Name: Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowego wykrywania przylegania bakterii do komórek gospodarza. Technika ta znacząco skraca czas ręcznej pracy i poprawia powtarzalność wyników w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Kaite Zlotkowski z Biotek Inc. za ich wsparcie techniczne. Dziękujemy również dr Lori Burrows z McMaster University za hojny dar w postaci szczepów Pseudomonas. Prace te były wspierane przez Departament Obrony w ramach kontraktu numer W911NF1920013 z PdF; Agencja Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA) i Departament Spraw Wewnętrznych na podstawie umowy nr 140D6319C0029 z PdF. Treść informacji niekoniecznie odzwierciedla stanowisko lub politykę rządu i nie należy wnioskować o oficjalnym poparciu.

1. Hodowla komórkowa A549
<ol>
	<li>Utrzymać linię komórkową A549 w pożywce F-12K uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3-4 dni i przechodź w tempie 85%-95% zbiegu.</li>
	<li>Krótko przepłukać komórki 1 x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4, chyba że wskazano inaczej) i potraktować 1 ml 0,25% roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 0,25% trypsyny-0,53 mM (zanurzając warstwę komórkową) przez około 2 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 6 ml kompletnej pożywki wzrostowej (pożywka F-12K + 10% FBS), aby zatrzymać aktywność proteazy. Następnie umieść komórki w sterylnej kolbie do hodowli tkankowych polistyrenu T-75 w stosunku do subkultywacji 1:3-1:8. Ostateczna objętość kultury to 12 ml.</li>
	<li>Wysiewać około 1 x 104 komórek A549 (stężenie komórek: ~1 x 105 komórek/ml) na każdym dołku 96-dołkowej płytki na dzień przed testami przylegania.</li>
</ol>
2. Rozwój i barwienie bakterii
<ol>
	<li>Wykonuj wszystkie prace bakteryjne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.</li>
	<li>Zaszczepić wszystkie kultury bakterii, w tym P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes i B. subtilis itp., z zamrożonego glicerolu i hodować je w tryptycznym bulionie sojowym (TSB, 3 ml) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc utrzymywaną na poziomie 250 obr./min.</li>
	<li>Następnego dnia użyj rozcieńczenia 1:100 nocnej kultury, aby zaszczepić subkulturę i hoduj ją w TSB (1 ml) przez 3 godziny do fazy wykładniczej, zmierz OD przy 600 nm (OD600), aby potwierdzić. Upewnij się, że OD600 mieści się w zakresie 0,4-0,6.</li>
	<li>Przed wykonaniem testu przylegania bakterii do gospodarza, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej na płytkach agarowych TSB, inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie ustalić bakteryjne CFU na podstawie liczby kolonii. Dla P. aeruginosa OD600 1,0 odpowiada 2 x 108 żywotnym komórkom bakteryjnym/ml, a dla L. monocytogenes OD600 1,0 odpowiada 9 x 108 żywotnych komórek bakteryjnych/ml.</li>
	<li>Zbierz kultury bakteryjne w fazie wykładniczej przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj je raz za pomocą 1x PBS (1 ml). Zawiesić granulki bakteryjne w 1 ml 1x PBS i oznaczyć stężenia, mierząc OD600 zawiesin bakteryjnych. Na przykład P. aeruginosa z OD600 0,5 reprezentuje stężenie 1 x 108 komórek bakteryjnych/ml.</li>
	<li>Zawiesinę bakteryjną należy zabarwić zielonym lub czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie obracając w ciemności. W tym celu dodaj 2 μl 500-krotnie skoncentrowanego barwnika barwiącego do 1 ml zawiesiny bakteryjnej, aby rozcieńczyć barwnik 1-krotnie. Aby zmyć barwnik barwiący, odwirować zabarwione bakterie przy 13 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS trzy razy. 
	UWAGA: Jeśli w eksperymencie używane są bakterie oznaczone fluorescencją (GFP, RFP, mCherry itp.), pomiń ten etap barwienia bakteryjnego. W protokole tym zastosowano P. aeruginosa znakowane GFP i L. monocytogenes barwione barwnikiem czerwonym fluorescencyjnie.</li>
