Name: Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj protokół elektroretinografii ex vivo do badania funkcji komórek ON-bipolarnych i fotoreceptorów siatkówki. Metoda umożliwia precyzyjną analizę farmakologiczną w modelach mysich i ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Eye Institute EY02665 i EY031706 oraz Międzynarodową Fundację Badań nad Siatkówką dla dr Vinberga, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), oraz Unrestricted Grant od Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, NY, dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych, University of Utah. Dr Frans Vinberg jest również laureatem nagrody Research to Prevent Blindness/Dr. H. James i Carole Free Career Development Award, oraz dr Silke Becker z grantu ARVO EyeFind. Dziękujemy dr Anne Hanneken z The Scripps Research Institute za udostępnienie oka dawcy używanego do nagrań pokazanych na rysunku 2E.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Utah. Świńskie oczy do demonstracji tego filmu zostały pobrane pośmiertnie z rzeźni (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Oczy zostały pozyskane od ludzkich dawców po śmierci mózgu lub sercowej za zgodą na wykorzystanie w badaniach za pośrednictwem Utah Lions Eye Bank, San Diego Eye Bank lub Lifesharing, które są w pełni akredytowane przez FDA, Stowarzyszenie Organizacji Pobierających Narządy (AOPO) i Stowarzyszenie Banków Oczu Ameryki. Stosowanie ludzkich oczu dawcy miało status zwolnienia na Uniwersytecie Utah (IRB nr 00106658) i ScrippsHealth IRB (IRB nr 16-6781).
1. Konfiguracja ERG ex vivo
<ol>
	<li>Aby przekonwertować konfigurację matrycy wieloelektrodowej, podłącz uchwyt próbki ERG ex vivo za pomocą stopnia czołowego do wzmacniacza różnicowego, który jest podłączony do wejścia analogowego płytki interfejsu systemu matrycy wieloelektrodowej. Użyj oprogramowania rejestrującego dla matrycy wieloelektrodowej, aby rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo. Ustaw wzmocnienie wzmacniacza różnicowego na 100 i dodaj dodatkowe 10-krotne wzmocnienie napięcia w zależności od specyfikacji digitizera. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 Hz.</li>
	<li>Aby przekonwertować konfigurację zacisku krosowego, podłącz uchwyt próbki ex vivo ERG za pomocą stopnia czołowego do wzmacniacza różnicowego, który jest podłączony do stopnia głównego wzmacniacza zacisku krosowego. Za pomocą oprogramowania systemu zacisków krosowych i digitizera można rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo. Ustaw wzmocnienie wzmacniacza różnicowego na 100 i zastosuj dodatkowe 10-krotne wzmocnienie napięcia za pomocą stopnia głowicy z zaciskiem krosowym. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 Hz.</li>
	<li>Podłącz diody LED o odpowiednich długościach fal (np. około 530 nm, aby wywołać odpowiedzi fotoreceptorów pręcików i komórek bipolarnych ON) do mikroskopu. Steruj diodami LED za pomocą oprogramowania rejestrującego, które umożliwia wyzwalanie bodźców świetlnych. Do sterowania bodźcami świetlnymi służy sterownik LED sterowany wyjściami analogowymi z digitizera.</li>
	<li>Skalibruj strumień świetlny diod LED w pozycji siatkówki w uchwycie próbki za pomocą fotodiody. W razie potrzeby włóż filtry o neutralnej gęstości do ścieżki światła, aby przyciemnić natężenie światła.</li>
	<li>Użyj dostępnego na rynku lub zbudowanego na zamówienie uchwytu na próbki ERG ex vivo. 
	UWAGA: Rysunki do obróbki CNC z poliwęglanu można uzyskać od autorów na życzenie.</li>
	<li>Aby przygotować elektrodę, włóż elektrodę granulowaną Ag/AgCl do gwintowanego złącza luer. Wypełnij wnętrze złącza luer gorącym klejem i włóż gniazdo 2 mm do gorącego kleju od strony niegwintowanej. srebrny drut elektrody EP1 do gniazda 2 mm. Wkręć gotową elektrodę z o-ringiem na gwincie w porty elektrod uchwytu na próbki ex vivo ERG. 
