Name: Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj budowę mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo w mózgu myszy i fretki. Ta metoda zapewnia stabilne, biokompatybilne rejestracje aktywności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Gregowi Guitchountsowi za wskazówki dotyczące projektowania i budowy elektrod oraz Timowi Gardnerowi za udostępnienie nam swojego laboratorium i obiektów. Chcielibyśmy podziękować Christosowi Michasowi za jego pomoc w wykorzystaniu PDS w głównym ośrodku Bio-Interface and Technology oraz Neilowi Ritterowi, Jonowi Spyreasowi i Davidowi Landesmanowi za ich pomoc w projektowaniu wczesnych wersji 16-kanałowego jig. Chcielibyśmy podziękować Timowi Cavanaughowi za jego pomoc w obrazowaniu SEM w Center for Harvard Nanoscale Systems na Harvardzie.

<ol><li>Galvani, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalvani%2C+L+%22De+viribus+electricitatis+in+motu+musculari+commentarius%22">De viribus electricitatis in motu musculari commentarius</a>. , Academy of Sciences. Bologna. (1791).</li>
<li>Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+correspondence+of+electrical+and+optical+physiology+in+in+vivo+population-scale+two-photon+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging.</a> bioRxiv. , 800102(2019).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+MEMS+and+microsystem+tools+for+brain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+and+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research.</a> Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066(2017).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo%3A+watching+the+brain+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Hong, G., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+electrode+technologies+for+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel electrode technologies for neural recordings.</a> Nature reviews. Neuroscience. 20 (6), 330-345 (2019).</li>
<li>Chung, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density%2C+long-lasting%2C+and+multi-region+electrophysiological+recordings+using+polymer+electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">High-density, long-lasting, and multi-region electrophysiological recordings using polymer electrode arrays.</a> Neuron. 101 (1), 21-31 (2019).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li>
<li>Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tissue+responses+to+neural+implants+impact+signal+sensitivity+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li>
<li>Kozai, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).</li>
<li>Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+recording+and+modulation+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Neural recording and modulation technologies.</a> Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093(2017).</li>
<li>Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+interfaces+for+intracortical+recording%3A+requirements%2C+fabrication+methods%2C+and+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, 665(2017).</li>
<li>Subbaroyan, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+finite-element+model+of+the+mechanical+effects+of+implantable+microelectrodes+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 103-113 (2005).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optogenetics+with+multifunctional+flexible+polymer+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers.</a> Nature Neuroscience. 20 (4), 612-619 (2017).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+composite+with+carbon+nanofibers+aligned+during+thermal+drawing+as+a+microelectrode+for+chronic+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Polymer composite with carbon nanofibers aligned during thermal drawing as a microelectrode for chronic neural interfaces.</a> ACS Nano. 11 (7), 6574-6585 (2017).</li>
<li>Armstrong-James, M., Millar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+fibre+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Carbon fibre microelectrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 1 (3), 279-287 (1979).</li>
<li>Garris, P. A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux+of+dopamine+from+the+synaptic+cleft+in+the+nucleus+accumbens+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain.</a> Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).</li>
<li>Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carbon-fiber+electrode+array+for+long-term+neural+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording.</a> Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016(2013).</li>
<li>Guitchounts, G., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64-channel+carbon+fiber+electrode+arrays+for+chronic+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">64-channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3830(2020).</li>
<li>Ma, Z., Turrigiano, G. G., Wessel, R., Hengen, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+dynamics+are+homeostatically+tuned+to+criticality+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit dynamics are homeostatically tuned to criticality in vivo.</a> Neuron. 104 (4), 655-664 (2019).</li>
<li>Popovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cross-orientation+suppression+and+size+tuning+and+the+role+of+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cross-orientation suppression and size tuning and the role of experience.</a> Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 38 (11), 2656-2670 (2018).</li>
<li>Patel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+stability+assessment+of+carbon+fiber+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays.</a> Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002(2016).</li>
<li>Welle, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-small+carbon+fiber+electrode+recording+site+optimization+and+improved+in+vivo+chronic+recording+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037(2020).</li>
<li>Patel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+linear+8.4+%C2%B5m+diameter+16+channel+carbon+fiber+electrode+arrays+for+single+unit+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Insertion of linear 8.4 µm diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings.</a> Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009(2015).</li>
<li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators.+A%2C+Physical%22%5BJournal%5D)">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).</li>
<li>Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-plated+electrode+with+high+scratch+strength+for+electrophysiological+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2985(2019).</li>