	<li>Zebrać barwione komórki bakteryjne lub bakterie oznaczone GFP przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 2 minuty. Ponownie zawiesić w świeżej pożywce F-12K (1 ml) i zmierzyć OD600 każdej kultury. Następnie rozcieńczyć kultury do pożądanych stężeń w oparciu o wielokrotność infekcji (MOI) i stężenie komórek gospodarza. Końcowa objętość użyta w tym eksperymencie to 500 μL. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli stężenie komórek gospodarza zliczone za pomocą barwienia błękitem trypanowym wynosi 1 x 105 komórek/ml, pożądane stężenie komórek bakteryjnych przy MOI 100 wyniesie 1 x 107 komórek/ml. Stężenie P. aeruginosa przy 0,5 OD600 wynosi 1 x 108/mL. Aby uzyskać pożądane stężenie, rozcieńczyć kulturę P. aeruginosa 10-krotnie, dodać 50 μl zawieszonej kultury do 450 μl świeżej pożywki F-12K.</li>
</ol>
3. Przyleganie bakterii i barwienie komórek gospodarza
<ol>
	<li>Najpierw umyj monowarstwy komórek A549 z nasionami trzy razy ciepłym 1x PBS. Do każdego prania dodaj 100 μl 1x PBS do każdego dołka, delikatnie pipetuj w górę i w dół trzy razy, wyrzuć 1x PBS lub odczekaj 10 s po dodaniu, a następnie odkurz, aby usunąć 1x PBS. Aby określić kinetykę asocjacji bakteryjnej, należy nałożyć na komórki 100 μl pożądanych stężeń zawiesiny bakteryjnej o różnych MOI (0, 1, 10 i 100). Wirować bakterie w temperaturze 200 x g przez 10 minut i inkubować zakażone komórki A549 w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 1 h. 
	UWAGA: W tym eksperymencie każdy warunek miał techniczną trójkę.</li>
	<li>Usuń niezwiązane bakterie, myjąc monowarstwy pięciokrotnie ciepłym 1x PBS, jak opisano powyżej. Dodaj 100 μl 4% formaldehydu (w 1x PBS) do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek, aby utrwalić komórki. Pozostaw płytki na lodzie na 15 minut, a następnie zmyj roztwór utrwalający za pomocą 1x PBS trzy razy.</li>
	<li>Aby wybarwić jądra, dodać 50 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i inkubować go przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć studzienki trzykrotnie za pomocą 1x PBS. Przykryj zainfekowane komórki A549 100 μl 1x PBS, aby uniknąć wysuszenia. Przygotuj się do następnego kroku lub przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 dni w ciemności.</li>
</ol>
4. Automatyczne obrazowanie, przetwarzanie i analiza fluorescencji
<ol>
	<li>Aby zachować integralność danych, losowo i ręcznie wybierz pięć lokalizacji każdej studni, aby uchwycić obrazy w 20-krotnym powiększeniu. Uchwyć fluorescencyjne obrazy komórek A549 i bakterii odpowiednio w kanałach DAPI i GFP. Użyj kanału PE-Cy5 dla bakterii wybarwionych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Aby uzyskać lepszą rozdzielczość, przetwórz wszystkie obrazy pod kątem spłaszczania tła i dekonwolucji. Ustaw parametry jako średnicę toczącej się kuli 68 μm w celu wygładzenia i automatycznie zmierz funkcję rozproszenia punktowego (PSF) dekonwolucji obrazu w oparciu o obiektyw.</li>
	<li>Aby policzyć wszystkie kwalifikujące się komórki i bakterie, zmierz intensywność fluorescencji komórek gospodarza i bakterii i ustaw najsłabszą intensywność fluorescencji komórek gospodarza i bakterii jako progi liczby komórek. Policz wszystkie bakterie znajdujące się w pobliżu komórki gospodarza w odległości 15 μm jako bakterie przylegające, ponieważ średnica komórki A549 wynosi 10,59-14,93 μm21, 
	UWAGA: Domyślne ustawienie w systemie obrazowania selektywnie zlicza komórki gospodarza o średnicy od 5 do 100 μm i bakterie o wielkości (szerokości i długości) od 0,2 do 5 μm.</li>