	UWAGA: Elektrody mogą być używane przez długi czas. Jeśli na powierzchni peletek gromadzi się brud i/lub ciemnieje (może to spowodować wysokie napięcie niezrównoważenia i/lub dryf elektryczny), można ją "wypolerować" drobnym papierem ściernym.</li>
	<li>Co najmniej 1 dzień przed eksperymentem przyklej bibuły filtracyjne do kopułek uchwytu próbki ERG ex vivo za pomocą kleju epoksydowego, upewniając się, że klej nie zatyka kanału elektrody (patrz 3 dla wideo).</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Ciemne zwierzęta przystosowują się przez co najmniej 6 godzin lub przez noc.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Napełnij linię perfuzyjną ERG ex vivo pożywką Amesa z pęcherzykami 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu. Podłącz linię perfuzyjną do elementu grzejnego ze źródłem prądu stałego lub regulatorem ciepła w pobliżu uchwytu próbki, aby ogrzać medium Amesa, tak aby siatkówka była utrzymywana w temperaturze około 35-38 °C.</li>
	<li>Napełnij obie połówki uchwytu próbki ERG ex vivo roztworem elektrody, uszczelnij linię perfuzyjną korkami luer, połącz elektrody i zmontuj uchwyt próbki za pomocą czterech (zobacz 3 dla filmu).</li>
	<li>Sprawdź rezystancję i napięcie przesunięcia między elektrodami w zmontowanym uchwycie na próbkę, wkładając sondy multimetru do elektrod. 
	UWAGA: Jeśli nie ma żadnych zatorów, a elektrody są w dobrym stanie, rezystancja powinna być poniżej 100 kΩ, a napięcie przesunięcia poniżej 5 mV.</li>
	<li>Podłącz zmontowany uchwyt próbki do linii perfuzyjnej i umieść na stoliku mikroskopu ustawionego do dostarczania błysków światła. Upewnij się, że uchwyt próbki i linia perfuzyjna nie zawierają żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
4. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Uśmierc zwierzę za pomocą CO2 i natychmiast wyłuszczej oczy lub uzyskaj duże oczy dawcy zwierzęcego lub ludzkiego.</li>
	<li>Oczyść gałkę ziemską z pozostałej tkanki łącznej i mięśni zewnątrzgałkowych. Odetnij nerw wzrokowy.</li>
	<li>Na bibule filtracyjnej ostrożnie umieść małe nacięcie żyletką wzdłuż ora serrata, około 1 mm od rąbka w oku myszy. Włóż cienkie nożyczki vannas do nacięcia i przetnij wzdłuż rąbka, aby usunąć przednią część oka z soczewką.</li>
	<li>Przenieś muszlę oczną do naczynia zawierającego pożywkę Amesa. Chwyć twardówkę cienkimi kleszkami, uważając, aby nie dotknąć siatkówki. Włóż nożyczki vannas między siatkówkę a twardówkę i odetnij twardówkę od obwodu w kierunku części środkowej. Uważaj, aby nie dotknąć ani nie uszkodzić siatkówki.</li>
	<li>Unieruchomić twardówkę, przytrzymując jedną stronę nacięcia nożyczkami vannas o dno naczynia preparacyjnego. Chwyć twardówkę kleszczami po drugiej stronie nacięcia. Usuń twardówkę bez dotykania lub uszkadzania siatkówki, rozsuwając twardówkę po obu stronach nacięcia, aby umożliwić izolację siatkówki przy minimalnym uszkodzeniu tkanki.</li>
	<li>Usuń przedni odcinek z soczewką z drugiego oka i przechowuj muszlę oczną w temperaturze pokojowej w roztworze Amesa z bąbelkami 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu. 