<li>Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-machine+interfaces%3A+From+basic+science+to+neuroprostheses+and+neurorehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak finansowego konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje każdy krok niezbędny do skonstruowania funkcjonalnego CFEA zarówno do stosowania ostrego, jak i przewlekłego. Opisany proces można dostosować do potrzeb badacza, co czyni go dostępną i niedrogą opcją monitorowania pojedynczych neuronów przez miesiące. Protokół demonstruje wykonalność rejestrowania zarówno silnej aktywności pojedynczej jednostki w ciągu kilku minut od implantacji u znieczulonego zwierzęcia, jak i przez cztery miesiące u przytomnego, zachowującego się zwierzęcia, ilustrując potencjał tych CFEA do badania krótko- i długoterminowych zmian w odpowiedziach neuronalnych.
Kroki opisanego protokołu zostały dokładnie przetestowane i ulepszone z biegiem czasu, aby uzyskać wydajną procedurę, którą można szybko wykonać, przy niskim koszcie krańcowym (100,00 < USD), z możliwością rejestrowania jednoznacznych pojedynczych jednostek, gęsto i stabilnie przez miesiące. Etapy budowy mogą zostać ukończone w czasie krótszym niż jeden dzień i będą wytwarzać sygnały elektrofizjologiczne, które są porównywalne z każdą wiodącą komercyjną matrycą. CFEA mają również znacznie mniejszą powierzchnię (16-kanałowa wiązka włókien ma średnicę ~26 μm) niż podobne komercyjne matryce, a ich biokompatybilność sprawia, że nadają się do długotrwałego użytkowania13. Co ważne, istnieje kilka krytycznych kroków i instrukcji, których należy przestrzegać, aby uzyskać działający CFEA o porównywalnej wydajności.
Ze względu na kruchość włókien węglowych należy obchodzić się z nimi z najwyższą ostrożnością. Obchodzenie się z nimi ostrymi kleszczami lub innymi narzędziami może spowodować pęknięcie włókien. Dodatkowo ważne jest, aby konstruować CFEA w przestrzeni o ograniczonym ruchu powietrza, aby włókna nie zostały zdmuchnięte. Podczas spalania tylnej części włókien, zapalniczkę wystarczy przesunąć ruchem w przód iw tył bardzo krótko, przez około 1 s. Kroki następujące po usunięciu izolacji mają kluczowe znaczenie dla budowy elektrody z kanałami roboczymi. Płomieniowane końcówki należy wprowadzać do przyrządu bez dodatkowego kontaktu. Następnie, podczas napełniania umywalki cementem dentystycznym, ważne jest, aby cement został starannie nałożony i całkowicie wypełnił kanały i umywalkę lejka, zamykając otwory bez ich wypełniania. Przed przystąpieniem do dalszych czynności cement dentystyczny należy całkowicie utwardzić światłem UV. Po zakończeniu srebrną farbę należy wstrzyknąć do każdego kanału, aż do całkowitego wypełnienia, ale nie rozlewania się. Jest to najbardziej zmienny krok w procesie. Każde przepełnienie może spowodować przesłuchy między kanałami, a niewystarczające wypełnienie może spowodować awarię połączenia. Jeśli nie można wstrzyknąć srebrnej farby za pomocą igły 25 G, prawdopodobnie roztwór jest zbyt lepki i w takim przypadku można dodać niewielką ilość rozcieńczalnika do farby, aby uzyskać bardziej płynny roztwór. Po wypełnieniu wszystkich kanałów i włożeniu złącza headstage, ważne jest, aby umożliwić utwardzenie matrycy przez 24 godziny przed zabezpieczeniem złącza cementem dentystycznym. Okazało się, że niezastosowanie się do tego zmniejszyło liczbę podłączonych kanałów. Zastosowanie dużej ilości cementu dentystycznego jest również ważne, aby złącze nie rozłączyło się podczas łączenia z systemem akwizycji sygnału. W przypadku ich odłączenia możliwa jest próba ponownego połączenia z wielokrotnym wypełnieniem kanałów srebrną farbą, ale użytkownik powinien przetestować wartości impedancji CFEA, aby ocenić liczbę podłączonych kanałów. Pozostawienie cementu dentystycznego do utwardzenia przez noc służy również zapobieganiu potencjalnemu oderwaniu.
Pomiar impedancji elektrody zapewni dokładne oszacowanie podłączonych kanałów. Można to zrobić po zanurzeniu przewodów uziemiających i odniesienia oraz końcówek z włókna węglowego w PBS. Zaobserwowaliśmy, że wysoka impedancja (>15 MΩ) wskazuje na otwarty, niepodłączony kanał. Przed wstrzyknięciem prądu i galwanotechniką podłączony kanał może mieć szereg wartości impedancji, które powinny znacznie się zmniejszyć w tym procesie. Średnia liczba podłączonych kanałów (impedancja < 4 MΩ po wstrzyknięciu prądu) przypadająca na elektrodę 16-kanałową wynosiła 12,96 ± 2,74 (średnia ± SD; N = 48 elektrod). Przetestowano szereg czasów galwanizacji, a 30 s zapewniło lepszą izolację sygnału między miejscami nagrywania (ilustracja 5). Chociaż powszechnie wiadomo, że PEDOT-pTS 12,24,25,26 i PEDOT-TFB 21 zapewniają niezawodne opcje przygotowania miejsc zapisu z włókna węglowego, stwierdziliśmy, że powlekanie złotem jest sprawdzoną i niezawodną metodą galwanizacji elektrod do przewlekłej implantacji 27,28, zwiększyło łatwość implantacji i zapobiegło zbijaniu się końcówek elektrod. Uzyskując końcowe wartości impedancji poniżej średnio poniżej 0,2 MΩ, metoda ta okazuje się porównywalna z wartościami uzyskanymi przy użyciu PEDOT-TFB21 i PEDOT-pTS26.
Podczas wszczepiania układu mikroelektrod ważne jest, aby wizualnie śledzić wkładanie końcówek z włókna węglowego pod mikroskopem. Pomyślne włożenie powinno być widoczne, bez zginania włókien. Jeśli włókna wydają się wyginać, jest mało prawdopodobne, że uda im się dostać do mózgu. W takim przypadku kąt sondy należy wyregulować do drugiej próby. Ten proces może być kontynuowany, dopóki włożenie sondy nie powiedzie się. Gdy elektroda znajdzie się na żądanej głębokości, stwierdziliśmy, że odczekanie co najmniej 30 minut pozwoli sondzie ustabilizować się w optymalnym pozyskiwaniu sygnału (ostre nagrania).
Opisywane CFEA, oprócz niewielkich rozmiarów i biokompatybilności, stanowią solidną, konfigurowalną alternatywę dla komercyjnych macierzy ze względu na ich łatwość budowy i niski koszt. Największym ograniczeniem dla CFEA wyszczególnionych w tym protokole jest ich skalowalność. Ze względu na ręczny charakter ich budowy, skalowanie do projektów z setkami miejsc nagrywania może nie być praktyczne. Ponadto postępy w wytwarzaniu matryc mikroelektrod z wykorzystaniem nanotechnologii umożliwią rejestrację populacji na większą skalę niż metody opisane tutaj. Jednak protokół ten zapewnia CFEA dostęp do laboratoriów zainteresowanych produkcją elektrod z włókna węglowego na stołach. Nie zaobserwowaliśmy utraty stabilności ani zmniejszonej odporności amplitudy skoków w czasie trwania 120-dniowych przewlekłych eksperymentów, na co wskazuje reprezentatywny pojedynczy kanał typowy dla naszych obserwacji w tej skali czasowej (Rysunek 6A-E). Dodatkowo, CFEA wykazują zdolność do trwałej aktywności pojedynczej jednostki, ponieważ cztery pojedyncze jednostki pozostały rozpoznawalne 11 miesięcy po implantacji u myszy (Figura 6G, H). Możliwe jest również uzyskanie stabilnych, jednojednostkowych zapisów (ryc. 7), co daje przewagę nad wieloma innymi komercyjnymi elektrodami do badania pojedynczych neuronów w krótkich okresach czasu. W przyszłości opracowanie takich elastycznych, biokompatybilnych sond o minimalnych średnicach umożliwi badanie złożonych procesów. Narzędzia te zapewnią znaczną użyteczność w rozwoju technologii neuronowej, w tym zastosowań w interfejsach mózg-maszyna (BMI), które wymagają ciągłej, długoterminowej stabilności29.

