Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Metoda ta zapewnia szybkie, wysokoprzepustowe wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami powlekania skraca czas potrzebny do ilościowego określenia przylegających bakterii. Ta technika jest zautomatyzowana, oszczędza czas i jest bardzo powtarzalna.

Jest również szeroko stosowany zarówno do większości komórek gospodarza. Ta metoda jest bardzo prosta. W przypadku pierwszej próby należy zoptymalizować warunki, takie jak mnogość infekcji, a także czas koinkubacji bakterii gospodarza.

Najpierw zbierz kultury bakterii w fazie wykładniczej przez odwirowanie w temperaturze 13 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po umyciu palety komórek jednym mililitrem PBS, ponownie zasmuś paletę bakteryjną w jednym mililitrowym PBS. Określ stężenia zawiesiny bakteryjnej, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach.

Następnie, w celu zabarwienia zawiesiny bakteryjnej, dodaj dwa mikrolitry 500-krotnie skoncentrowanego zielonego lub czerwonego barwnika barwiącego do jednego mililitra zawiesiny bakteryjnej, aby rozcieńczyć barwnik jednokrotnie. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatnym obracaniem w ciemności. Po 30 minutach odwirować wybarwione bakterie w temperaturze 13 000 razy G przez dwie minuty i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.

Zebrać poplamione komórki bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 13 000 razy G przez dwie minuty. Zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki F12 K i zmierzyć gęstość optyczną każdej kultury przy 600 nanometrach. Następnie rozcieńczyć kultury do pożądanych stężeń w oparciu o liczbę infekcji i stężenie komórek gospodarza.

W celu przeprowadzenia testu przylegania bakterii należy trzykrotnie przemyć wcześniej wyhodowane warstwy mono komórek A549, dodając 100 mikrolitrów ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie pipetować w górę iw dół. Następnie odrzuć PBS. Alternatywnie, po dodaniu PBS, odczekaj 10 sekund, a następnie usuń PBS za pomocą próżni.

Aby określić kinetykę asocjacji bakteryjnej, należy nałożyć na komórki 100 mikrolitrów pożądanych stężeń zawiesiny bakteryjnej o różnej wielokrotności infekcji. Zakręć bakterie i inkubuj zainfekowane komórki A549 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dodatkową godzinę. Usuń niezwiązane bakterie, przemywając monowarstwy pięciokrotnie ciepłym PBS, jak pokazano.

Następnie napraw komórki, dodając 100 mikrolitrów 4% formaldehydu do wszystkich dołków 96-dołkowej płytki na lodzie. Po 15 minutach umyj płytkę trzykrotnie PBS, aby usunąć roztwór utrwalający. Zabarwić jądra barwieniem DAPI w ilości 50 nanogramów na mililitr przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po umyciu komórek PBS przykryj zainfekowane komórki A549 100 mikrolitrami PBS, aby uniknąć wysuszenia, a następnie przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch dni w ciemności lub przystąp do obrazowania. Aby zachować integralność danych, losowo i ręcznie wybierz pięć lokalizacji każdej studzienki, aby uchwycić obrazy w 20-krotnym powiększeniu. Uchwyć obrazy fluorescencyjne bakterii pod kanałami GFP, komórki A549 pod DAPI, a dla bakterii wybarwionych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym użyj pięciokanałowego PE Si.

Ustaw parametry toczącej się kuli do wygładzania i automatycznie mierz funkcję rozrzutu punktowego dekonwolucji obrazu w oparciu o cel uzyskania lepszej rozdzielczości. Zmierz intensywność fluorescencji komórek gospodarza i bakterii. Ustaw najsłabszą intensywność fluorescencji komórek gospodarza i bakterii jako progi liczby komórek i policz wszystkie bakterie znajdujące się najbliżej komórki gospodarza w odległości 15 mikrometrów jako bakterie przylegające.

Po zliczeniu komórek ze wszystkich zautomatyzowanych obrazów przeanalizuj krytyczne odczyty, takie jak liczba komórek gospodarza, rozmiary i kształty komórek, całkowita liczba bakterii oraz średni udział bakterii na komórkę gospodarza, który jest najważniejszym wskaźnikiem określającym przyleganie bakterii. Po jednej godzinie koinkubacji szczep Pseudomonas aeruginosa PAO1 przylegał do komórek A549 w sposób zależny od dawki. Podobne wyniki zaobserwowano również w przypadku bakterii Gram-dodatnich Listeria monocytogenes i jej kontroli ujemnej Bacillus subtilis.

Reprezentatywny obraz segmentacji P aeruginosa przylegającej do gospodarza pokazuje łatwość zliczania komórek bakteryjnych przy użyciu tego protokołu. Wyniki zautomatyzowanych analiz obejmują liczbę komórek bakteryjnych i gospodarza, średnią liczbę bakterii na komórkę gospodarza oraz rozmiary komórek gospodarza i obszary reprezentujące stan zdrowia komórek gospodarza, poziom przylegania bakterii i toksyczność cytotoksyczności bakteryjnej. Oprócz komórek A549 przetestowano również HUVEC pod kątem testu adhezji.

Serratia rubidaea i Streptococcus agalactiae były przylegające do HUVEC, ale nie do komórek A549, co świadczy o skutecznym wykrywaniu i przydatności wielu gospodarzy do badania interakcji bakterii gospodarza przy użyciu tej metody. Komórki gospodarza powinny osiągnąć około 90 do 100% zbieżności, aby zminimalizować niepożądane przyleganie bakterii do dna studzienek. Technika ta pozwoli naukowcom na zbadanie nowych mechanizmów, czyli interakcji między gospodarzem a szkodnikiem.