	UWAGA: Zmagazynowane w ten sposób funkcjonalne reakcje świetlne z oczu można uzyskać przez kilka godzin.</li>
	<li>W dużych oczach, w tym w oczach dawcy ludzkiego, należy oczyścić gałkę ziemską z pozostałej tkanki łącznej i usunąć przedni odcinek i soczewkę, podobnie jak w przypadku procedury opisanej dla oka myszy. Użyj skalpela, aby wykonać cięcie około 3 mm od rąbka. Włóż zakrzywione nożyczki preparacyjne do nacięcia i przetnij wzdłuż rąbka, aby usunąć przednią część oka z soczewką. Próbki siatkówki należy pobrać do elektroretinografii ex vivo za pomocą jednorazowego stempla do biopsji 3-6 mm.</li>
</ol>
5. Montaż chusteczki na uchwycie na próbkę
<ol>
	<li>Umieść dolną połowę uchwytu próbki na dużej szalce Petriego i wypełnij natlenioną pożywką Amesa, tak aby kopuła uchwytu próbki była po prostu zanurzona.</li>
	<li>Ostrożnie chwyć krawędź siatkówki cienkimi kleszkami i przenieś siatkówkę na kopułę uchwytu próbki ex vivo, stroną fotoreceptorową skierowaną do góry.</li>
	<li>Podnieś uchwyt próbki z roztworu Amesa, uważając, aby siatkówka pozostała na swoim miejscu.</li>
	<li>Całkowicie wysusz płytkę uchwytu próbki, aby zminimalizować szumy, przesłuchy elektryczne i bocznik sygnału.</li>
	<li>Zmontuj obie połówki uchwytu próbki za pomocą czterech i podłącz linię perfuzyjną. Osusz elektrodę w dolnej połowie uchwytu próbki i podłącz anodowy do wewnętrznej strony siatkówki, a katodowy do strony fotoreceptora.</li>
	<li>Utrzymuj uchwyt próbki z co najmniej 1 ml / min natlenionej pożywki Amesa przez 10-20 minut, aby dać czas na ustabilizowanie się reakcji światła.</li>
</ol>
6. Rejestrowanie funkcji komórek neuronalnych siatkówki
<ol>
	<li>Rejestruj rodziny odpowiedzi, wystawiając siatkówkę na błyski światła o rosnącym natężeniu. Na przykład, rejestruj rodziny odpowiedzi fotoreceptorów pręcików myszy o natężeniu światła w zakresie od około 10 do 1000 fotonów/μm2 oraz te z mysich komórek bipolarnych ON, o natężeniu światła w zakresie od około 0,6 do 20 fotonów/μm2.</li>
	<li>Zmierz reakcje świetlne fotoreceptorów (fala a) w obecności 100 μM chlorku baru, który blokuje kanały potasowe w komórkach glejowych Müllera, i 40 μM DL-AP4, który blokuje transmisję sygnału glutaminergicznego do komórek bipolarnych ON (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Aby wyizolować załamek b, który pochodzi z funkcji komórek dwubiegunowych ON, najpierw zarejestruj połączone odpowiedzi świetlne zarówno z komórek fotoreceptorowych, jak i dwubiegunowych ON w obecności samego chlorku baru (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). Następnie perfekuj przez 5-10 minut pożywką Amesa zawierającą chlorek baru, a także DL-AP4 i rejestruj odpowiedzi fotoreceptorów na te same bodźce świetlne co wcześniej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2B). Odejmij odpowiedzi fotoreceptorów od połączonych odpowiedzi fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON, obliczając w ten sposób same odpowiedzi świetlne komórek bipolarnych ON (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
7. Optymalizacja funkcji komórek dwubiegunowych ON
UWAGA: Fala b, która pochodzi z komórek bipolarnych ON, jest bardzo wrażliwa na temperaturę w pojemniku na próbkę i szybkość perfuzji.
<ol>
	<li>Utrzymuj szybkość perfuzji co najmniej 0,5 ml/min, aby uzyskać załamek b. 
	UWAGA: Wyższa szybkość perfuzji wynosząca 1-2 ml / min jest preferowana w celu utrzymania dużej i stabilnej odpowiedzi z komórek ON-bipolarnych.</li>
	<li>Upewnij się, że dla danej szybkości perfuzji temperatura w uchwycie próbki w pobliżu siatkówki jest zbliżona do temperatury ciała (tj. około 35-38 °C). 