Elektrody i tablice elektrod są cennymi narzędziami do zrozumienia, jak mózg przetwarza informacje na poziomie neuronalnym. Chociaż zapisy elektrofizjologiczne są osiągalne od ponad dwóch stuleci1, nadal nie jest możliwe jednoczesne mierzenie aktywności całych obwodów neuronalnych w rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia impulsów pojedynczych neuronów. Chociaż metody nieinwazyjne, takie jak elektroencefalografia2, topografia emisji pozytonów3 i funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego4 pozwalają na pomiary całego mózgu, nie są w stanie osiągnąć rozdzielczości przestrzennej i czasowej niezbędnej do rozdzielenia aktywności obwodów neuronalnych2,5. W przeciwieństwie do tego, metody obrazowania, takie jak obrazowanie optyczne przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie lub genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, mogą osiągnąć jednojednostkową rozdzielczość przestrzenną, ale stwarzają problemy, takie jak niska rozdzielczość czasowa i słaba selektywność3,4,5,6. Nagrania elektryczne są potężną alternatywą dla tych metod. Elektrody rejestrujące zapewniają niezrównaną rozdzielczość czasową i pozwalają użytkownikowi na wykonywanie pomiarów z precyzją w czasie skoku w dowolnym obszarze mózgu7. Dodatkowo, chronicznie wszczepione matryce wieloelektrodowe (MEA) umożliwiają rejestrację na dużą skalę (dziesiątki do setek komórek) pojedynczych komórek u zachowujących się zwierząt w okresie od dni do miesięcy8,9. Jednak sondy krzemowe, które rejestrują przy większej gęstości, mają duży ślad węglowy i są wysoce inwazyjne, a przewlekle wszczepione matryce często generują reakcję zapalną, enkapsulację tkanek i śmierć neuronów10,11,12,13.
Ograniczenia istniejących elektrod zaowocowały ostatnimi innowacjami, które pozwalają na stabilne, długotrwałe nagrania w wysokiej rozdzielczości. Typowe elektrody składają się z metalowego przewodnika, takiego jak wolfram lub platyno-iryd, lub są na bazie krzemu lub polimeru. Podczas gdy matryce mikrodrutowe na bazie metalu mogą utrzymywać długotrwałe, stabilne zapisy, mają znacznie większą powierzchnię, a średnica pojedynczego przewodu waha się od 10 do 200 μm14. W przeciwieństwie do tego, matryce elektrod na bazie krzemu dają nagrania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale ze względu na ich stosunkowo sztywną konstrukcję zazwyczaj nie są w stanie utrzymać sygnału i zapisu z tych samych neuronów przez wiele miesięcy15. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie matryc opartych na krzemie zaowocowały elektrodami, które mogą niezawodnie wykonywać przewlekłe zapisy, ale te matryce nie mogą być używane do nagrywania z głębokich obszarów mózgu u większych zwierząt i są przeznaczone do zapisów liniowych9. Postępy w dziedzinie matryc polimerowych zaowocowały zwiększoną elastycznością i stabilnością zapisu pojedynczych jednostek i oferują potencjał do nagrywania o dużej gęstości w najbliższej przyszłości, ale obecnie z ograniczoną dostępnością8,16,17. Włókna węglowe pozwalają na nagrania o dużej gęstości z gotowych materiałów, które są tutaj opisane.
Mikroelektrody rejestrujące z włókna węglowego są używane od dziesięcioleci, a pierwsze elektrody z włókna węglowego składają się z pojedynczego włókna węglowego umieszczonego w szklanej mikropipecie. Mikroelektrody te były używane do jednojednostkowych nagrań zewnątrzkomórkowych i chociaż stosunek sygnału do szumu był porównywalny z najlepszymi mikroelektrodami wolframowymi w szkle, były one korzystne ze względu na ich elastyczność, niższe wartości impedancji i prostotę produkcji18,19. Wysiłki zmierzające do opracowania układów elektrod z włókna węglowego przyspieszyły ostatnio ze względu na możliwości biodetekcji włókien węglowych. Oprócz zwiększonej biokompatybilności i wyjątkowej przewodności elektrycznej, charakteryzują się unikalnym zestawem właściwości, w tym odpornością na wysoką temperaturę, niską gęstością względną, wysoką wytrzymałością na rozciąganie, niską sztywnością na zginanie, wysoką czułością wykrywania i małym polem przekroju poprzecznego10,12. Wszystkie te właściwości zmotywowały do opracowania układów mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA), które ułatwiają przewlekłe, stabilne i wysokowydajne zapisy pojedynczych neuronów. Takie CFEA mogą być teraz wytwarzane ręcznie20,21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), co daje układy mikroelektrod, które mogą przechowywać pojedyncze neurony przez wiele miesięcy. Opisano tutaj dostępny proces budowy CFEA, który został zaadaptowany na dwa sposoby do ostrych i przewlekłych zapisów pojedynczych neuronów u dwóch gatunków.