	<li>Opierając się na wyżej wymienionych wynikach ręcznego przetwarzania obrazu, zastosuj parametry wygładzania obrazu, dekonwolucji, rozmiarów obiektów, odległości i intensywności fluorescencji do pozostałych zautomatyzowanych obrazów. Po automatycznej analizie należy wziąć pod uwagę krytyczne odczyty, takie jak całkowita liczba komórek gospodarza, rozmiary i kształty komórek, całkowita liczba bakterii oraz średnia liczba bakterii na komórkę gospodarza, która była najważniejszym wskaźnikiem, aby określić przyleganie bakterii.</li>
	<li>Eksport danych i analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Wyeksportuj przeanalizowane wyniki ze wszystkich obrazów do arkusza kalkulacyjnego (np. w formacie "xlsx"). Zautomatyzowany system generuje dwa zestawy wyników: 1) średnią liczbę przylegających bakterii z każdego obrazu; 2) dane informacyjne każdej pojedynczej komórki gospodarza, takie jak liczba przylegających bakterii w pojedynczej komórce, wielkość gospodarza i średnia intensywność fluorescencji komórki gospodarza i bakterii, z odpowiedniego obrazu.</li>
		<li>Obliczyć średnią liczbę i odchylenie standardowe liczby przylegających bakterii ze wszystkich obrazów, aby przedstawić poziom przylegania bakterii w porównaniu z kontrolami ujemnymi. W tej metodzie E. coli i B. subtilis służyły jako kontrola ujemna w testowaniu odpowiednio przylegania bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Wykonaj dwukierunkowe analizy analizy, aby przetestować znaczną zmienność między punktami danych w całym leczeniu w trzech niezależnych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li>
<li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22M%C3%A9decine+et+Maladies+Infectieuses%22%5BJournal%5D)">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li>
<li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion%3A+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433(2017).</li>
<li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li>
<li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+molecular%2C+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+%28COVID-19%29%2C+a+comprehensive+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094(2020).</li>
<li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine+High+Impact+Case+Reports%22%5BJournal%5D)">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li>
<li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928(2019).</li>
<li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192(2021).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110(2008).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078(2011).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240(2020).</li>
<li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+host+IRE1%CE%B1-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103(2018).</li>
<li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li>
<li>Götz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173(2020).</li>
<li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268(2019).</li>
<li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350(2019).</li>
<li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43(2018).</li>
<li>Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).</li>
<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li>
<li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+Journal+of+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li>
<li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li>
<li>Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+LpeA%2C+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li>