	UWAGA: Ważne jest, aby wyregulować temperaturę perfuzatu, który jest podgrzewany, zanim dotrze do uchwytu próbki ERG ex vivo, tak aby mieścił się w optymalnym zakresie temperatur na siatkówce.</li>
	<li>Przechowuj muszle oczne do późniejszych eksperymentów chronione przed światłem i w natlenionym pożywce Amesa w temperaturze pokojowej, aby utrzymać normalne fale a i b przez kilka godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlman%2C+I+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22">Webvision: The Organization of the Retina and Visual System</a>. , (1995).</li>
<li>Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+electroretinograms+made+easy%3A+performing+ERGs+using+3D+printed+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components.</a> Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).</li>
<li>Vinberg, F., Kefalov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+ex+vivo+functional+testing+of+two+retinas+by+in+vivo+electroretinogram+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52855(2015).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeckenlively%2C+JR+%22Principles+and+Practice+of+Clinical+Electrophysiology+of+Vision%22">Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision</a>. , MIT Press. (2006).</li>
<li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Research. 101, 108-117 (2014).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+the+fast+and+slow+components+of+P3+of+the+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).</li>
<li>Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbas%2C+F+%22Nature%22">Nature</a>. , (2022).</li>
<li>Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+photoreceptors%3A+Mechanisms+underlying+changes+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function.</a> Visual Neuroscience. 37, (2020).</li>
<li>Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+of+light+on+the+retina%3A+Translation+and+commentary+of+Holmgren+%281866%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866).</a> Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161 (3840), 487-489 (1968).</li>
<li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).</li>
<li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).</li>
<li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+%28Rana+temporaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).</li>
<li>Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+phototransduction+and+light+signal+transmission+during+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open+Diabetes+Research+and+Care%22%5BJournal%5D)">Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes.</a> BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571(2020).</li>
<li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration%3A+retinal+tissue+as+a+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).</li>
<li>Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibiting+glutamine+synthetase+and+blocking+glutamate+uptake+on+b-wave+generation+in+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina.</a> Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Pierwotnie opracowany w 1865 roku przez Holmgrena do pomiaru reakcji siatkówki na światło z siatkówki10, ograniczenia techniczne początkowo uniemożliwiały powszechne stosowanie ERG. Niemniej jednak nowatorskie badania przeprowadzone przez Ragnara Granita i innych zidentyfikowały komórkowe pochodzenie ERG i zmierzyły odpowiedzi fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON ex vivo 11,12,13. Od tego c...

Elektroretinografia mierzy funkcję siatkówki w odpowiedzi na światło1. Jest to integralna część badania fizjologii i patofizjologii siatkówki oraz mierzenia skuteczności terapii chorób siatkówki. ERG in vivo jest szeroko stosowany do oceny funkcji siatkówki w nienaruszonych organizmach, ale ma istotne ograniczenia2,3. Wśród nich analiza ilościowa poszczególnych typów komórek siatkówki w ERG in vivo jest utrudniona, ponieważ rejestruje sumę potencjalnych zmian, a tym samym nakładających się odpowiedzi, ze wszystkich komórek siatkówki na bodźce świetlne4. Co więcej, nie pozwala łatwo na dodawanie leków do siatkówki, jest podatny na wpływy ogólnoustrojowe i ma stosunkowo niski stosunek sygnału do szumu. Wady te zostały wyeliminowane w ERG ex vivo, który bada funkcję izolowanej siatkówki 2,3,5,6. ERG ex vivo umożliwia rejestrację dużych i stabilnych odpowiedzi ze strony określonych typów komórek siatkówki poprzez dodanie inhibitorów farmakologicznych i łatwą ocenę środków terapeutycznych, które można dodać do superfusatu. Jednocześnie usuwa wpływy o działaniu ogólnoustrojowym i eliminuje szumy fizjologiczne (np. bicie serca czy oddech).
W ERG ex vivo, próbki siatkówki lub siatkówki są izolowane i montowane fotoreceptorem do góry na kopule posiadacza próbki3,5. Uchwyt próbki jest montowany, podłączany do systemu perfuzyjnego, który zaopatruje siatkówkę w podgrzane, natlenione media, i umieszczany na stoliku mikroskopu, który został zmodyfikowany tak, aby dostarczał sterowane komputerowo bodźce świetlne. Aby zarejestrować reakcje wywołane przez światło, uchwyt próbki jest podłączony do wzmacniacza, digitizera i systemu nagrywania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Technika ta pozwala na izolację odpowiedzi z fotoreceptorów pręcików i czopków, komórek dwubiegunowych ON i gleju Müllera poprzez zmianę parametrów bodźców świetlnych i dodanie środków farmakologicznych.