<table><tbody><tr><td>#10 ostrze skalpela</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-15</td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>16-kanałowe CFEA Jig Realize</td><td>Inc.</td><td></td><td>Komponent CFMA</td></tr><tr><td>16-kanałowe złącze Omnetics</td><td>Omnetics</td><td>A79014-001</td><td>Komponent CFMA</td></tr><tr><td>Igła 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-84</td><td>Narzędzie budowlane -</td></tr><tr><td>igła 30 G</td> z ostrym końcem <td>Fisher Scientific</td><td>14-841-03</td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>31 G Rura okrągła podskórna 304 ze stali nierdzewnej Small</td><td>Parts Inc</td><td>B000FMYN38</td><td>Do rury prowadzącej</td></tr><tr><td>32-kanałowy przyrząd CFEA</td><td>Realize Inc.</td><td></td><td>Komponent CFMA</td></tr><tr><td>32-kanałowe złącze Omnetics</td><td>Omnetics</td><td>A79022-001</td><td>Komponent CFMA</td></tr><tr><td>6 w aplikatorach z końcówką bawełnianą</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-156</td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>Narzędzie do budowania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do drukowania 3D AutoCad Autodesk</td><td></td><td></td><td>Narzędzie do projektowania wspomaganego komputerowo / oprogramowanie do modelowania 3D</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Narzędzie do projektowania wspomaganego komputerowo / oprogramowanie do modelowania 3D</td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki BD</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Włókna węglowe</td><td>Good Fellow USA</td><td>C 005725</td><td>7 &mu; </td></tr><tr><td>m Kasety i uchwyt</td><td></td><td></td> kasety o rozmiarze epoksydowym <td>Do powlekania włókien</td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma</td><td>Scotch</td><td></td><td>Do powlekania surowych włókien</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td>dejonizowana Komponent galwaniczny</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td></td><td>Do powlekania surowych włókien</td></tr><tr><td>Płynny kompozyt dentystyczny</td><td>Pentron</td><td>Flow-It ALC</td><td>Komponent CFMA / UV utwardzony cement dentystyczny</td></tr><tr><td>Roztwór do złocenia</td><td>Sifco ASC</td><td>5355</td><td>10,0-20,0% glicerol, 1,0-5,0% etylenodiaminy, 1,0-5,0% kwasu octowego (etylenodinitrylo)tetra-, sól dipotasowa kwasu octowego, 5,0-10,0% kwasu butanowego, sól sodowa merkapto-monozłota(1+), 1,0&ndash; 5,0% pirosiarczynu potasu, 55,0-82,0% wody</td></tr><tr><td>Zacisk jubilerski</td><td>Amazon</td><td>B00GRABH9K</td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do sortowania kolców</td><td>JRClust</td><td></td><td></td> Ferret</tr><tr><td>Zapalniczka</td><td>BIC</td><td>LCP62DC</td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PS-7000C</td><td>Do rurki prowadzącej</td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td>Narzędzie do budowania</td></tr><tr><td>MountainSort</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do sortowania kolców myszy</td></tr><tr><td>NanoZ 16-kanałowy adapter</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>ADPT-nanoZ-NN-16</td><td>Komponent galwaniczny</td></tr><tr><td>NanoZ 32-kanałowy adapter NanoZ</td><td>Biała materia</td><td>NZA-OMN-32 rev</td><td>A Komponent galwaniczny</td></tr><tr><td>Wieloelektrodowy tester impedancji NanoZ</td><td>Istota</td><td></td> biała <td>Komponent</td></tr> <tr><td>galwanicznyParafilm</td><td>Fisher Stockroom</td><td>13-374-10</td><td>Półprzezroczysta, elastyczna folia o właściwościach adhezyjnych</td></tr><tr><td>Parylene 'C'</td><td>Dimer Specialty Coating Systems</td><td>980130-C-01LBE</td><td>Do powlekania włókien surowych</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>25322-68-3</td><td>Komponent galwaniczny</td></tr><tr><td>Sól</td><td></td><td></td> fizjologiczna buforowana fosforanami <td>Komponent</td></tr> <tr><td>galwanicznyRurka poliimidowa</td><td>MicroLumen</td><td>BRAUNI001</td><td>Do rurki prowadzącej</td></tr><tr><td>Narzędzie obrotowe</td><td>Dremel</td><td>300124</td><td>Do rurki prowadzącej</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>10003-12</td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>Srebrna powłoka przewodząca</td><td>MG Chemicals</td><td>842AR Komponent Super Shield</td><td>CFMA</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy o zasięgu 6,7:1</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Budynek narzędzie</td></tr><tr><td>Karteczki samoprzylepne</td><td>Narzędzie do budowania</td><td>karteczek samoprzylepnych</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki higieniczne</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>budowlane Drut wolframowy</td><td>Systemy AM</td><td>797550</td><td>Składnik CFMA</td></tr><tr><td>Różdżka do utwardzania UV</td><td>Dzięcioł</td><td></td><td>Narzędzie budowlane</td></tr><tr><td>Komora do osadzania próżniowego</td><td>Specjalistyczne systemy</td><td></td> powlekania <td>Labcoter 2 (PDS 2010)</td></tr></tbody></table>

budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Wielokanałowe układy elektrod oferują wgląd w działający mózg i służą do wyjaśnienia procesów neuronowych na poziomie pojedynczej komórki i obwodu. Rozwój tych narzędzi ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia złożonych zachowań i funkcji poznawczych oraz dla rozwoju zastosowań klinicznych. Wyzwaniem pozostaje jednak dendencyjne gęste pobieranie danych z populacji komórek w sposób stabilny i ciągły przez długi czas. Wiele popularnych elektrod, takich jak tetrody i matryce krzemowe, ma duże średnice poprzeczne, które powodują uszkodzenia po wprowadzeniu i wywołują przewlekłe reaktywne reakcje tkanek związane ze śmiercią neuronów, utrudniając rejestrację stabilnej, ciągłej aktywności neuronalnej. Ponadto większość wiązek przewodów wykazuje duże odstępy między kanałami, co wyklucza jednoczesne nagrywanie z dużej liczby komórek zgrupowanych na małym obszarze. Układy mikroelektrod z włókna węglowego opisane w tym protokole oferują przystępne rozwiązanie tych problemów. Badanie dostarcza szczegółowej metody wytwarzania układów mikroelektrod z włókna węglowego, które mogą być używane zarówno do ostrych, jak i przewlekłych zapisów in vivo. Właściwości fizyczne tych elektrod sprawiają, że idealnie nadają się one do stabilnych i ciągłych długoterminowych zapisów przy dużej gęstości komórek, umożliwiając badaczowi dokonywanie solidnych, jednoznacznych nagrań z pojedynczych jednostek przez wiele miesięcy.