<li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Protokół opisuje zautomatyzowane podejście do liczenia przyczepiania się bakterii do komórek gospodarza. Opisane podejście ma kilka atrakcyjnych zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami. Po pierwsze, podejście to umożliwia precyzyjne określenie ilościowe liczby komórek patogenów drobnoustrojów, które są przyłączone do poszczególnych komórek gospodarza. Co ważne, tę kwantyfikację można przeprowadzić bez konieczności pracochłonnego zbierania bakterii, seryjnego rozcieńczania, powlekania na podłożach stałych i oznacza...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Adhezja bakteryjna to proces, w którym bakterie przyczepiają się do innych komórek lub powierzchni. Pomyślne zapoczątkowanie infekcji przez patogeny bakteryjne wymaga adhezji do komórek gospodarza, kolonizacji tkanek, a w niektórych przypadkach inwazji komórek gospodarza1,2,3. Pojawiające się choroby zakaźne stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, o czym świadczy niedawna pandemia COVID-194,5,6. Co ważne, nowe lub pojawiające się patogeny mogą nie być łatwo rozpoznawalne przy użyciu podejść opartych na genomie, zwłaszcza w przypadkach, gdy patogen został zmodyfikowany tak, aby uniknąć wykrycia lub nie zawiera sygnatur genomowych, które identyfikują go jako patogenny. Dlatego identyfikacja potencjalnych patogenów za pomocą metod, które bezpośrednio oceniają cechy chorobotwórczości, takie jak przyleganie bakterii do komórek gospodarza, może odgrywać kluczową rolę w identyfikacji patogenów.
Bakteryjne przyleganie do komórek gospodarza jest używane do oceny mechanizmów patogenezy bakteryjnej od dziesięcioleci1,7. Obrazowanie mikroskopowe8,9 i liczenie jednostki tworzącej kolonie bakteryjne (CFU)10,11,12,13 metodą posiewu po infekcji to dwie dobrze rozwinięte metody laboratoryjne do badania przylegania drobnoustrojów i/lub infekcji komórek gospodarza14. Biorąc pod uwagę rozmiar komórek bakteryjnych w skali mikrometrowej, zliczanie przylegających komórek bakteryjnych na ogół wymaga użycia zaawansowanych technik mikroskopii o dużym powiększeniu, a także podejść do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, w tym mikroskopii elektronowej, mikroskopii ekspansyjnej (ExM)15,16 i obrazowania trójwymiarowego17. Alternatywnie, wyliczenie bakterii związanych lub zinternalizowanych w komórkach gospodarza można przeprowadzić, posiewając serię rozcieńczeń zebranych bakterii na stałym agarze i licząc wynikowe CFUs10,12,13. Ta metoda jest pracochłonna i obejmuje wiele ręcznych kroków, co wprowadza trudności w ustanowieniu ustandaryzowanej lub zautomatyzowanej procedury wymaganej do analiz o wysokiej przepustowości18,19. W związku z tym opracowanie nowych metod oceny przyłączenia komórek gospodarza rozwiązałoby obecne ograniczenia w tej dziedzinie.
Jedna z takich metod jest opisana tutaj, która wykorzystuje zautomatyzowaną mikroskopię o wysokiej przepustowości, połączoną z wysokoprzepustowym przetwarzaniem obrazów i analizą statystyczną. Aby zademonstrować to podejście, przeprowadzono eksperymenty z kilkoma patogenami bakteryjnymi, w tym Pseudomonas aeruginosa, oportunistycznym patogenem bakteryjnym Gram-ujemnym ludzi, zwierząt i roślin14,20, który często kolonizuje drogi oddechowe pacjentów z upośledzonymi funkcjami obronnymi gospodarza. Takie podejście zoptymalizowało proces obrazowania mikroskopowego opisany w poprzednich badaniach14,20. Wykrywanie obrazowania zostało uproszczone dzięki znakowanym fluorescencyjnie komórkom gospodarza i bakteriom w celu szybkiego śledzenia ich bliskości, co znacznie zmniejszyło obciążenie mikroskopowe w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu rozróżnienia bakterii. Ponadto zautomatyzowana analiza statystyczna obrazów podczas zliczania komórek gospodarza i bakterii zastąpiła ręczny eksperyment z posiewem bakteryjnej CFU w celu oszacowania stosunku liczby przylegających bakterii na komórkę gospodarza. Aby potwierdzić kompatybilność tej metody, przetestowano również wiele szczepów bakteryjnych i typów komórek gospodarza, takich jak Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus i Klebsiella pneumoniae, a także ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), a wyniki potwierdzają różnorodność i skuteczność metody.