Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach
27 czerwca 2022
Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.
Protokół ten pokazuje warunki potrzebne do utrzymania funkcji siatkówki w ERG ex vivo, w szczególności niezwykle wrażliwego załamka B wytwarzanego przez komórki ON-bipolarne. Dzięki ERG ex vivo możemy mierzyć funkcję różnych typów neuronów siatkówki z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, umożliwiając jednocześnie łatwe wprowadzenie środków farmakologicznych. Metoda ta jest szczególnie podatna na ilościowe określanie skuteczności środków farmakologicznych w odniesieniu do funkcji siatkówki i choroby.
Aby rozpocząć, przekształć konfigurację wieloelektrodową, podłączając uchwyt próbki ERG ex vivo do wzmacniacza różnicowego za pośrednictwem stopnia głównego. Wzmacniacz musi być podłączony do wejścia analogowego płytki interfejsu systemu wieloelektrodowego. Użyj oprogramowania rejestrującego dla matrycy wieloelektrodowej, aby rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo.
Ustaw wzmocnienie wzmacniacza różnicowego na 100 i dodaj dodatkowe 10-krotne wzmocnienie napięcia, w zależności od specyfikacji digitizera. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 herców. Alternatywnie, aby przekształcić konfigurację zacisku krosowego, podłącz uchwyt próbki ERG ex vivo przez stopień czołowy do wzmacniacza różnicowego amplifier, który musi być podłączony do stopnia czołowego wzmacniacza zacisku krosowego.
Za pomocą oprogramowania systemu zacisków krosowych i digitizera można rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo. Ustaw parametry, jak pokazano wcześniej. Podłącz diody LED o odpowiednich długościach fal do mikroskopu.
Do sterowania bodźcami świetlnymi służy sterownik LED sterowany wyjściami analogowymi z digitizera. Steruj diodami LED za pomocą oprogramowania do nagrywania, które umożliwi wyzwalanie bodźców świetlnych. Następnie skalibruj strumień świetlny diod LED w pozycji siatkówki w uchwycie próbki za pomocą fotodiody.
W razie potrzeby włóż filtry o neutralnej gęstości, aby przyciemnić natężenie światła na ścieżce światła. Aby przygotować elektrodę, włóż elektrodę z chlorkiem srebra i srebra do gwintowanego łącznika przynęty. Wypełnij wnętrze łącznika przynęty gorącym klejem i włóż dwumilimetrowe gniazdo do gorącego kleju od strony niegwintowanej.
srebrny drut elektrody EP-1 do dwumilimetrowego gniazda. Wkręć gotową elektrodę z O-ringiem na gwincie w porty elektrod uchwytu na próbki ERG ex vivo. W przypadku dużych oczu, w tym oczu dawcy ludzkiego, oczyść gałkę z pozostałej tkanki łącznej i usuń przedni odcinek i soczewkę.
Użyj skalpela, aby wykonać cięcie około trzech milimetrów od rąbka. Włóż zakrzywione nożyczki preparacyjne do nacięcia i przetnij wzdłuż rąbka, aby usunąć przednią część oka z soczewką. Uzyskaj próbki siatkówki do elektroretinografii ex vivo za pomocą jednorazowego stempla do biopsji o grubości od trzech do sześciu milimetrów.
Aby zamontować tkankę na uchwycie na próbkę, umieść dolną połowę uchwytu próbki na dużej szalce Petriego i napełnij ją natlenioną pożywką Amesa tak, aby kopuła uchwytu próbki była po prostu zanurzona. Ostrożnie chwyć krawędź siatkówki cienkimi kleszkami i przenieś siatkówkę na kopułę uchwytu próbki ex vivo, stroną fotoreceptorową skierowaną do góry. Podnieś uchwyt próbki z roztworu Amesa, uważając, aby siatkówka pozostała na swoim miejscu.
Całkowicie wysusz płytkę uchwytu próbki, aby zminimalizować szumy, przesłuchy elektryczne i bocznik sygnału. Następnie zmontuj obie połówki uchwytu próbki za pomocą czterech i podłącz linię perfuzyjną. Wbić elektrodę w dolną połowę uchwytu próbki i podłączyć anodowy do wewnętrznej strony siatkówki, a katodowy do strony fotoreceptora.
