkę sprzężoną na dwa milimetry. Pokrój, złóż tekturę w paski o szerokości 3,5 milimetra za pomocą maszyny do cięcia i zagęść za pomocą systemu laminowania wsadowego. Na koniec umieść paski testowe w skorupie.

Zamknij je w torbie z folii aluminiowej zawierającej środek osuszający i przechowuj z dala od światła. ICS jest teraz zmontowany. Upuść 50 mikrolitrów roztworu próbki na otwór próbki, aby obserwować proces chromatografii.

Następnie przeanalizuj paski za pomocą przenośnego czytnika pasków. Maszyna może zapewnić stosunek linii testowej do linii kontrolnej. Oceń swoistość, czułość, powtarzalność i stabilność testu ICS.

Odczytano przygotowane roztwory złota koloidalnego. Analizy transmisyjnego mikroskopu elektronowego wykazały, że cząstki miały kształt wielościenny i były równomiernie rozmieszczone o średniej średnicy 14 nanometrów. Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości wykazały ciągły wzór prążków w odstępach 0,117 nanometra nanocząstek złota.

Absorpcja w ultrafiolecie w świetle widzialnym wskazuje, że różne rozmiary cząstek złota koloidalnego można uzyskać poprzez zmianę proporcji cytrynianu sodu i kwasu chloroaurowego. W eksperymencie ilościowym paski z wynikami testu saikosaponiny D zeskanowano za pomocą przenośnego czytnika ICS. Obliczyliśmy krzywą standardową, odnosząc niestężenia saikosaponiny D do odpowiadającej im absorpcji przy każdym stężeniu.

Po przeprowadzeniu badań metodologicznych metoda może być stosowana do ilościowego i półjakościowego wykrywania związków małocząsteczkowych. Procedura ta obejmuje przygotowanie złota koloidalnego, syntezę nanocząstek złota, koniugat mAB, montaż paska oraz badanie metodologiczne. Praca ta dostarcza szczegółowego protokołu opracowania paska immunochromatograficznego do zastosowania w szybkim i ilościowym wykrywaniu małych cząsteczek.

Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak przygotować pasek immunochromatograficzny. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.