Name: Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę syntezy koloidalnego złota i montażu pasków immunochromatograficznych do szybkiej diagnostyki. Protokół obejmuje przygotowanie nanocząstek, konjugację z przeciwciałami i złożenie paska testowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Specjalne Fundusze na Fundusze Badań Podstawowych instytucji szkolnictwa wyższego powiązanych z centralnymi departamentami. Dziękujemy za wsparcie Zespołu Badań Podstawowych Klasycznej Recepty Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie.

Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki na Pekińskim Uniwersytecie Medycyny Chińskiej (numer zatwierdzenia 2017BZYYL00120).
1. Przygotowanie i charakterystyka złota koloidalnego
UWAGA: Do syntezy złota koloidalnego, ponieważ złoto koloidalne łatwo adsorbuje się na wewnętrznej ściance naczynia i jest podatne na wytrącanie się zanieczyszczeń, naczynie do syntezy i przechowywania złota koloidalnego powinno być dokładnie oczyszczone i namoczone w kwasie (40 ml wody destylowanej, 360 ml stężonego kwasu siarkowego, 20 g dwuchromianu potasu) lub poddane obróbce pasywacji powierzchniowej. Do syntezy złota koloidalnego zastosowano metodę redukcji kwasem cytrynowym.
<ol>
	<li>Włączyć mieszadło magnetyczne i umieścić kolbę (250 ml) na mieszalniku.</li>
	<li>Przygotować odpowiednio 4% roztwór kwasu chlorku złota i 1% roztwór cytrynianu sodu.</li>
	<li>Dodać 120 ml wody destylowanej do kolby okrągłodennej i podgrzać do wrzenia na termostatycznym mieszadle magnetycznym.</li>
	<li>Gotuj dalej i szybko dodaj 0,5 ml 4% kwasu chloroaurowego i 5 ml 1% cytrynianu sodu.</li>
	<li>Obserwuj kolor roztworu. Bladożółty roztwór kwasu chloroaurowego zmienia kolor wina na czerwony w ciągu kilku minut.</li>
	<li>Kontynuuj podgrzewanie przez 10 minut, aż roztwór zmieni się z bezbarwnego na przezroczysty kolor wina czerwonego.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie termostatycznego miksera magnetycznego, ostudź do temperatury pokojowej i przenieś mieszaninę do czystej butelki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Określ rozmiar i morfologię AuNP za pomocą spektroskopii ultrafioletowej i obrazowania TEM. 
	UWAGA: Różne rozmiary cząstek złota koloidalnego do różnych zastosowań można uzyskać, zmieniając proporcje cytrynianu sodu i kwasu chloroaurowego.</li>
</ol>
2. Synteza koniugatu AuNPs-mAb
UWAGA: Ponieważ przeciwciała wiążą się ze złotem koloidalnym poprzez adsorpcję elektrostatyczną, ładunki na powierzchni białek i złoto koloidalne bezpośrednio wpływają na intensywność wiązania; dlatego wartość pH buforu jest ważnym czynnikiem wpływającym na stabilność koniugatu przeciwciało-złoto koloidalne. Dyski mAb SSD i anty-SSD są używane jako przykłady w tym protokole.
<ol>
	<li>Ocena pH sprzężenia
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu NaCl (10% m/v) do ośmiu probówek.</li>
		<li>Roztwory AuNP należy dostosować przy pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12 za pomocą 0,1 M K2CO3 .</li>
		<li>Dodać 100 μl koloidalnego roztworu złota (pH dostosowane do 5-12) do ośmiu probówek zawierających NaCl.</li>
		<li>Po zmiksowaniu odstaw roztwory na kilka minut. Obserwuj zmianę koloru każdego roztworu probówki i zapisz probówkę, która pozostaje czerwona.</li>
		<li>Wybierz wartość pH z najmniejszym dodatkiemK2CO3 i stabilnym kolorem roztworu jako optymalną wartość pH do przygotowania koniugatów AuNP-mAb. 