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>VWR</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td>Barwnik do barwienia komórek gospodarza</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3882</td><td>Połowa powierzchni, płaskie przezroczyste dno</td></tr><tr><td>Komórki A549</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL 185</td><td>Linia komórkowa ssaków</td></tr><tr><td>BactoView Live Red</td><td>Biotium</td><td>40101</td><td>Barwnik do wytrzymywania bakterii</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Śledzenie podziału komórek CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Cytacja 5&nbsp;</td><td>Cytat BioTek</td><td>5&nbsp;</td><td>Czytnik wielotrybowy obrazowania komórek</td></tr><tr><td>Zapasy laboratoryjne E. coli</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw pocisków EGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>HUVEC Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kolekcje EHEC</td><td></td><td></td><td>NIST</td></tr><tr><td>F-12k pożywka</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>302004</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych A549</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>Zapasy laboratoryjne&nbsp;</td></tr><tr><td>L. monocytogenes</td><td></td><td></td><td>Kolekcje NIST</td></tr><tr><td>OD600 DiluPhotometer</td><td>IMPLEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa</td><td></td><td></td><td>Dr. Lori Burrows zapas laboratoryjny</td></tr><tr><td>P. aeruginosa &Delta; pilA</td><td></td><td></td><td>Dr. Lori Burrows, zapasy laboratoryjne</td></tr><tr><td>, S. agalactiae,</td><td></td><td></td><td>kolekcje NIST</td></tr><tr><td>, S. aureus</td><td>BEI</td><td>, NR-46543</td><td></td></tr>, <tr><td>S. aureus &Delta; saeR</td><td>BEI</td><td>NR-48164</td><td></td></tr><tr><td>S. rubidaea</td><td></td><td></td><td>Kolekcje NIST</td></tr><tr><td>Typowy bulion sojowy</td><td>Growcells</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identyfikacja pojawiających się patogenów bakteryjnych jest kluczowa dla ludzkiego zdrowia i bezpieczeństwa. Przyleganie bakterii do komórek gospodarza jest niezbędnym krokiem w infekcjach bakteryjnych i stanowi znak rozpoznawczy potencjalnego zagrożenia. Dlatego badanie przylegania bakterii do komórek gospodarza może być wykorzystane jako element oceny zagrożenia bakteryjnego. Standardową metodą liczenia przylegania bakterii do komórek gospodarza jest współinkubacja bakterii z komórkami gospodarza, zbieranie bakterii adherentnych, płytkowanie pobranych komórek na pożywce stałej, a następnie liczenie wynikowych jednostek tworzących kolonie (CFU). Alternatywnie, przyleganie bakterii do komórek gospodarza można ocenić za pomocą metod opartych na mikroskopii immunofluorescencyjnej. Jednak konwencjonalne strategie wdrażania tych podejść są czasochłonne i nieefektywne. W tym artykule opisano niedawno opracowaną metodę obrazowania opartą na zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej. W połączeniu z wysokowydajnym przetwarzaniem obrazów i analizą statystyczną metoda ta umożliwia szybkie ilościowe określenie bakterii, które przylegają do komórek gospodarza. Dwa gatunki bakterii, Gram-ujemne Pseudomonas aeruginosa i Gram-dodatnie Listeria monocytogenes oraz odpowiadające im kontrole negatywne, zostały przetestowane w celu zademonstrowania protokołu. Wyniki pokazują, że takie podejście szybko i dokładnie zlicza przylegające bakterie i znacznie skraca nakład pracy eksperymentalnej i ramy czasowe.

