Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Technika ta umożliwia badanie funkcji i zakresu cząsteczek sygnałowych podczas embriogenezy poprzez przeszczepianie ektopowych źródeł sygnałowych. Ułatwia również efektywne wytwarzanie mutantów linii zarodkowej. Protokół może być stosowany do zarodków danio pręgowanego i medaka w stadium blastuli, a prawdopodobnie także do innych stadiów embrionalnych i gatunków TDO.

Aby zmontować urządzenie do przeszczepu, podłącz gazoszczelną strzykawkę z końcówką przynęty o pojemności 25 mikrolitrów do uchwytu na mikropipety za pomocą złączki z blokadą przynęty. Następnie zamontuj urządzenie bezpośrednio na ręcznym mikromanipulatorze. Aby skorzystać z urządzenia do przeszczepu, umieść mikromanipulator ze zmontowanym urządzeniem obok mikroskopu stereoskopowego.

Następnie wyjąć tłok i wprowadzić igłę do przeszczepu. Opuść igłę do naczynia wypełnionego roztworem Ringera pod kątem 45 stopni, aż końcówka igły zostanie zanurzona. Włożyć tłok mniej więcej do połowy, aby wypłukać roztwory Ringera, pozostawiając tylko niewielką ilość wody w cienkiej, zwężającej się części igły.

Przy pierwszym użyciu igły do przeszczepu należy pokryć wnętrze igły, pobierając jarzmo z ofiarowanego zarodka i całkowicie usuwając materiał jarzma. Następnie, za pomocą igły do przeszczepu, delikatnie ustaw zarodek dawcy, a następnie ustaw otwór igły prostopadle do powierzchni zarodka i ostrożnie pociągnij tłok, aby wciągnąć komórki do igły. Po pobraniu żądanej liczby komórek należy przerwać ssanie, delikatnie popychając tłok w dół i wyjąć igłę z zarodka, szarpiąc igłę na bok krótkimi i szybkimi ruchami.

Pozostaw trochę roztworu Ringera po obu stronach kolumny komórkowej, ograniczając komórki do zwężającego się końca igły. Usuń wszelkie pozostałe żółtka lub resztki komórek, powoli przesuwając tłok w górę i w dół i myjąc komórki roztworem Ringera. Następnie przesuń naczynie do przeszczepu ręką niedominującą, aby ustawić igłę prostopadle do powierzchni zarodka gospodarza.

Lekko dociśnij zarodek, ostrożnie dociskając go do ścian. Następnie szybkim, ostrym ruchem przebij otaczającą warstwę zarodka gospodarza, uważając, aby nie zarysować żółtka igłą. Gdy igła znajdzie się w środku, delikatnie popchnij tłok, aby wytłoczyć kolumnę komórek do zarodka i jednocześnie powoli wycofaj igłę.

W celu przeszczepienia komórek rozrodczych należy napełnić naczynie transplantacyjne roztworem Ringera, a następnie przenieść zdekorionowaną sferę do zarodków w stadium kopułowym do naczynia transplantacyjnego i ustawić zarodki gospodarza i dawcy w naprzemiennych kolumnach, aby przesadzić komórki z jednego zarodka dawcy do sześciu różnych zarodków gospodarza. Aby przeprowadzić przeszczepienie, należy ustawić zarodki z marginesem w kierunku igły do przeszczepu. W przypadku przeszczepu linii zarodkowej należy pobrać komórki źródłowe z marginesu i umieścić je w tym samym miejscu w zarodku gospodarza.

Po zakończeniu przeszczepu należy pozwolić zarodkowi dojść do siebie w roztworze Ringera przez 30 minut do jednej godziny. Następnie za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego zbadaj przeszczepione komórki. Następnie przenieś zarodki do 24-dołkowej płytki pokrytej agarozą z pożywką dla zarodków grupującą wszystkie zarodki gospodarza, które otrzymały komórki od tego samego dawcy, do tego samego dołka.

Następnie wysiaduj zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza do następnego dnia. W razie potrzeby przenieść zarodki dawcy do znakowanych pasków PCR w celu genotypowania. 30 godzin po zapłodnieniu należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków gospodarza pod kątem udanych przeszczepów linii zarodkowej pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.

Komórki rozrodcze powinny być obecne w rowku nad przedłużeniem żółtka. Wyhoduj pomyślnie przesadzoną larwę do dorosłego wieku zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli. W udanych przeszczepach zarodek wygląda normalnie i podobnie kształtem i klarownością żółtka do nieprzeszczepionych zarodków bez dużych rozdarć blastodermy.

Natomiast jeśli zarodek zostanie widocznie uszkodzony podczas przeszczepu, nie będzie się normalnie rozwijał. Chociaż urządzenie do przeszczepu było stosowane głównie na zarodkach danio pręgowanego w stadium blastuli, przeszczep i wytępienie komórek można również przeprowadzić w zarodkach w stadium blastuli z dechorionacją japońskiej ryby ryżowej medaka. W szczególnym przypadku przeszczepienia linii zarodkowej, dobry przeszczep skutkuje uzyskaniem zarodka z długą poziomą kolumną komórek bezpośrednio nad brzegiem żółtka.

Jednak powodzenie zabiegu można ocenić dopiero po 24 do 30 godzinach od zapłodnienia, gdy komórki rozrodcze różnią się fluorescencją od komórek somatycznych. Pierwotne komórki rozrodcze pojawią się jako małe fluorescencyjne kulki w rowku bezpośrednio nad przedłużeniem żółtka. Obecność tych komórek rozrodczych we właściwym miejscu wskazuje na pomyślny przeszczep linii zarodkowej.

Przykłady nieudanych przeszczepów przedstawiono tutaj. W pierwszym przykładzie, chociaż komórki rozrodcze dotarły do mezodermy gonadalnej, ponieważ zarodek gospodarza jest poważnie zdeformowany, nie będzie się normalnie rozwijał. W drugim przykładzie komórki fluorescencyjne są wykrywane tylko poza rowkiem.

Komórki te są albo komórkami somatycznymi, albo komórkami rozrodczymi, które nie migrowały prawidłowo. I oba typy komórek nie przyczynią się do linii zarodkowej zarodka. Bardzo ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia przeszczepionych komórek i zarodka gospodarza.

Komórki należy powoli pobierać, oczyścić z resztek żółtka i ostrożnie wkładać. Metoda ta zapewnia łatwy sposób przeszczepiania komórek w zarodkach danio pręgowanego i będzie przydatna do generowania źródeł ektopowych i mutantów linii zarodkowej. Główną zaletą tego urządzenia jest niski koszt, a także dużo i zastosowań.