		UWAGA: Nie używaj pH-metru, ponieważ sonda może zostać zniszczona przez AuNPs.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena ilości przeciwciał
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu NaCl (10% m/v) do ośmiu probówek.</li>
		<li>Do każdej probówki dodać 100 μl roztworu złota koloidalnego o optymalnym pH.</li>
		<li>Dodać roztwory przeciwciał monoklonalnych (stężenie białka 0,1 mg/ml-3,2 mg/ml) do wyżej wymienionych ośmiu probówek.</li>
		<li>Po zmiksowaniu odstaw roztwory na kilka minut. Obserwuj zmianę koloru każdego roztworu probówki i zapisz probówkę, która pozostaje czerwona.</li>
		<li>Jako optymalną ilość mAb do przygotowania koniugatów AuNP-mAb należy wybrać ilość przeciwciała o najniższym stężeniu mAb i stabilnym kolorze roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do sporządzania zawiesiny: dodać 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 i 1% (v/v) PEG 20000 i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Synteza koniugatu AuNP-mAb
	<ol>
		<li>Weź 10 ml roztworu złota koloidalnego i użyj 0,1 M K2CO3 w celu dostosowania roztworu do optymalnej wartości pH.</li>
		<li>Powoli dodawaj mAb SSD w odpowiednich stężeniach i wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 83 x g (1 000 obr./min) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć osad zawierający zanieczyszczenia lub wytrącone złoto koloidalne.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 8,330 x g (10 000 obr./min) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a osadem jest koloidalny koniugat złoto-mAb.</li>
		<li>Dodać bufor do ponownego zawieszenia, aby oddzielić opady.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montaż listwy
UWAGA: W przypadku późniejszych testów immunologicznych przepływu, wybór i wstępna obróbka materiału membranowego będą miały bezpośredni wpływ na test, który powinien zostać zbadany. Pasek immunochromatograficzny składa się z podkładki na próbkę, podkładki sprzężonej, membrany nitrocelulozowej (NC), podkładki chłonnej i płyty PCV (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Materiał membrany powinien zostać sprawdzony i oceniony za pomocą stereomikroskopii w celu wyeliminowania niejednorodności.
<ol>
	<li>Membranę NC należy przykleić na płycie PCV w odległości 2 cm od krawędzi końcówki ssącej płyty.</li>
	<li>Dodawać SSD-BSA (2 mg/ml) kroplami do membrany NC (w odległości 2 cm od górnej krawędzi) jako linię testową (o szerokości 1 mm) i dodawać kroplami kozią anty-mysią IgG (1,5 mg/ml) na membranę NC (w odległości 2 cm od dolnej krawędzi) jako linię kontrolną (o szerokości 1 mm). Kontroluj ilość dodawanego białka.</li>
	<li>Przymocuj wkład chłonny do arkusza PVC nad membraną NC i załóż go na membranę NC na 2 mm.</li>
	<li>Zanurz membranę z włókna szklanego w sprzężonym roztworze AuNPs-mAb. Wysuszyć mokrą membranę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przytnij membranę z włókna szklanego do 5 cm długości i 2 cm szerokości i użyj jej jako podkładki sprzężonej.</li>
	<li>Wklej wstępnie obrobioną podkładkę sprzężoną pod membranę NC. Długość zakładki z membraną NC powinna wynosić 0,1 cm. 
	UWAGA: Membrana z włókna szklanego ma silną zdolność wiązania i uwalniania białek.</li>
	<li>Przytnij membranę Fusion 3 do 1,8 cm długości i 3,5 cm szerokości i użyj jej jako podkładki na próbkę.</li>
	<li>Wklej podkładkę próbki na płytę PCV i nałóż ją na końcówkę sprzężoną na 2 mm.</li>
	<li>Pokrój zmontowaną tekturę na paski o szerokości 3,5 mm za pomocą maszyny do cięcia i zagęść ją za pomocą systemu laminowania wsadowego.</li>
	<li>Na koniec umieść paski testowe w skorupie, zamknij je w torbie z folii aluminiowej zawierającej środek osuszający i przechowuj z dala od światła. Systemy ICS są teraz zmontowane. 
	UWAGA: Powyższe jest procedurą laboratoryjną. W produkcji sprzęt do natryskiwania złota i instrumenty z membraną krzyżową są używane do natryskiwania złota i wykonywania linii T i C.</li>
</ol>
4. Detekcja ilościowa
<ol>
	<li>Upuść 50 μl roztworu próbki na otwór próbki, aby obserwować proces chromatografii. 