W celu opracowania testu adhezji bakteryjnej opartego na obrazowaniu fluorescencyjnym, do sprawdzenia skuteczności protokołu wykorzystano szczep P. aeruginosa PAO1 oraz jego negatywny odpowiednik pod kątem adhezji, E. coli, ponieważ adhezja tych bakterii do komórek A549 została opisana w literaturze14,20,22. Najpierw P. aeruginosa (PAO1) znakowaną GFP oraz E. coli znakowaną GFP inkubowano wspó...

Wykrywanie interakcji patogenów gospodarz-bakteria na podstawie przestrzegania fenotypu za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego wraz z automatycznymi metodami analizy statystycznej umożliwia szybką ocenę potencjalnych interakcji bakteryjnych z komórkami gospodarza.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Metoda ta zapewnia szybkie, wysokoprzepustowe wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami powlekania skraca czas potrzebny do ilościowego określenia przylegających bakterii. Ta technika jest zautomatyzowana, oszczędza czas i jest bardzo powtarzalna.Jest również szeroko stosowany zarówno do większości komórek gospodarza. Ta metoda jest bardzo prosta. W przypadku pierwszej próby należy zoptymalizować warunki, takie jak mnogość infekcji, a także czas koinkubacji bakterii gospodarza.Najpierw zbierz kultury bakterii w fazie wykładniczej przez odwirowanie w temperaturze 13 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po umyciu palety komórek jednym mililitrem PBS, ponownie zasmuś paletę bakteryjną w jednym mililitrowym PBS. Określ stężenia zawiesiny bakteryjnej, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach.Następnie, w celu zabarwienia zawiesiny bakteryjnej, dodaj dwa mikrolitry 500-krotnie skoncentrowanego zielonego lub czerwonego barwnika barwiącego do jednego mililitra zawiesiny bakteryjnej, aby rozcieńczyć barwnik jednokrotnie. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatnym obracaniem w ciemności. Po 30 minutach odwirować wybarwione bakterie w temperaturze 13 000 razy G przez dwie minuty i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.Zebrać poplamione komórki bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 13 000 razy G przez dwie minuty. Zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki F12 K i zmierzyć gęstość optyczną każdej kultury przy 600 nanometrach. Następnie rozcieńczyć kultury do pożądanych stężeń w oparciu o liczbę infekcji i stężenie komórek gospodarza.W celu przeprowadzenia testu przylegania bakterii należy trzykrotnie przemyć wcześniej wyhodowane warstwy mono komórek A549, dodając 100 mikrolitrów ciepłego PBS do każdej studzienki i delikatnie pipetować w górę iw dół. Następnie odrzuć PBS. Alternatywnie, po dodaniu PBS, odczekaj 10 sekund, a następnie usuń PBS za pomocą próżni.Aby określić kinetykę asocjacji bakteryjnej, należy nałożyć na komórki 100 mikrolitrów pożądanych stężeń zawiesiny bakteryjnej o różnej wielokrotności infekcji. Zakręć bakterie i inkubuj zainfekowane komórki A549 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dodatkową godzinę. Usuń niezwiązane bakterie, przemywając monowarstwy pięciokrotnie ciepłym PBS, jak pokazano.Następnie napraw komórki, dodając 100 mikrolitrów 4% formaldehydu do wszystkich dołków 96-dołkowej płytki na lodzie. Po 15 minutach umyj płytkę trzykrotnie PBS, aby usunąć roztwór utrwalający. Zabarwić jądra barwieniem DAPI w ilości 50 nanogramów na mililitr przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po umyciu komórek PBS przykryj zainfekowane komórki A549 100 mikrolitrami PBS, aby uniknąć wysuszenia, a następnie przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch dni w ciemności lub przystąp do obrazowania. Aby zachować integralność danych, losowo i ręcznie wybierz pięć lokalizacji każdej studzienki, aby uchwycić obrazy w 20-krotnym powiększeniu. Uchwyć obrazy fluorescencyjne bakterii pod kanałami GFP, komórki A549 pod DAPI, a dla bakterii wybarwionych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym użyj pięciokanałowego PE Si.Ustaw parametry toczącej się kuli do wygładzania i automatycznie mierz funkcję rozrzutu punktowego dekonwolucji obrazu w oparciu o cel uzyskania lepszej rozdzielczości. Zmierz intensywność fluorescencji komórek gospodarza i bakterii. Ustaw najsłabszą intensywność fluorescencji komórek gospodarza i bakterii jako progi liczby komórek i policz wszystkie bakterie znajdujące się najbliżej komórki gospodarza w odległości 15 mikrometrów jako bakterie przylegające.Po zliczeniu komórek ze wszystkich zautomatyzowanych obrazów przeanalizuj krytyczne odczyty, takie jak liczba komórek gospodarza, rozmiary i kształty komórek, całkowita liczba bakterii oraz średni udział bakterii na komórkę gospodarza, który jest najważniejszym wskaźnikiem określającym przyleganie bakterii. Po jednej godzinie koinkubacji szczep Pseudomonas aeruginosa PAO1 przylegał do komórek A549 w sposób zależny od dawki. Podobne wyniki zaobserwowano również w przypadku bakterii Gram-dodatnich Listeria monocytogenes i jej kontroli ujemnej Bacillus subtilis.Reprezentatywny obraz segmentacji P aeruginosa przylegającej do gospodarza pokazuje łatwość zliczania komórek bakteryjnych przy użyciu tego protokołu. Wyniki zautomatyzowanych analiz obejmują liczbę komórek bakteryjnych i gospodarza, średnią liczbę bakterii na komórkę gospodarza oraz rozmiary komórek gospodarza i obszary reprezentujące stan zdrowia komórek gospodarza, poziom przylegania bakterii i toksyczność cytotoksyczności bakteryjnej. Oprócz komórek A549 przetestowano również HUVEC pod kątem testu adhezji.Serratia rubidaea i Streptococcus agalactiae były przylegające do HUVEC, ale nie do komórek A549, co świadczy o skutecznym wykrywaniu i przydatności wielu gospodarzy do badania interakcji bakterii gospodarza przy użyciu tej metody. Komórki gospodarza powinny osiągnąć około 90 do 100% zbieżności, aby zminimalizować niepożądane przyleganie bakterii do dna studzienek. Technika ta pozwoli naukowcom na zbadanie nowych mechanizmów, czyli interakcji między gospodarzem a szkodnikiem.