Po zakończeniu tego protokołu możliwe będzie stabilne rejestrowanie aktywności pojedynczych jednostek (single-unit spiking activity). Macierze tych mikroelektrod mogą być dostosowywane pod względem materiału, liczby kanałów oraz adaptera głowicy (headstage) w zależności od potrzeb badacza. Pozłacanie włókien skutkuje obniżeniem impedancji do poziomu odpowiedniego dla rejestracji (Rycina 4 i Rycina 5). W przypadku planowania rejestracji chronicznej pomiary można wykonać po powrocie zwierzęcia do sprawności po zabiegu chirurgicznym. Procedury chroniczne pozwoliły na uzyskanie stabilnych rejestracji pojedynczych jednostek przez co najmniej 120 dni. Reprezentatywny zapis przedstawiono na Rycynie 6, która ilustruje stabilną aktywność elektrofizjologiczną z 64 kanałów w korze retrosplenialnej dorosłego samca myszy w warunkach swobodnego zachowania. W przypadku preparacji ostrej rejestrację można rozpocząć krótko po implantacji (~30 min). Pozwoli to elektrodzie na ustabilizowanie się w mózgu. Rycina 7 przedstawia reprezentatywny przykład ostrej rejestracji CFEA z 16 kanałów, uzyskanej z pierwotnej kory wzrokowej dorosłej samicy fretki. Sortowanie impulsów (spike sorting) u myszy i fretki przeprowadzono za pomocą oprogramowania do sortowania impulsów (patrz Tabela materiałów).
<img alt="Schemat konstrukcji złącza lejkowego z wymiarami; zawiera widoki przekroju poprzecznego i opisane elementy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Budowa 16- i 32-kanałowych macierzy mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA). (A) Schematy 32-kanałowej (góra) i 16-kanałowej (dół) CFEA widziane z trzech różnych perspektyw. 16-kanałowa CFEA posiada wydłużoną konstrukcję ułatwiającą manipulację. Konstrukcja 32-kanałowa posiada płaską powierzchnię, która pozwala na połączenie dwóch szablonów w celu stworzenia 64-kanałowej CFEA. Oba schematy zawierają opisane struktury z wymiarami. Koniec złącza wskazuje miejsce wkładania złącza, a kanały GND/REF wskazują miejsce wkładania przewodu uziemiającego. Zagłębienie lejka odnosi się do miejsca, przez które przechodzą włókna w celu ich pokrycia utwardzalnym światłem UV cementem stomatologicznym, a czubek lejka oznacza miejsce, w którym włókna opuszczają szablon. Czubek lejka jest podzielony na ćwiartki, aby zminimalizować sklejanie się włókien i ryzyko ich uszkodzenia. Włókna są następnie ściągane w jeden pęczek przy użyciu cementu stomatologicznego. Szablony są drukowane w 3D przy użyciu drukarek żywicznych SLA. Schematy zostały powiększone, aby ukazać szczegóły. (B) Zbudowana CFEA. Schemat zawiera opisane struktury. Niebieski koniec pęczka reprezentuje segment włókien węglowych służący do pomiarów rejestracyjnych. Szary kolor wewnątrz zagłębienia lejka i wokół złącza oznacza utwardzalny światłem UV cement stomatologiczny, który utrzymuje włókna węglowe na miejscu w zagłębieniu lejka i mocuje złącze do szablonu. Fioletowy przewód reprezentuje przewód uziemiający. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat konstrukcji kanału mikrofluidycznego; konfiguracja urządzenia z wieloma warstwami do analizy płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ładowanie surowych włókien węglowych do kaset w celu powlekania parylenem C. (A) Włókna węglowe są umieszczane w kasetach pokrytych dwoma paskami dwustronnej taśmy (kolor niebieski). Do każdej kasety ładuje się ok. 25 włókien. (B) Kasety są umieszczane w wycinanym laserowo uchwycie (kolor szary) w przygotowaniu do powlekania parylenem C. Każdy uchwyt mieści dziesięć kaset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces montażu światłowodów; diagram krok po kroku; cięcie, nawlekanie, usuwanie izolacji, lutowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat konstrukcji wiązki macierzy mikrolektrod z włókna węglowego (CFEA). (A) 16 pojedynczych, powlekanych włókien węglowych (czarne) zostaje nawleczonych przez 32-kanałowy szablon wydrukowany w technologii 3D (szary). (B) Końcówki włókien węglowych są przycinane mikronożyczkami, pozostawiając nadmiar włókna równy wysokości podstawy szablonu, wystający poza podstawę szablonu. (C) Standardowa plastikowa zapalniczka krzesiwowa jest szybko przesuwana nad nadmiar włókien w celu usunięcia izolacji z parylenu C. Schemat w prawym górnym rogu przedstawia usunięcie parylenu z 9 z 12 włókien. (D) Włókna są ponownie wkładane do szablonu, aż koniec włókna zrówna się z podstawą. Schemat w prawym górnym rogu pokazuje ponowne włożenie 9 włókien z nieizolowanymi (szarymi) końcówkami znajdującymi się wewnątrz podstawy szablonu. Następnie szablon zostaje odwrócony, a kroki A-D są powtarzane, aby nawlec przeciwległe 16 kanałów. (E) Szablon jest wypełniany cementem dentystycznym w celu unieruchomienia włókien. Srebrna farba przewodząca jest wtryskiwana do każdego otworu w podstawie szablonu. (F) Wtyk męski jest wkładany do podstawy szablonu. (G) CFEA i skalpel są mrożone w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Końcówka macierzy jest przycinana do pożądanej długości, pozostawiając 32 równe włókna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu powlekania elektrod, obraz SEM, wykres danych impedancyjnych; analiza elektrochemiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obróbka końcówek i galwanizacja. (A) Końcówki elektrod są najpierw umieszczane w 0.1 M PBS, gdzie przez każdą elektrodę przepuszczany jest prąd. Następnie końcówki są płukane i przenoszone do roztworu do złocenia, gdzie poddawane są galwanizacji prądowej. (B) Obrazy SEM przygotowanego włókna węglowego pokazują koncentrację powłoki złotej na końcówce. Pasek skali reprezentuje 4 µm. (C) Wartości impedancji z 168 kanałów po początkowym cięciu (kolor fioletowy; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ, mediana ± SE, n = 168 włókien), wtryskiwaniu prądu dodatniego (kolor różowy; 1.23 MΩ ± 0.36 MΩ, mediana ± SE, n = 168 włókien) oraz galwanizacji (kolor pomarańczowy; 0.19 MΩ ± 0.15 MΩ, mediana ± SE, n = 168 włókien) wykazują spadek wartości impedancji po każdym etapie obróbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy SEM struktur porowatych pokazujące szczegóły w mikroskali do analizy inżynierii materiałowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Umiarkowany czas galwanizacji złotem prowadzi do powstania małych, zaokrąglonych osadów na końcówkach wiązek włókien węglowych. Przedstawione końcówki włókien węglowych pochodzą z różnych macierzy mikroelektrod, co odzwierciedla różne czasy wstrzykiwania prądu w celu redukcji impedancji lub złocenia. Obrazy przedstawiają dodatkowo powłokę z parylenu C, która izoluje włókna węglowe i zapobiega rejestracji sygnału z miejsca innego niż końcówki włókien. (A) Obraz z rozpylnego mikroskopu elektronowego (SEM) końcówek włókien węglowych po zamrożeniu i wykonaniu pojedynczego cięcia żyletką. Paski skali reprezentują 10 µm. (B) Analogicznie jak w A, ale z następującym wstrzyknięciem prądu dodatniego przez 10 s. (C) Analogicznie jak w B, ale następnie złocone galwanicznie przez 5 s. (D) Analogicznie jak w B, ale następnie złocone galwanicznie przez 15 s. (E) Analogicznie jak w B, ale następnie złocone galwanicznie przez 30 s. (F) Analogicznie jak w B, ale następnie złocone galwanicznie przez 120 s. Stwierdzono, że galwanizacja przez 30 s przy prądzie -0,05 µA była optymalna dla rejestracji elektrofizjologicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy rejestracji sygnałów neuronalnych i wykres słupkowy z gryzonia z implantem; analiza elektrofizjologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przewlekłe rejestracje zewnątrzkomórkowe w korze retrosplenialnej myszy w stanie swobodnego zachowania z użyciem macierzy mikroelektrod z włókna węglowego wykazują trwałą, stabilną aktywność neuronalną. (A) Jednocześnie zarejestrowano jedenaście przebiegów napięcia przepuszczonych przez filtr pasmowy. Kolejne przebiegi zarejestrowane z pierwszego kanału (górny rząd) przedstawiono w B, aby wykazać trwałość w czasie. Pozostałe dziesięć rzędów demonstruje spójność jakości rejestracji i wykazuje silną aktywność w całej macierzy. Pasek skali po lewej stronie każdego przebiegu reprezentuje potencjał 200 µV. (B) Dane z filtrem pasmowym z tego samego włókna co w górnym przebiegu w A, powiększone, aby pokazać silną aktywność podczas ciągłej rejestracji trwającej 120 dni. (C) Klasteryzacja ujawnia stabilną detekcję pojedynczych jednostek przez wiele miesięcy. Przebiegi reprezentują średni kształt fali reprezentatywnej pojedynczej jednostki obserwowalnej w sposób ciągły przez 120 dni, wyodrębnione z włókna przedstawionego w B w każdym punkcie czasowym. (D) Średnie, nienormalizowane kształty fal impulsów z C ułożone jeden nad drugim, aby zademonstrować spójność w czasie. (E) Rejestracje z włókien węglowych wykazują stabilny poziom szumu przez wiele miesięcy. Odchylenie standardowe poziomu szumu (przebieg minus aktywność impulsowa) w B nie wykazuje progresywnej zmiany szumu. Słupki reprezentują średnie zanieczyszczenie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (F) Schemat myszy z przewlekle implantowaną CFEA i wzmacniaczem przedwzmacniaczowym (headstage). (G) Surowy przebieg napięcia (góra) 11 miesięcy po implantacji wykazuje silne LFP. Przebieg napięcia z filtrem pasmowym (dół) wykazuje stałą aktywność neuronalną. (H) Średni kształt fali impulsu neuronu zarejestrowanego na włóknie z C, z nałożonymi pierwszymi 1 000 wystąpieniami aktywności impulsowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza sygnałów neuronalnych; diagramy przebiegów fal; dane elektrofizjologiczne; porównanie wielu jednostek; odpowiedź częstotliwościowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Rejestracje z macierzy mikroelektrod z włókna węglowego (CFEA) z pierwotnej kory wzrokowej fretki. (A) Przebiegi fal posortowanych pojedynczych jednostek (spike sorting) zarejestrowane za pomocą 16-kanałowej CFEA. Potencjały czynnościowe pojedynczych neuronów były często widoczne na wielu kanałach przy nieco różnych amplitudach. (B) Krzywe dostrojenia kierunkowego wybranych neuronów. Kolory odpowiadają jednostkom zarejestrowanym w części A. Strzałki wskazują kierunek ruchu bodźca. Paski skali określają częstotliwość odpowiedzi. Słupki błędów wskazują średnią odpowiedź wraz z błędem standardowym. Pozioma linia przerywana reprezentuje spontaniczną częstotliwość wyładowań tej samej komórki podczas ekspozycji na pusty ekran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