	UWAGA: W wyniku działania kapilarnego napędzanego przez wkładkę chłonną, roztwór próbki migruje na drugi koniec paska. Gdy roztwór próbki dotrze do podkładki sprzężonej, SSD (antygen) w próbce reaguje z AuNPs-mAb wstępnie załadowanym na elektrodę. Gdy roztwór migruje i dociera do linii T, AuNPs-mAb bez SSD może być selektywnie wychwytywany przez SSD-BSA (koniugat białka antygen-nośnik), widoczny jako czerwony kolor na linii T. Następnie roztwór migruje do linii C, gdzie AuNPs-mAb są wychwytywane przez kozie anty-mysie IgG w regionie, pokazując się w ten sposób jako czerwony kolor na linii C.</li>
	<li>Przeanalizuj paski za pomocą przenośnego czytnika pasków. Maszyna może zapewnić stosunek linii testowej do linii kontrolnej (T / C).</li>
	<li>Oceń specyficzność, czułość, powtarzalność i stabilność testu ICS. 
	UWAGA: W przypadku wykrywania jakościowego jedna czerwona linia oznacza wynik pozytywny (linia kontrolna). Dwie czerwone linie oznaczają wynik ujemny (linie testowe i kontrolne). Jeśli przewód kontrolny nie jest obecny, test uważa się za nieważny.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-based+lateral+flow+immunochromatographic+strip+with+nanoparticles+as+reporters+for+detection%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).</li>
<li>Chang, H. -F., Wang, J. -Q., Wang, B., Deng, A. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune+chromatographic+assay+for+rapid+and+simultaneous+detection+of+levonorgestrel+and+methylprednisolone+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples.</a> Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).</li>
<li>Lai, J. J., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lateral-flow+immunoassay+%28LFIA%29+diagnostics+via+biomarker+enrichment+for+mHealth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth.</a> Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).</li>
<li>Zhang, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal+gold-based+lateral-flow+immunoassay+for+the+rapid+simultaneous+detection+of+clenbuterol+and+ractopamine+in+swine+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).</li>
<li>Kranthi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal-gold+based+lateral-flow+immunoassay+kit+for+%27quality-control%27+assessment+of+pyrethroid+and+endosulfan+formulations+in+a+novel+single+strip+format%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format.</a> Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).</li>
<li>Qian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immunochromatographic+strip+for+rapid+detection+of+capsid+protein+antigen+p27+of+avian+leukosis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus.</a> Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).</li>
<li>Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , US20040184954A1 (2003).</li>
<li>Miočević, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Lateral+Flow+Assays+for+Salivary+Biomarker+Assessment%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review.</a> Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).</li>
<li>Lisa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+based+dipstick+immunoassay+for+the+rapid+detection+of+dichlorodiphenyltrichloroethane%3A+an+organochlorine+pesticide%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibody-Europium+Conjugate-Based+Lateral+Flow+Time-Resolved+Fluoroimmunoassay+for+Quantitative+Determination+of+T-2+Toxin+in+Cereals+and+Feed%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed.</a> Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+synthesis+of+high-quality+CuInZnxS2%2Bx+core%2Fshell+nanocrystals+and+their+application+for+detection+of+C-reactive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein.</a> Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+double+antibody+sandwich-lateral+flow+immunoassay+for+the+rapid+and+simple+detection+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+immunochromatography+test+strip+for+rapid%2C+quantitative+and+sensitive+detection+of+alpha+fetoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein.</a> Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145(2011).</li>
<li>Song, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescent+lateral-flow+immunoassay+for+hepatitis+B+virus+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping.</a> Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+GsRerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Clinical+Application+of+a+Rapid+IgM-IgG+Combined+Antibody+Test+for+SARS-CoV-2+Infection+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).</li>
<li>Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+application+value+analysis+of+the+2019-coronary+virus+disease+was+analyzed+by+the+whole+blood+Sars-COV+2+specific+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Science+Edition%22%5BJournal%5D)">The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection.</a> Natural Science Edition. 42, (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Monoclonal+Antibodies+Against+Natural+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products.</a> Journal of Visualized Experiments. , e57116(2019).</li>
<li>Sai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+and+Immunoaffinity+Column+Chromatography+for+Saikosaponin+d+Using+an+Anti-Saikosaponin+d+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody.</a> Planta Medica. 82, 432-439 (2016).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Sensitive+Immunochromatographic+Strip+Test+for+Rapid+and+Quantitative+Detection+of+Saikosaponin+d%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d.</a> Molecules. 23 (2), 338(2018).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+Puerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przygotowania mAb przeciwko małym cząsteczkom pochodzącym z naturalnych produktów. Przedstawiono podstawowe kroki i kwestie wymagające uwagi w procedurze, a także wykazaliśmy użyteczność tego protokołu na przykładzie małocząsteczkowego dysku SSD. Przykładowe widma, obrazy TEM, wyniki ilościowe i badania metodologiczne przedstawiono w reprezentatywnych danych. W związku z tym wykazaliśmy, że przedstawiona tutaj produkcja złota koloidalnego, koniugacja AuNP-mAb i strategia składani...

