Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Protokół ten pozwolił odpowiedzieć na ważne pytanie w dziedzinie przerzutów nowotworowych. W tym, w jaki sposób komórki nowotworowe kolonizują płuca? Jak komórki nowotworowe pozostają uśpione?

I co skłania je do wyjścia ze stanu uśpienia i ostatecznie do powstania przerzutów. Główną zaletą tego protokołu jest to, że dynamiczny proces przerzutowy może być bezpośrednio badany in vivo, w czasie rzeczywistym, w rzeczywistym mikrośrodowisku. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat kilku chorób płuc, ale jest szczególnie przydatna do zrozumienia zachowania poszczególnych komórek nowotworowych rozprzestrzeniających się do płuc, które są częstym miejscem przerzutów.

Na początek użyj jedwabnego szwu 2-0, aby zawiązać węzeł u podstawy cewnika o rozmiarze 22, pozostawiając ogony o długości 2 cali. Gdy mysz zostanie całkowicie znieczulona, przenieś ją na stół operacyjny, zaintubuj mysz, a następnie zabezpiecz cewnik do intubacji, zawiązując jedwabny szew 2-0 wokół pyska myszy. Podłączyć respirator do cewnika intubacyjnego.

Za pomocą taśmy papierowej przymocuj przednią czaszkę i tylne kończyny doogonowo do rozgrzanego etapu chirurgicznego. Umieść taśmę papierową wzdłuż grzbietu myszy, aby zmaksymalizować ekspozycję na pole operacyjne. Podnieś skórę kleszczami i wykonaj okrężne nacięcie o długości około 10 mm w odległości około 7 mm w lewo od mostka i około 7 mm powyżej brzegu podżebrowego.

Wytnij tkankę miękką pokrywającą żebra. Podnieś szóste i siódme żebro za pomocą kleszczy. Użyj pojedynczego ostrza nożyczek do mikropreparowania zaokrągloną stroną w kierunku płuca, aby ostrożnie przebić mięsień międzyżebrowy między szóstym a siódmym żebrem, aby wejść do przestrzeni śródpiersiowej.

Delikatnie opróżnij kanister ze sprężonym powietrzem w miejscu ubytku, aby zapadnąć płuco i oddzielić płuco od ściany klatki piersiowej. Wystrzeliwuj sprężone powietrze w krótkich seriach, aby zapobiec jatrogennemu uszkodzeniu płuc. Umieść stempel do biopsji na narzędziu tnącym i ostrożnie manewruj podstawą narzędzia tnącego przez nacięcie międzyżebrowe.

Ustaw podstawę narzędzia tnącego równolegle do ściany klatki piersiowej i przebij okrągły otwór o średnicy 5 mm przez klatkę piersiową. Za pomocą jedwabnego szwu 5-O umieść ścieg sznurkowy torebki, około 1 mm od otworu, na obwodzie. Następnie umieścić ościeżnicę okienną w ścianie skrzyniowej tak, aby krawędzie okrągłej wady zostały uchwycone w rowku okiennym.

Mocno zawiąż jedwabny szew 5-O, aby bezpiecznie zablokować wszczepione okno. Stosuj stały i delikatny strumień sprężonego powietrza przez około 10 do 20 sekund, aby wysuszyć płuca. Za pomocą kleszczy chwyć ramę okienną za jej zewnętrzną krawędź i delikatnie podnieś, aby zapewnić oddzielenie płuca od spodu ramy okiennej.

Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego wzdłuż spodniej powierzchni ramy okna optycznego. Delikatnie, ale stanowczo dociśnij ramkę okienka optycznego do tkanki płucnej przez 10 do 20 sekund w celu zamocowania. Naniej 5 mm kropli kleju na prostokątne szkiełko nakrywkowe.

Użyj narzędzia do pobierania próżniowego, aby podnieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 5 mm. Zanurz spodnią powierzchnię szkiełka nakrywkowego w kleju, a następnie zeskrob nadmiar kleju trzykrotnie o bok prostokątnego szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać bardzo cienką warstwę kleju na szkiełku nakrywkowym. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe pod kątem wewnątrz wgłębienia pośrodku ramy okna optycznego, tuż nad tkanką płucną.

Krótko zaciśnij respirator, aby wytworzyć nadciśnienie, nadmiernie napompowując płuca. Ustawić szkiełko nakrywkowe równolegle do tkanki płucnej, wykorzystując ruch obrotowy do wytworzenia bezpośredniego osadzania między powierzchnią płuc a spodnią powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Utrzymuj delikatny nacisk przez około 25 sekund, aby utrwalić klej cyjanoakrylowy.

Oddziel szkiełko nakrywkowe od narzędzia do pobierania odkurzacza za pomocą kleszczy. Wykonaj ścieg sznurkowy torebki, obwodowo, mniej niż 1 mm od krawędzi cięcia skóry za pomocą jedwabnego szwu 5-O. Wsuń nadmiar skóry pod zewnętrzną krawędź ramy okiennej przed ciasnym związaniem okna węzłami blokującymi.

Dozuj niewielką ilość kleju na styk metalowego szkła, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a ramą okienną. Przymocuj sterylną igłę do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml. Włóż igłę poniżej wyrostka mieczykowatego, przesuwając się w kierunku lewego ramienia, wchodząc do klatki piersiowej przez przeponę.

Delikatnie odciągnąć strzykawkę, aby usunąć resztki powietrza z jamy klatki piersiowej. Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe pojedynczego obszaru płuc wykazało, że mikronaczynia mogą być przemieszczane w ciągu trzech kolejnych dni. Definiowalny punkt rozgałęzienia z pojedynczego naczynia był identyfikowany każdego kolejnego dnia.

Nieoznakowane erytrocyty tworzyły cienie, gdy przepływały w większych naczyniach. Kąt punktów rozgałęzień względem naczynia można wykorzystać do obliczenia natężenia przepływu erytrocytów. Prędkość erytrocytów określono również ilościowo poprzez wstrzyknięcie myszi mikrosfer fluorescencyjnych, a ich długości ścieżek zmierzono podzielone przez czas akwizycji ramki.

Dało się odróżnić nieruchome i przepływające mikrosfery. Los rozsianych komórek nowotworowych śledzono za pomocą obrazowania seryjnego przez kilka dni, wykorzystując okno do obrazowania płuc w wysokiej rozdzielczości. Komórka nowotworowa dotarła do układu naczyniowego płuc i zagnieździła się w nim pierwszego dnia.

Jednak komórka nie została wykryta w unaczynieniu płuc w drugim i trzecim dniu, co wskazuje na rekrążenie lub wynaczynienie. Uwidoczniono kulminacyjne etapy progresji przerzutów w płucach, począwszy od przybycia komórek nowotworowych, wynaczynienia komórki nowotworowej do miąższu płuca i proliferacji w celu utworzenia makroprzerzutów. Należy uważać, aby uniknąć urazu płuca podczas zakładania ramy okienka optycznego.

Płuco jest podatne na krwawienia, co później utrudnia przyleganie szkiełka nakrywkowego podczas zakładania. Inne metody, które można wykonać po tej procedurze, obejmują mikroskopię przyżyciową, która w połączeniu ze zmodyfikowanym podejściem do mikrokartografii umożliwia precyzyjną relokalizację obszarów zainteresowania w celu powtórzenia obrazowania. Protokół ten pozwolił na wizualizację płuc w badaniu kluczowego pytania dotyczącego mechanizmu przerzutów.

Badanie to ma potencjał do odtworzenia nowego leczenia dla pacjentów z rakiem.