Utrzymuj uchwyt próbki z co najmniej jednym mililitrem na minutę natlenionej pożywki Amesa przez 10 do 20 minut, aby umożliwić stabilizację reakcji świetlnych. ERG ex vivo umożliwiło rejestrację reakcji na światło fotoreceptorów i komórek bipolarnych ON z siatkówki myszy. Rejestracja odpowiedzi fotoreceptorów z ludzkich siatkówek dawcy była możliwa z pięciogodzinnym opóźnieniem wyłuszczenia pośmiertnym i mniejszym niż 20 minut opóźnieniem w przypadku odpowiedzi komórek dwubiegunowych ON.
W idealnych warunkach amplituda odpowiedzi i kinetyka w obu typach komórek były stosunkowo stabilne w czasie, ale wykazywały powolny spadek od 40 do 45 minut po zamontowaniu siatkówki na uchwycie próbki. Obniżona temperatura w uchwycie próbki znacznie spowolniła kinetykę zarówno fotoreceptorów, jak i komórek bipolarnych ON. Zmniejszyło to jednak amplitudę fali B, ale nie fali A.
I odwrotnie, spowolnienie szybkości perfuzji zmniejszyło amplitudy zarówno odpowiedzi fotoreceptorów, jak i komórek dwubiegunowych ON, ale nie wpłynęło na utajony czas załamka A lub B. Przerwanie perfuzji na 10 minut, a następnie reperfuzja spowodowała całkowitą utratę funkcji komórek ON-dwubiegunowych z zachowanymi odpowiedziami fotoreceptorów. Wystarczająca prędkość perfuzji i temperatura fizjologiczna mają kluczowe znaczenie dla uzyskania stabilnych odpowiedzi, w szczególności z komórek bipolarnych ON-bipolarnych w ERG ex vivo.
Protokół ten pozwala na dogłębne zbadanie różnic w funkcji fotoreceptorów w ludzkiej plamce żółtej i na obrzeżach, odpowiadając na pytania, które wcześniej można było przeprowadzić tylko u naczelnych innych niż ludzie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ulepszonych metod zapisu elektroretinogramu (ERG) ex vivo w celu badania funkcji neuronów siatkówki. Podejście to koncentruje się na funkcjonalności komórek bipolarnych typu ON oraz fotoreceptorów z wykorzystaniem różnych konfiguracji sprzętowych, dostarczając informacji na temat efektów farmakologicznych w siatkówce w stanach zdrowych i chorobowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauka
- Biologia siatkówki
Wstęp
- Wyzwania związane z efektywnym rejestrowaniem funkcji siatkówki w warunkach ex vivo.
- Znaczenie komórek dwubiegunowych typu ON oraz fotoreceptorów w zdrowiu i chorobach siatkówki.
- Potrzeba niezawodnych metod ilościowego określania efektów interwencji farmakologicznych.
- Istniejące techniki często charakteryzują się niską dostępnością i precyzją.
Cel badania
- Udoskonalenie rejestracji odpowiedzi siatkówki na światło przy użyciu zmodyfikowanego sprzętu.
- Ułatwienie analizy funkcjonalności fotoreceptorów i komórek bipolarnych typu ON.
- Ocena odpowiedzi farmakologicznych w komórkach siatkówki.
Zastosowane metody
- Protokół wykorzystuje ERG ex vivo z zastosowaniem macierzy wieloelektrodowych lub systemów patch clamp.
- Jako modele biologiczne wykorzystywane są siatkówki mysie oraz siatkówki ludzkie pochodzące od dawców.
- Każda konfiguracja obejmuje krytyczne parametry wzmocnienia i filtrowania, aby zapewnić dokładność rejestracji.
- Podkreślono znaczenie utrzymania temperatury i szybkości perfuzji podczas eksperymentu.
- Kalibracja natężenia światła za pomocą fotodiod jest kluczowa dla kontrolowanej stymulacji.
Główne wyniki
- Udoskonalone metody umożliwiają stabilne rejestracje zarówno z fotoreceptorów, jak i komórek bipolarnych typu ON.
- Reakcje pozostają spójne, przy czym obserwuje się niewielkie spadki po dłuższym czasie montażu.
- Temperatura i szybkość perfuzji znacząco wpływają na amplitudę odpowiedzi, w szczególności na falę B.
- Wyniki wyjaśniają różnice w funkcji fotoreceptorów w poszczególnych obszarach ludzkiej siatkówki.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje niezawodną metodę badania funkcji neuronów siatkówki.
- Poprawiona dostępność umożliwia prowadzenie zaawansowanych badań farmakologicznych istotnych dla zdrowia siatkówki.