Membranowe paski immunochromatograficzne do przepływu bocznego (ICS) są użytecznymi narzędziami do taniego i szybkiego wykrywania. Membrana nitrocelulozowa jako nośnik oraz koloidalne złoto jako markery w szybkich odczynnikach diagnostycznych do immunochromatografii stanowią najczęściej stosowaną metodę POCT (diagnostyki w punkcie opieki), a zakres zastosowań tego projektu jest szeroki. Od pierwotnego zastosowania w monitorowaniu ciąży, ich użycie rozszerzyło się na monitorowanie stanu krzepnięcia krwi1,2, uszkodzeń mięśnia sercowego3, medycynę weterynaryjną4, pozostałości pestycydów5, choroby zakaźne6 oraz stężenia leków. Można oceniać więcej rodzajów próbek, w tym mocz, ślinę, krew pełną, surowicę i inne płyny ustrojowe7,8,9.
W ostatnich latach opracowano wiele nowych testów do wykrywania biomarkerów w diagnostyce schorzeń, w tym HPLC, UPLC, LC-MS oraz ELISA, które charakteryzują się wysoką czułością, dokładnością, wiarygodnością i specyficznością. Metody te wymagają jednak zaawansowanej aparatury, złożonego przygotowania próbek oraz czasochłonnych procedur9. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania szybszej i wygodniejszej strategii diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care) do samodzielnego wykrywania związków aktywnych leczniczo w czasie rzeczywistym10,11.
Popularność testów immunochromatograficznych (ICS), zwłaszcza w przypadku powszechnych analiz, wynika z łatwości ich stosowania, ponieważ nie wymagają one personelu specjalistycznego ani rozbudowanej aparatury pomiarowej12. Innymi słowy, osoby bez specjalistycznego przeszkolenia mogą obsługiwać paski testowe lub wykonywać autotesty13. Wyniki testu można uzyskać w ciągu 5 minut, co umożliwia ich wykorzystanie podczas inspekcji w terenie14. Ponadto, według naszych obliczeń, koszt pasków może być niższy niż 1 RMB15, co oznacza, że testy te są niedrogie w implementacji16. Zatem ICS jest stosunkowo dokładnym, prostym i tanim urządzeniem jednorazowym. Testy ICS oparte na złocie koloidalnym17,18 są również stosowane w szybkiej detekcji COVID-19.
Zasadę działania ICS można podzielić na ICS w układzie kanapkowym oraz ICS konkurencyjny. Rycina 1A przedstawia schemat ICS w układzie kanapkowym, który jest stosowany głównie do wykrywania substancji makromolekularnych, takich jak białka, w tym markerów nowotworowych, czynników zapalnych oraz gonadotropiny kosmórkowej człowieka (HCG, antygen wczesnej ciąży). W tej metodzie wykorzystuje się pary przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom antygenu, przy czym przeciwciało wychwytujące jest osuszone na membranie NC w formie linii testowej. Przeciwciało znakowane jest osuszone na podkładce sprzęgającej, a przeciwciało wtórne służy jako linia kontrolna.