Opisana tutaj konstrukcja laboratoryjna jest jedną z niewielu obecnie dostępnych technologii elektrod, które umożliwiają zapisy z gęstych skupisk neuronów i śledzenie wielu z tych neuronów w czasie. Układy mikroelektrod z włókna węglowego są niedrogie w budowie. Są małe, biokompatybilne i poruszają się wraz z mózgiem, co pozwala na zdrowe i stabilne nagrania.Włókna węglowe są niezwykle cienkie i początkowo bardzo trudno je dostrzec. Jednak po kilku dniach pracy z nimi stają się łatwiejsze do manipulowania. Na początek połóż kawałek taśmy dwustronnej na dwóch długich bokach kasety, wyrównując krawędź taśmy z wewnętrzną krawędzią kasety.Aby przygotować narzędzie do manipulacji włóknem węglowym, owiń mały kawałek folii samoprzylepnej wokół igły o rozmiarze 30, aby utworzyć ostry, ale elastyczny punkt z folią. Następnie oddziel poszczególne włókna od upieczonego wiązki i ułóż je równolegle do krótszego boku kasety, zachowując odległość od dwóch do trzech milimetrów. Po upewnieniu się, że na każdej kasecie znajduje się od 20 do 30 włókien, uszczelnij włókna na miejscu, kładąc przezroczystą taśmę na podwójnej taśmie klejącej i umieść napełnione kasety w uchwycie kasety.Aby zmontować układ mikroelektrod z włókna węglowego, zacznij przepuszczać każdy przewód uziemiający przez odpowiedni kanał na końcu złącza przyrządu i kontynuuj, aż dwa końce zrównają się długością. Następnie skręć je razem, aby zabezpieczyć je na przyrządzie. Nałóż cement dentystyczny utwardzany promieniami UV, aby zabezpieczyć drut, upewniając się, że cement dentystyczny nie dostanie się do otwartego kanału, przez który podawany jest drut.Użyj różdżki utwardzającej UV, aby utwardzić cement dentystyczny przez 20 sekund i wyrównaj przyrząd i imadło tak, aby koniec łącznika, umywalka i końcówka lejka były widoczne. Następnie ustaw przyrząd tak, aby lejek był skierowany w stronę przeciwną do użytkownika, a łącznik kończył się w stronę użytkownika. Następnie wsuń końcówkę igły o rozmiarze 25 do kasety w miejscu potencjalnego usunięcia włókna i wytnij pojedyncze włókno węglowe z kasety.Przytrzymaj świeżo odcięty wolny koniec włókna za pomocą narzędzia z włókna węglowego i za pomocą igły odetnij drugi koniec włókna od kasety. Następnie ponownie użyj narzędzia z włókna węglowego, aby podnieść włókno węglowe tak, aby jeden koniec znajdował się około jednego centymetra długości od narzędzia. Użyj narzędzia z włókna węglowego dołączonego do włókna, aby przeciągnąć krótszy koniec włókna przez lejek ze środkowej miski przyrządu.Kontynuuj podawanie włókna przez lejek jigowy, aż większość długości włókna zostanie przeprowadzona. Przeprowadź tylną część włókna przez dostępny kanał za pomocą narzędzia z włókna węglowego. Kontynuuj karmienie przez plecy, aż około pięciu milimetrów włókna zacznie wystawać lub przyciąć na wymiar, jeśli to konieczne.Aby usunąć izolację na końcu złącza, użyj standardowej zapalniczki z kołem zapłonowym, aby przepuścić płomień przez odsłonięte włókna, a następnie przeprowadź płomieniowane włókno przez przyrząd tak, aby część płomieniowanego włókna znajdowała się teraz w kanale, upewniając się, że żadne włókna nie wystają z tyłu przyrządu. Nałóż cement dentystyczny utwardzany promieniami UV na włókna umywalki przyrządu, aby wypełnić całą umywalkę, zakrywając otwory obu kanałów i lejka. Po wyjęciu przyrządu z imadła i ustawieniu go tak, aby lejek był skierowany w dół, zabezpiecz przyrząd końcem łącznika skierowanym do góry.Napełnij igłę srebrnym nadrukiem i ostrożnie włóż igłę do jednego kanału, aż zostanie zatrzymana przez cement dentystyczny. Aby wypełnić kanał farbą, powoli wciśnij strzykawkę, jednocześnie wyjmując igłę z kanału, a następnie zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w rozcieńczalniku do farb i oczyść podstawę powierzchni przyrządu z dowolnej farby. Teraz włóż złącze stopnia czołowego we właściwej orientacji, wyrównując styki z kanałami.Gdy łącznik stopnia głównego jest ustawiony prosto, pionowo i jest jak najbardziej przylegający do przyrządu, przymocuj łącznik stopnia głowicy do przyrządu, nakładając cement dentystyczny wzdłuż krawędzi, w której łącznik stopnia głowicy styka się z przyrządem, a następnie utwardzaj UV przez 20 sekund. Aby przyciąć końcówkę elektrody na żądaną długość, opuść elektrodę do zlewki z wodą dejonizowaną lub destylowaną, aż końcówka lejka zostanie całkowicie zanurzona i utrzymana normalnie względem powierzchni. Teraz połącz ze sobą poszczególne włókna węglowe, wyjmując elektrodę z wody.Ułóż elektrodę tak, aby włókna leżały równo na powierzchni prowadzącej i przytnij włókna na żądaną długość za pomocą skalpela w ruchu tocznym, a następnie przymocuj elektrodę do testera impedancji wieloelektrodowej za pomocą odpowiedniego adaptera i przetestuj impedancję. Teraz opuść końcówkę elektrody o około dwa milimetry do probówki mikrowirówki o masie 0,1 mola PBS i włóż przewód uziemiający do probówki mikrowirówki. Aby zmniejszyć impedancję końcówki elektrody, wstrzyknij prąd dodatni o wybranej amplitudzie i czasie trwania, a następnie przepłucz włókna w wodzie dejonizowanej lub destylowanej w celu oczyszczenia.Następnie, aby wykonać galwanizację w roztworze do złocenia, opuść końcówkę wiązki elektrod na około dwa milimetry do rurki mikrowirówki w mieszaninie galwanicznej i włóż przewód uziemiający do probówki mikrowirówki. Następnie ustaw odpowiednie parametry do galwanizacji. Po galwanizacji dokładnie spłucz włókna wodą dejonizowaną lub destylowaną.Reprezentatywny obraz SEM przygotowanego włókna węglowego wykazał roztwór złocenia skoncentrowany na końcówce. Galwanizacja włókien w złocie spowodowała zmniejszenie impedancji odpowiednich do nagrania. Wartości impedancji z 300 kanałów po wstępnym cięciu, wtrysku dodatniego prądu i galwanizacji wykazały zmniejszone wartości impedancji po każdym etapie obróbki.Umiarkowany czas galwanizacji złotem spowodował małe i zaokrąglone osady na końcówkach wiązki włókna węglowego. Ponadto przeanalizowano stabilną 64-kanałową aktywność elektrofizjologiczną w korze zaśledziony swobodnie zachowującego się dorosłego samca myszy. Wyniki wykazały spójność jakości nagrywania, solidną detekcję pojedynczej jednostki, spójność w czasie, o czym świadczą nieznormalizowane przebiegi szczytowe, oraz stabilny poziom szumów.Również napięcie surowe śledzone 11 miesięcy po implantacji wykazało silny potencjał pola lokalnego. Reprezentatywny przykład ostrego 16-kanałowego zapisu mikroelektrod z włókna węglowego uzyskanego z pierwszorzędowej kory wzrokowej dorosłej samicy fretki jest również pokazany tutaj. Układy mikroelektrod z włókna węglowego umożliwiają krótkotrwałe lub przewlekłe rejestrowanie pobliskich neuronów w mózgu przez długi czas, co jest niezbędne do zrozumienia obwodów neuronalnych.