Istniejący układ patch clamp lub wieloelektrodowy (MEA) może zostać przekształcony w zapis ERG ex vivo, albo w połączeniu z dostępnym na rynku adapterem ERG ex vivo, albo z niestandardowym uchwytem na próbki z poliwęglanu (CNC), do pomiaru reakcji na światło w siatkówkach od małych modeli zwierzęcych, takich jak myszy. Modyfikacja ta zwiększa dostępność ERG ex vivo, jednocześnie minimalizując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu. Konstrukcja uchwytu na próbkę upraszcza technikę montażu i integruje elektrody, eliminując potrzebę manipulowania mikroelektrodami w porównaniu z wcześniej opisanymi metodami transsiatkówkowymi ex vivo ERG7. Szybkość perfuzji i temperatura wewnątrz uchwytu próbki są ważnymi czynnikami, które wpływają na właściwości odpowiedzi fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON. Dostosowując te warunki, ERG ex vivo może być niezawodnie rejestrowany z izolowanej siatkówki myszy przez dłuższy czas. Zoptymalizowane warunki eksperymentalne pozwalają na zapisy ex vivo ERG w przekłuciach siatkówki z większych siatkanek, w tym dużych oczu zwierzęcych i ludzkich oczu dawcy8.

<table><tbody><tr><td>Gniazdo 2 mm</td><td>WPI</td><td>2026-10</td><td>materiały do przygotowania elektrody</td></tr><tr><td>Ag/AgCl Elektroda</td><td>World Precision Instruments</td><td>EP1</td><td>materiały do przygotowania elektrody</td></tr><tr><td>Medium Amesa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420</td><td>podłoże perfuzyjne</td></tr><tr><td>chlorek baru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0750</td><td>bloker kanału potasowego</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris</td><td>0101</td><td>antagonista glutaminergiczny o szerokim spektrum</td></tr><tr><td>działania OcuScience Ex Vivo ERG Adapter</td><td>OcuScience</td><td>n/a</td><td>ex vivo ERG uchwyt na próbki Gwintowane</td></tr><tr><td>złącze luer</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K222 lub 51525K223</td><td>materiały do przygotowania elektrody</td></tr></tbody></table>

optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Pomiary reakcji na światło neuronów siatkówki są kluczowe dla badania fizjologii zdrowej siatkówki, określania patologicznych zmian w chorobach siatkówki i testowania interwencji terapeutycznych. Elektroretinogram ex vivo (ERG) umożliwia ilościowe określenie udziału poszczególnych typów komórek w izolowanej siatkówce poprzez dodanie określonych środków farmakologicznych i ocenę zmian wewnątrztkankowych niezależnie od wpływów ogólnoustrojowych. Reakcje świetlne siatkówki można mierzyć za pomocą specjalistycznego uchwytu na próbki ERG ex vivo i zestawu do rejestrowania, zmodyfikowanego na podstawie istniejącego zacisku krosowego lub zestawu mikroelektrod. W szczególności badania nad komórkami dwubiegunowymi ON, ale także nad fotoreceptorami, były utrudnione przez powolny, ale postępujący spadek odpowiedzi na światło w ERG ex vivo w czasie. Zwiększona szybkość perfuzji i regulacja temperatury perfuzatu poprawiają funkcję siatkówki ex vivo oraz maksymalizują amplitudę i stabilność odpowiedzi. ERG ex vivo w unikalny sposób pozwala na badanie poszczególnych typów komórek neuronalnych siatkówki. Ponadto ulepszenia mające na celu maksymalizację amplitudy odpowiedzi i stabilności umożliwiają badanie reakcji świetlnych w próbkach siatkówki pochodzących od dużych zwierząt, a także w ludzkich oczach dawcy, dzięki czemu ERG ex vivo jest cennym dodatkiem do repertuaru technik stosowanych do badania funkcji siatkówki.

Ex vivo ERG umożliwia rejestrację powtarzalnych i stabilnych odpowiedzi świetlnych fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych typu ON, na przykład z siatkówki myszy (Rysunek 2A-C). Rejestracja odpowiedzi fotoreceptorów z siatkówek ludzkich dawców jest możliwa przy opóźnieniu enukleacji do 5 h po śmierci (Rysunek 2D), natomiast odpowiedzi komórek dwubiegunowych typu ON przy opóźnieniu enukleacji &lt;20 min (<strong class="x...

Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Protokół ten pokazuje warunki potrzebne do utrzymania funkcji siatkówki w ERG ex vivo, w szczególności niezwykle wrażliwego załamka B wytwarzanego przez komórki ON-bipolarne. Dzięki ERG ex vivo możemy mierzyć funkcję różnych typów neuronów siatkówki z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, umożliwiając jednocześnie łatwe wprowadzenie środków farmakologicznych. Metoda ta jest szczególnie podatna na ilościowe określanie skuteczności środków farmakologicznych w odniesieniu do funkcji siatkówki i choroby.Aby rozpocząć, przekształć konfigurację wieloelektrodową, podłączając uchwyt próbki ERG ex vivo do wzmacniacza różnicowego za pośrednictwem stopnia głównego. Wzmacniacz musi być podłączony do wejścia analogowego płytki interfejsu systemu wieloelektrodowego. Użyj oprogramowania rejestrującego dla matrycy wieloelektrodowej, aby rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo.Ustaw wzmocnienie wzmacniacza różnicowego na 100 i dodaj dodatkowe 10-krotne wzmocnienie napięcia, w zależności od specyfikacji digitizera. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 herców. Alternatywnie, aby przekształcić konfigurację zacisku krosowego, podłącz uchwyt próbki ERG ex vivo przez stopień czołowy do wzmacniacza różnicowego amplifier, który musi być podłączony do stopnia czołowego wzmacniacza zacisku krosowego.Za pomocą oprogramowania systemu zacisków krosowych i digitizera można rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo. Ustaw parametry, jak pokazano wcześniej. Podłącz diody LED o odpowiednich długościach fal do mikroskopu.Do sterowania bodźcami świetlnymi służy sterownik LED sterowany wyjściami analogowymi z digitizera. Steruj diodami LED za pomocą oprogramowania do nagrywania, które umożliwi wyzwalanie bodźców świetlnych. Następnie skalibruj strumień świetlny diod LED w pozycji siatkówki w uchwycie próbki za pomocą fotodiody.W razie potrzeby włóż filtry o neutralnej gęstości, aby przyciemnić natężenie światła na ścieżce światła. Aby przygotować elektrodę, włóż elektrodę z chlorkiem srebra i srebra do gwintowanego łącznika przynęty. Wypełnij wnętrze łącznika przynęty gorącym klejem i włóż dwumilimetrowe gniazdo do gorącego kleju od strony niegwintowanej.srebrny drut elektrody EP-1 do dwumilimetrowego gniazda. Wkręć gotową elektrodę z O-ringiem na gwincie w porty elektrod uchwytu na próbki ERG ex vivo. W przypadku dużych oczu, w tym oczu dawcy ludzkiego, oczyść gałkę z pozostałej tkanki łącznej i usuń przedni odcinek i soczewkę.Użyj skalpela, aby wykonać cięcie około trzech milimetrów od rąbka. Włóż zakrzywione nożyczki preparacyjne do nacięcia i przetnij wzdłuż rąbka, aby usunąć przednią część oka z soczewką. Uzyskaj próbki siatkówki do elektroretinografii ex vivo za pomocą jednorazowego stempla do biopsji o grubości od trzech do sześciu milimetrów.Aby zamontować tkankę na uchwycie na próbkę, umieść dolną połowę uchwytu próbki na dużej szalce Petriego i napełnij ją natlenioną pożywką Amesa tak, aby kopuła uchwytu próbki była po prostu zanurzona. Ostrożnie chwyć krawędź siatkówki cienkimi kleszkami i przenieś siatkówkę na kopułę uchwytu próbki ex vivo, stroną fotoreceptorową skierowaną do góry. Podnieś uchwyt próbki z roztworu Amesa, uważając, aby siatkówka pozostała na swoim miejscu.Całkowicie wysusz płytkę uchwytu próbki, aby zminimalizować szumy, przesłuchy elektryczne i bocznik sygnału. Następnie zmontuj obie połówki uchwytu próbki za pomocą czterech i podłącz linię perfuzyjną. Wbić elektrodę w dolną połowę uchwytu próbki i podłączyć anodowy do wewnętrznej strony siatkówki, a katodowy do strony fotoreceptora.Utrzymuj uchwyt próbki z co najmniej jednym mililitrem na minutę natlenionej pożywki