Rysunek 1B przedstawia schemat konkurencyjnego ICS, który jest stosowany głównie do wykrywania substancji małocząsteczkowych (MWCO &lt; 2000 Da). Antygen powlekający jest unieruchomiony na membranie NC w formie linii testowej, a znakowane przeciwciało jest wysuszone na podkładce sprzęgającej. Podczas detekcji próbka oraz znakowane przeciwciało przepływają przez linię detekcyjną pod wpływem sił kapilarnych, a powlekany antygen konkurencyjnie wiąże wolny antygen w próbce, co prowadzi do wybarwienia linii detekcyjnej na czerwono.
Niedawno opisaliśmy procedurę generowania przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym19. W niniejszej pracy opracowaliśmy nowatorski test immunochromatograficzny z przepływem bocznym oparty na przygotowanym przeciwciału monoklonalnym anty-SSD20, przeznaczony do szybkiego wykrywania w miejscu badania. Wyniki wskazują, że test immunochromatograficzny jest niezbędnym i wygodnym narzędziem do wykrywania związków pochodzących z produktów naturalnych.
<img alt="Schemat testu przepływu bocznego z mAb-znacznikiem i mAb wychwytującym; proces wiązania antygen-przeciwciało." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62754/62754fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Schematyczny rysunek analizy immunochromatograficznej (A) Paski testowe do immunochromatografii typu kanapkowego. (B) Paski testowe do pośredniej konkurencyjnej immunochromatografii. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang et al., 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62754/62754fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Roztwór kwasu chloroaurowego (HAuCl4)</td><td>Fabryka odczynników chemicznych Tianjin Fu Chen</td><td>JY-SJ102</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td> Probówka wirówkowa <td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td></td><td></td> Probówka wirówkowa Corning 430645 <td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td></td><td></td> Płytki ELISA Corning 430828<td></td></tr><tr><td>, 96 dołków</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Sinopharm</td><td>H5072</td><td></td></tr><tr><td>Membrany z włókna szklanego</td><td>Jieyi</td><td>XQ-Y6</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-myszy IgG</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>Membrany nitrocelulozowe</td><td>Millipore</td><td>millipore 180</td><td></td></tr><tr><td>albumina jaja kurzego</td><td>Pekin BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG20000</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta RNBC6325 10 ml</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 25 ml</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>półsztywne arkusze PVC</td><td>Jieyi</td><td>JY-C104</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Beijing Chemical Works</td><td>C1034</td><td></td></tr><tr><td>periodynian sodu</td><td>Sinopharm</td><td>Chemical BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Niemcy</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Solarbio</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Paski immunochromatograficzne (ICS) oparte na przepływie bocznym oparte na membranie są użytecznymi narzędziami do taniej autodiagnozy i zostały skutecznie zastosowane do wykrywania toksyn, indeksu fizjologicznego i biomarkerów klinicznych. W tym protokole przedstawiamy szczegółowy opis kroków prowadzących do opracowania szybkiego, czułego i ilościowego testu immunologicznego przepływu bocznego (przy użyciu AuNP jako markera i mAb jako sondy). Procedura opisuje przygotowanie i charakterystykę złota koloidalnego, syntezę koniugatu AuNP-mAb, montaż paska immunochromatograficznego oraz badanie metodologiczne testu. Wyniki pokazały, że końcowe paski mogą być dalej wykorzystywane do szybkiej i wygodnej autodiagnozy małej cząsteczki, co może stanowić alternatywne narzędzie w szybkiej i precyzyjnej analizie wskaźników fizjologicznych i biologicznych.

Charakteryzacja złota koloidalnego 
Przygotowane roztwory złota koloidalnego miały barwę czerwono-bursztynową. Analizy TEM wykorzystano do określenia morfologii i kształtu AuNP.Rycina 2A-D). Rycina 2A i Rycina 2B ujawniają, że cząstki mają kształt wielościanu i są równomiernie rozmieszczone. Średnia średnica AuNPs wynosiła około 14 nm (Rycina 2C). Przedstawiono obraz...