- Wyniki te pogłębiają zrozumienie mechanizmów neuronalnych oraz potencjalnych interwencji w chorobach siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optymalizacja warunków ERG ex vivo umożliwia stabilny i wierny zapis odpowiedzi neuronów siatkówki, w szczególności komórek dwubiegunowych typu ON oraz fotoreceptorów, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego podczas walidacji celów terapeutycznych w siatkówce. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę interwencji farmakologicznych w izolowanej tkance, redukując zmienność systemową i zwiększając pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Dzięki temu technika ta stanowi pomost translacyjny w ocenie preparatów terapeutycznych dla siatkówki u różnych gatunków, w tym w tkankach pochodzących od ludzkich dawców.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznego dla typów komórek neuronalnych siatkówki wkładu w odpowiedzi na światło, co wspiera testowanie hipotez dotyczących punktów uchwytu oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia wprowadzanie czynników farmakologicznych w celu ilościowego określenia ich skuteczności w odniesieniu do funkcji siatkówki, co usprawnia proces redukcji ryzyka związanego z punktami uchwytu.
- Wartość prognostyczna: Stabilne rejestracje fali B komórek bipolarnych typu ON pozwalają na ocenę wpływu związków w czasie, co wspiera identyfikację wiodących kandydatów oraz selekcję portfela projektów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Optymalna prędkość perfuzji oraz temperatura fizjologiczna maksymalizują amplitudę i stabilność odpowiedzi, co umożliwia wiarygodny screening związków.
- Wyniki ilościowe: Zapewnia pomiary odpowiedzi fotoreceptorów i komórek bipolarnych typu ON z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, co wspiera analizy kinetyczne oraz zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność: Możliwość dostosowania do próbek siatkówki z małych i dużych oczu, w tym do tkanek od ludzkich dawców, co wspiera standaryzację testów międzygatunkowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia porównanie funkcji fotoreceptorów między ludzką siatkówką plamką a siatkówką obwodową, co wspiera uzgodnienie biomarkerów.
- System istotny dla przebiegu choroby: Utrzymuje funkcję siatkówki ex vivo do pięciu godzin po śmierci, co pozwala na ocenę zmian patologicznych i interwencji terapeutycznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Izoluje wewnątrzpochodne odpowiedzi siatkówki, minimalizując zakłócający wpływ czynników systemowych w ocenie przedklinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Zoptymalizowana metoda ERG ex vivo integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu po ocenę przedkliniczną, wspierając podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane w rozwoju terapii siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów neuronalnych siatkówki oraz wkładu konkretnych szlaków w funkcję widzenia.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty odpowiedzi na światło, umożliwiając rzetelną ocenę związków w testach siatkówki.
- Analityka: Generuje dane kinetyczne i amplitudowe (fale A i B), które pozwalają na porównanie efektów terapeutycznych w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z systemów modelowych z siatkówką ludzką pochodzącą od dawców, wspierając ciągłość przejścia z fazy przedklinicznej do klinicznej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do funkcjonalnej oceny siatkówki dla zespołów zajmujących się odkrywaniem leków oraz badaniami przedklinicznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia jasność mechanistyczną w zakresie odpowiedzi specyficznych dla typów komórek siatkówki, zmniejszając niejednoznaczność w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana perfuzja i kontrola temperatury poprawiają powtarzalność i redukują zmienność w pomiarach funkcji siatkówki.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejsze i pewniejsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie oddziaływania na cel w siatkówce.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój terapii siatkówki poprzez ograniczanie niepewności mechanistycznej w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dyssekcji tkanki siatkówki, elektrofizjologii oraz obchodzeniu się z czynnikami farmakologicznymi.
- Zależne od specjalistycznego sprzętu, w tym wzmacniaczy różnicowych, sterowników LED, fotodiod oraz systemów perfuzyjnych.
- Wymaga standaryzacji protokołów mocowania tkanki, prędkości perfuzji (co najmniej 1 mL/min) oraz utrzymywania temperatury fizjologicznej.
- Adaptacja do różnych systemów modelowych wymaga optymalizacji rozmiaru wycinaka do biopsji oraz technik dyssekcji w zależności od wymiarów oka.
- Ograniczenia praktyczne obejmują stopniowy spadek stabilności odpowiedzi po 40–45 minutach od mocowania, co wymaga sprawnego przeprowadzenia eksperymentu.