construction-implementation-carbon-fiber-microelectrode-arrays-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania macierzy mikrodrajwerów do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów.

Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania i kondycjonowania tetrod do zastosowania w macierzy mikro-napędów, która została zaprojektowana do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Dodatkowo przedstawiamy końcowe etapy konstrukcji macierzy mikro-napędów, obejmujące instalację przewodów uziemiających oraz stożka ochronnego.

Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Zaprojektowaliśmy procedurę, w której utrwalone formaldehydem ludzkie zwłoki są używane do pomocy neurochirurgom w szkoleniu do wszczepiania układów mikroelektrod do kory nowej ludzkiego mózgu.

Szkolenie chirurgiczne w zakresie implantacji układów mikroelektrod kory nowej przy użyciu modelu zwłok ludzkich utrwalonych formaldehydem

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Opisana poniżej jest metoda implantacji wielu układów elektrod polimerowych w anatomicznie odległych obszarach mózgu w celu przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie poruszających się szczurów. Przygotowanie i implantacja chirurgiczna są szczegółowo opisane, z naciskiem na zasady projektowania, które mają pomóc w adaptacji tych metod do stosowania u innych gatunków.

Przewlekła implantacja wielu elastycznych matryc elektrod polimerowych

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Tutaj opisujemy metodologię produkcji konfigurowalnych układów elektrod z włókna węglowego do nagrywania in vivo w nerwach i mózgu.

Zestaw narzędzi typu open source: laboratoryjny zestaw mikroelektrod z włókna węglowego do nagrywania nerwów

Obecny protokół opisuje konstrukcję specjalnie wykonanych układów mikroelektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie.

Budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj budowę mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo w mózgu myszy i fretki. Ta metoda zapewnia stabilne, biokompatybilne rejestracje aktywności neuronalnej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Przeglądaj więcej filmów