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Procedura opisuje przygotowanie złota koloidalnego i montaż pasków immunochromatograficznych. Po pierwsze, kwas chloroaurowy i cytrynian sodu wykorzystano do syntezy złota koloidalnego. Cytrynian sodu dodawano do roztworu kwasu chloroaurowego i gotowano w celu uzyskania złota koloidalnego o odpowiedniej wielkości cząstek.Synteza, koniugat przeciwciała koloidalnego złota. Po odwirowaniu cząstki złota koloidalnego rozpuszczono w odpowiednim roztworze, a następnie ponownie zawieszono w celu otrzymania koloidalnego roztworu złota. Zanurz membranę z włókna szklanego w koniugacji, aby przygotować podkładkę sprzężoną.Upuść sztuczny antygen i przeciwciała drugorzędowe na błonę NC jako linię T i linię C. Przymocuj odpowiednio membranę NC, membranę chłonną, podkładkę na próbkę i membranę z włókna szklanego do płyty PVC. Pokrój zmontowaną tekturę na pasek o szerokości 3,5 milimetra.Skonfekcjonuj odpowiednio pełny procent roztworu kwasu chlorku złota i 1% roztworu cytrynianu sodu. Włączyć mieszadło magnetyczne i umieścić kolbę na mieszalniku. Dodaj 120 mililitrów wody destylowanej do kolby okrągłodennej i podgrzej ją do wrzenia na termostatycznym mieszadle magnetycznym.Gotuj dalej i szybko dodaj 0,5 mililitra pełnego procentu kwasu chloroaurowego i pięć mililitrów 1% cytrynianu sodu. Kontynuuj podgrzewanie przez pięć do 10 minut. Obserwuj, jak kolor roztworu zmienia się z bladożółtego na winnoczerwony.Wyłącz zasilanie termostatycznego miksera magnetycznego, ostudź do temperatury pokojowej i umieść mieszaninę w czystej butelce. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nanocząstki złota wykazują efekt Tyndalla.Wielkość i morfologię nanocząstek złota określono za pomocą spektroskopii ultrafioletowej i obrazowania pod użyciem transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu do ośmiu probówek. Dostosuj roztwory złota koloidalnego do pH od 5 do 12, używając 0,1 mola na litr węglanu potasu.Dodaj 100 mikrolitrów koloidalnego roztworu złota do ośmiu probówek zawierających chlorek sodu. Odstaw na post kilka minut po zmiksowaniu. Obserwuj zmianę koloru każdego roztworu z probówki i zapisuj probówkę, która pozostaje czerwona.Wybierz wartość pH z najmniejszą ilością dodanego węglanu potasu i stabilnym kolorem roztworu jako optymalną wartość pH do przygotowania koniugatu. Zastosowano to samo podejście. Zaobserwowałem zmianę koloru i zapisz rurkę, która pozostaje czerwona.Jako optymalną ilość mAB należy wybrać ilość przeciwciała o najniższym stężeniu mAB i stabilnym kolorze roztworu. Weź 10 mililitrów roztworu złota koloidalnego i użyj 0,1 mola na litr węglanu potasu, aby dostosować roztwór do optymalnej wartości pH. Powoli dodawać mAB SSd o odpowiednim stężeniu i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Odwirować mieszaninę przy 2000 obr./min przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć osad zawierający zanieczyszczenia wytrąconego złota koloidalnego. Odwirować mieszaninę przy 10 000 obr./min przez 40 minut.Odrzucić supernatant. Osadem jest koniugat mAB ze złota koloidalnego. Dodać kwas solny Tris, BSA, Tween 20 i PEG 20 000, a następnie dobrze wymieszać, aby przygotować bufor do ponownego zawieszenia.Dodać bufor do reprodukcji i oddzielić osad. Pasek materiału membrany, w tym membrana z celulozy szklanej, membrana poliestrowo-celulozowa i płyta PCV. Materiał membrany, należy śledzić i oceniać za pomocą sterylnego mikroskopu, aby pozbyć się niejednorodności.Najpierw umieść membranę NC na płycie PCV dwa centymetry od krawędzi końca sekcji płyty. Po drugie, upuść dwa miligramy na mililitr SSd-BSA na membranę NC na dwa centymetry od górnej krawędzi jako linię testową i upuść 1,5 miligrama na mililitr złota anty-mysiego IgG na membranę NC na dwa centymetry od dolnej krawędzi jako linię kontrolną. Przymocuj wkładkę chłonną do arkusza PVC nad membraną NC i zastąp na membranę NC na dwa milimetry.Przytnij membranę z włókna szklanego do pięciu centymetrów długości i dwóch