Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach
27 czerwca 2022
Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.
Protokół ten pokazuje warunki potrzebne do utrzymania funkcji siatkówki w ERG ex vivo, w szczególności niezwykle wrażliwego załamka B wytwarzanego przez komórki ON-bipolarne. Dzięki ERG ex vivo możemy mierzyć funkcję różnych typów neuronów siatkówki z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, umożliwiając jednocześnie łatwe wprowadzenie środków farmakologicznych. Metoda ta jest szczególnie podatna na ilościowe określanie skuteczności środków farmakologicznych w odniesieniu do funkcji siatkówki i choroby.
Aby rozpocząć, przekształć konfigurację wieloelektrodową, podłączając uchwyt próbki ERG ex vivo do wzmacniacza różnicowego za pośrednictwem stopnia głównego. Wzmacniacz musi być podłączony do wejścia analogowego płytki interfejsu systemu wieloelektrodowego. Użyj oprogramowania rejestrującego dla matrycy wieloelektrodowej, aby rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo.
Ustaw wzmocnienie wzmacniacza różnicowego na 100 i dodaj dodatkowe 10-krotne wzmocnienie napięcia, w zależności od specyfikacji digitizera. Ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 herców. Alternatywnie, aby przekształcić konfigurację zacisku krosowego, podłącz uchwyt próbki ERG ex vivo przez stopień czołowy do wzmacniacza różnicowego amplifier, który musi być podłączony do stopnia czołowego wzmacniacza zacisku krosowego.
Za pomocą oprogramowania systemu zacisków krosowych i digitizera można rejestrować i przechowywać dane wejściowe z ERG ex vivo. Ustaw parametry, jak pokazano wcześniej. Podłącz diody LED o odpowiednich długościach fal do mikroskopu.
Do sterowania bodźcami świetlnymi służy sterownik LED sterowany wyjściami analogowymi z digitizera. Steruj diodami LED za pomocą oprogramowania do nagrywania, które umożliwi wyzwalanie bodźców świetlnych. Następnie skalibruj strumień świetlny diod LED w pozycji siatkówki w uchwycie próbki za pomocą fotodiody.
W razie potrzeby włóż filtry o neutralnej gęstości, aby przyciemnić natężenie światła na ścieżce światła. Aby przygotować elektrodę, włóż elektrodę z chlorkiem srebra i srebra do gwintowanego łącznika przynęty. Wypełnij wnętrze łącznika przynęty gorącym klejem i włóż dwumilimetrowe gniazdo do gorącego kleju od strony niegwintowanej.
srebrny drut elektrody EP-1 do dwumilimetrowego gniazda. Wkręć gotową elektrodę z O-ringiem na gwincie w porty elektrod uchwytu na próbki ERG ex vivo. W przypadku dużych oczu, w tym oczu dawcy ludzkiego, oczyść gałkę z pozostałej tkanki łącznej i usuń przedni odcinek i soczewkę.
Użyj skalpela, aby wykonać cięcie około trzech milimetrów od rąbka. Włóż zakrzywione nożyczki preparacyjne do nacięcia i przetnij wzdłuż rąbka, aby usunąć przednią część oka z soczewką. Uzyskaj próbki siatkówki do elektroretinografii ex vivo za pomocą jednorazowego stempla do biopsji o grubości od trzech do sześciu milimetrów.
Aby zamontować tkankę na uchwycie na próbkę, umieść dolną połowę uchwytu próbki na dużej szalce Petriego i napełnij ją natlenioną pożywką Amesa tak, aby kopuła uchwytu próbki była po prostu zanurzona. Ostrożnie chwyć krawędź siatkówki cienkimi kleszkami i przenieś siatkówkę na kopułę uchwytu próbki ex vivo, stroną fotoreceptorową skierowaną do góry. Podnieś uchwyt próbki z roztworu Amesa, uważając, aby siatkówka pozostała na swoim miejscu.
Całkowicie wysusz płytkę uchwytu próbki, aby zminimalizować szumy, przesłuchy elektryczne i bocznik sygnału. Następnie zmontuj obie połówki uchwytu próbki za pomocą czterech i podłącz linię perfuzyjną. Wbić elektrodę w dolną połowę uchwytu próbki i podłączyć anodowy do wewnętrznej strony siatkówki, a katodowy do strony fotoreceptora.