Amesa przez 10 do 20 minut, aby umożliwić stabilizację reakcji świetlnych. ERG ex vivo umożliwiło rejestrację reakcji na światło fotoreceptorów i komórek bipolarnych ON z siatkówki myszy. Rejestracja odpowiedzi fotoreceptorów z ludzkich siatkówek dawcy była możliwa z pięciogodzinnym opóźnieniem wyłuszczenia pośmiertnym i mniejszym niż 20 minut opóźnieniem w przypadku odpowiedzi komórek dwubiegunowych ON.W idealnych warunkach amplituda odpowiedzi i kinetyka w obu typach komórek były stosunkowo stabilne w czasie, ale wykazywały powolny spadek od 40 do 45 minut po zamontowaniu siatkówki na uchwycie próbki. Obniżona temperatura w uchwycie próbki znacznie spowolniła kinetykę zarówno fotoreceptorów, jak i komórek bipolarnych ON. Zmniejszyło to jednak amplitudę fali B, ale nie fali A.I odwrotnie, spowolnienie szybkości perfuzji zmniejszyło amplitudy zarówno odpowiedzi fotoreceptorów, jak i komórek dwubiegunowych ON, ale nie wpłynęło na utajony czas załamka A lub B. Przerwanie perfuzji na 10 minut, a następnie reperfuzja spowodowała całkowitą utratę funkcji komórek ON-dwubiegunowych z zachowanymi odpowiedziami fotoreceptorów. Wystarczająca prędkość perfuzji i temperatura fizjologiczna mają kluczowe znaczenie dla uzyskania stabilnych odpowiedzi, w szczególności z komórek bipolarnych ON-bipolarnych w ERG ex vivo.Protokół ten pozwala na dogłębne zbadanie różnic w funkcji fotoreceptorów w ludzkiej plamce żółtej i na obrzeżach, odpowiadając na pytania, które wcześniej można było przeprowadzić tylko u naczelnych innych niż ludzie.

optimizing-setup-conditions-for-ex-vivo-electroretinogram-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Dzięki temu badaniu wprowadzamy standaryzowany model stresu dla izolowanej superkrwistej siatkówki bydlęcej do przyszłych przedklinicznych testów terapeutycznych. Oceniano wpływ hipoksji (czysty N2) lub stresu glutaminianu (250 μM glutaminianu) na funkcję siatkówki reprezentowaną przez amplitudy załamków a i b.

Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

Elektroretinogram (ERG) to potencjał elektryczny generowany przez siatkówkę w odpowiedzi na światło. W artykule opisano, w jaki sposób można wykorzystać ERG do oceny funkcji siatkówki u szczurów przystosowanych do ciemności oraz jak można go wykorzystać do oceny interwencji neuroprotekcyjnej, w tym przypadku zdalnego warunkowania niedokrwiennego.

Wykorzystanie elektroretinogramu do oceny funkcji siatkówki gryzoni i ochronnych skutków warunkowania wstępnego niedokrwiennego kończyn na odległość

Ex vivo ERG może być używany do rejestrowania aktywności elektrycznej komórek siatkówki bezpośrednio z izolowanych nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, jak powszechne systemy ERG in vivo można dostosować do zapisów ERG ex vivo w celu zbadania aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Przestrzeganie międzynarodowych standardów i utrzymanie adaptacji siatkówki do ciemności jest niezbędne do uzyskania prawidłowych odpowiedzi na elektroretinogram w pełnym polu w diagnostyce i leczeniu dziedzicznych chorób siatkówki. Dostępny jest praktyczny protokół wykorzystujący przenośną ciemnię w celu uzyskania  pełnopolowy elektroretinogram dla niemowląt i dzieci w sedacji lub znieczuleniu ogólnym na sali operacyjnej.

Zapis elektroretinogramu dla niemowląt i dzieci pod narkozą w celu osiągnięcia optymalnej adaptacji do ciemności i międzynarodowych standardów

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Poznaj protokół elektroretinografii ex vivo do badania funkcji komórek ON-bipolarnych i fotoreceptorów siatkówki. Metoda umożliwia precyzyjną analizę farmakologiczną w modelach mysich i ludzkich.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Przeglądaj więcej filmów