centymetrów szerokości i użyj jako podkładki sprzężonej. Zanurz membranę z włókna szklanego w sprzężonym roztworze mAB z nanocząstkami złota. Moczyć przez chwilę, aby nanocząstki złota wchłonęły mAB.Wysuszyć szeroką membranę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni. Wklej wstępnie obrobioną podkładkę sprzężoną pod membranę NC, a długość nakładania się z membraną NC powinna wynosić 0,1 centymetra. Przytnij membranę Fusion3 do 1,8 centymetra długości i 3,5 centymetra szerokości i użyj jako podkładki na próbkę.Następnie umieść podkładkę na próbkę na płycie PCV i załóż na nią podkładkę sprzężoną na dwa milimetry. Pokrój, złóż tekturę w paski o szerokości 3,5 milimetra za pomocą maszyny do cięcia i zagęść za pomocą systemu laminowania wsadowego. Na koniec umieść paski testowe w skorupie.Zamknij je w torbie z folii aluminiowej zawierającej środek osuszający i przechowuj z dala od światła. ICS jest teraz zmontowany. Upuść 50 mikrolitrów roztworu próbki na otwór próbki, aby obserwować proces chromatografii.Następnie przeanalizuj paski za pomocą przenośnego czytnika pasków. Maszyna może zapewnić stosunek linii testowej do linii kontrolnej. Oceń swoistość, czułość, powtarzalność i stabilność testu ICS.Odczytano przygotowane roztwory złota koloidalnego. Analizy transmisyjnego mikroskopu elektronowego wykazały, że cząstki miały kształt wielościenny i były równomiernie rozmieszczone o średniej średnicy 14 nanometrów. Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości wykazały ciągły wzór prążków w odstępach 0,117 nanometra nanocząstek złota.Absorpcja w ultrafiolecie w świetle widzialnym wskazuje, że różne rozmiary cząstek złota koloidalnego można uzyskać poprzez zmianę proporcji cytrynianu sodu i kwasu chloroaurowego. W eksperymencie ilościowym paski z wynikami testu saikosaponiny D zeskanowano za pomocą przenośnego czytnika ICS. Obliczyliśmy krzywą standardową, odnosząc niestężenia saikosaponiny D do odpowiadającej im absorpcji przy każdym stężeniu.Po przeprowadzeniu badań metodologicznych metoda może być stosowana do ilościowego i półjakościowego wykrywania związków małocząsteczkowych. Procedura ta obejmuje przygotowanie złota koloidalnego, syntezę nanocząstek złota, koniugat mAB, montaż paska oraz badanie metodologiczne. Praca ta dostarcza szczegółowego protokołu opracowania paska immunochromatograficznego do zastosowania w szybkim i ilościowym wykrywaniu małych cząsteczek.Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak przygotować pasek immunochromatograficzny. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

development-lateral-flow-immunochromatographic-strip-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Aby zbadać proste metody produkcji dla wielu potrzeb testowych, stworzyliśmy system kanałów absorbujących płyny wykonany z materiału bawełnianego. Urządzenie to zostało wykorzystane do stworzenia platformy wielokrotnego wykrywania i rozwiązania problemów związanych z zanieczyszczeniem, które często dotykają urządzenia biomedyczne oparte na przepływie bocznym, do klinicznej analizy moczu azotynów, białka całkowitego i urobilinogenu.

Wytwarzanie urządzeń analitycznych do bawełny

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Wychodząc naprzeciw pilnym potrzebom diagnostycznym dengi, przedstawiamy zintegrowane z aplikacją na smartfony papierowe urządzenie analityczne Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) do ilościowego określania stężenia antygenu dengi NS1 w próbkach klinicznych surowicy/krwi. Ta innowacja usprawnia zarządzanie dengą, wspomagając podejmowanie decyzji klinicznych w różnych placówkach opieki zdrowotnej, nawet tych o ograniczonych zasobach.

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Poznaj metodę syntezy koloidalnego złota i montażu pasków immunochromatograficznych do szybkiej diagnostyki. Protokół obejmuje przygotowanie nanocząstek, konjugację z przeciwciałami i złożenie paska testowego.

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Przeglądaj więcej filmów