Utrzymuj uchwyt próbki z co najmniej jednym mililitrem na minutę natlenionej pożywki Amesa przez 10 do 20 minut, aby umożliwić stabilizację reakcji świetlnych. ERG ex vivo umożliwiło rejestrację reakcji na światło fotoreceptorów i komórek bipolarnych ON z siatkówki myszy. Rejestracja odpowiedzi fotoreceptorów z ludzkich siatkówek dawcy była możliwa z pięciogodzinnym opóźnieniem wyłuszczenia pośmiertnym i mniejszym niż 20 minut opóźnieniem w przypadku odpowiedzi komórek dwubiegunowych ON.
W idealnych warunkach amplituda odpowiedzi i kinetyka w obu typach komórek były stosunkowo stabilne w czasie, ale wykazywały powolny spadek od 40 do 45 minut po zamontowaniu siatkówki na uchwycie próbki. Obniżona temperatura w uchwycie próbki znacznie spowolniła kinetykę zarówno fotoreceptorów, jak i komórek bipolarnych ON. Zmniejszyło to jednak amplitudę fali B, ale nie fali A.
I odwrotnie, spowolnienie szybkości perfuzji zmniejszyło amplitudy zarówno odpowiedzi fotoreceptorów, jak i komórek dwubiegunowych ON, ale nie wpłynęło na utajony czas załamka A lub B. Przerwanie perfuzji na 10 minut, a następnie reperfuzja spowodowała całkowitą utratę funkcji komórek ON-dwubiegunowych z zachowanymi odpowiedziami fotoreceptorów. Wystarczająca prędkość perfuzji i temperatura fizjologiczna mają kluczowe znaczenie dla uzyskania stabilnych odpowiedzi, w szczególności z komórek bipolarnych ON-bipolarnych w ERG ex vivo.
Protokół ten pozwala na dogłębne zbadanie różnic w funkcji fotoreceptorów w ludzkiej plamce żółtej i na obrzeżach, odpowiadając na pytania, które wcześniej można było przeprowadzić tylko u naczelnych innych niż ludzie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół poprawy metod rejestracji elektroretinogramu (ERG) ex vivo w celu badania funkcji neuronów siatkówki. Podejście koncentruje się na komórkach dwubiegunowych ON i funkcjonalności fotoreceptorów przy użyciu różnych konfiguracji, zapewniając wgląd w farmakologiczne efekty na siatkówce w stanie zdrowia i choroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauki
- Biologia siatkówki
Tło
- Wyzwania w efektywnym rejestrowaniu funkcji siatkówki w ustawieniach ex vivo.
- Znaczenie komórek dwubiegunowych ON i fotoreceptorów w zdrowiu i chorobie siatkówki.
- Potrzeba niezawodnych metod do ilościowej oceny interwencji farmakologicznych.
- Istniejące techniki często brakuje dostępności i precyzji.
Cel badania
- Poprawa rejestracji reakcji siatkówki na światło za pomocą zmodyfikowanego sprzętu.
- Ułatwienie analizy funkcjonalności fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON.
- Ocena reakcji farmakologicznych w komórkach siatkówki.
Stosowane metody
- Protokół wykorzystuje ex vivo ERG z wykorzystaniem wieloelektrodowych tablic lub systemów patch clamp.
- Jako modele biologiczne wykorzystywane są siatkówki myszy i ludzkich dawczyń.
- Każda konfiguracja obejmuje kluczowe parametry dotyczące wzmacniania i filtrowania, aby zapewnić dokładne rejestracje.
- Podkreśla się znaczenie utrzymania temperatury i szybkości perfusji podczas eksperymentu.
- Kalibracja wyjść świetlnych za pomocą fotodiod jest kluczowa dla kontrolowanej stymulacji.
Główne wyniki
- Ulepszone metody pozwalają na stabilne rejestracje zarówno od fotoreceptorów, jak i komórek dwubiegunowych ON.
- Reakcje pozostają spójne, z niewielkimi spadkami obserwowanymi po dłuższym czasie montażu.
- Temperatura i szybkość perfusji znacząco wpływają na amplitudę odpowiedzi, szczególnie fali B.
- Wyniki wyjaśniają różnice w funkcji fotoreceptorów w różnych rejonach ludzkiej siatkówki.
Wnioski
- To badanie pokazuje niezawodną metodę badania funkcji neuronów siatkówki.
- Ulepszona dostępność pozwala na zaawansowane badania farmakologiczne istotne dla zdrowia siatkówki.
- Wyniki zwiększają zrozumienie mechanizmów neuronowych i potencjalnych interwencji w chorobach siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