automated-high-throughput-detection-bacterial-adherence-to-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Źródło: Stones, D. H., et al. Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie kulek bakteriomimetycznych do ilościowego określenia adhezji bakterii do komórek nabłonka gospodarza w konkurencyjnych warunkach. Przedstawiono w nim etapy związane z traktowaniem komórek, ich lizą i posiewaniem seryjnych rozcieńczeń w celu pomiaru jednostek tworzących kolonie.

Ocena interakcji między bakteriami a komórkami gospodarza za pomocą kulek biomimetycznych

Ten film demonstruje test przylegania bakterii do hodowli komórek nabłonkowych oznaczony GFP w celu zbadania dynamiki interakcji gospodarz-patogen za pomocą obrazowania opartego na mikroskopii fluorescencyjnej.

Wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Ten film pokazuje barwienie i przygotowanie komórek bakteryjnych do badań immunologicznych przy użyciu czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Barwione bakterie są rozcieńczane i ponownie zawieszane w pożywce wzrostowej, aby osiągnąć pożądane stężenie bakterii do infekcji komórek gospodarza, reprezentujące wielość infekcji.

Barwienie komórek bakteryjnych i przygotowanie do badań immunologicznych

Ten film demonstruje test opsono-adherencji do badania interakcji między opsonizowanymi bakteriami a komórkami odpornościowymi. Bakterie znakowane fluorescencyjnie, potraktowane surowicą testową zawierającą przeciwciała antykapsułkowe, inkubuje się z makrofagami. Po zabarwieniu makrofagów fluorescencją, przyczepione bakterie na powierzchni makrofagów obserwuje się pod mikroskopem w celu wizualizacji.

Test adherencji opsonowej do oceny opsonizacji bakterii otoczkowanych przez przeciwciała antykapsułkowe

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Opisano dwa testy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na mikroskopii czynników gospodarza związanych z infekcją Brucellą. Test wejściowy wykrywa czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucella, a test końcowy te, które są wymagane do replikacji wewnątrzkomórkowej. Chociaż ma zastosowanie do alternatywnych podejść, badania przesiewowe siRNA w komórkach HeLa są wykorzystywane do zilustrowania protokołów.

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Test opsono-adherencji jest alternatywną metodą do oceny opsono-fagocytarnych metod zabijania, aby ocenić opsoniczne funkcje przeciwciał w procesie opracowywania szczepionek.

Test opsono-adherencji w celu oceny funkcjonalnych przeciwciał w procesie opracowywania szczepionki przeciwko Bacillus anthracis i innym otoczkowanym patogenom

Poznaj zautomatyzowaną metodę wysokoprzepustowego wykrywania przylegania bakterii do komórek gospodarza. Technika ta znacząco skraca czas ręcznej pracy i poprawia powtarzalność wyników w badaniach mikrobiologicznych.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Przeglądaj więcej filmów