Name: Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Naucz się techniki przeszczepiania komórek w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu prostego urządzenia. Metoda umożliwia badanie sygnałowania podczas embriogenezy oraz generowanie mutantów linii zarodowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Towarzystwo Maxa Plancka i otrzymał finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 637840 (QUANTPATTERN) oraz umowa o grant nr 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol><li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+for+Microscopic+Anatomy+and+Developmental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li>
<li>Müller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li>
<li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li>
<li>Pomreinke, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BMP+signaling+and+distribution+during+zebrafish+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning.</a> eLife. 6, 25861(2017).</li>
<li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li>
<li>Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Nodal+and+BMP+signaling+by+mutual+signaling+effector+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism.</a> Cell Reports. 31 (1), 107487(2020).</li>
<li>Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+reorganization+of+xanthophores+fine-tunes+and+colors+the+striped+pattern+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish.</a> Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).</li>
<li>Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iridophores+and+their+interactions+with+other+chromatophores+are+required+for+stripe+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish.</a> Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germline+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29.+4th+edn%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394(2009).</li>
<li>Capek, D., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), 177709(2019).</li>
<li>Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+stability+in+living+zebrafish+embryos+using+fluorescence+decay+after+photoconversion+%28FDAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266(2015).</li>
<li>Carvalho, L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yolk+syncytial+layer+in+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The yolk syncytial layer in early zebrafish development.</a> Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).</li>
<li>Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+of+medaka+embryos+and+cell+transplantation+for+the+generation+of+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055(2010).</li>
<li>Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+restriction+and+multipotency+in+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate restriction and multipotency in retinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Powodzenie eksperymentu transplantacyjnego w dużym stopniu zależy od umiejętności motorycznych eksperymentatora. Aby pomyślnie przeprowadzić procedury, wymagana jest praktyka. Jednak prezentowany tutaj instrument jest stosunkowo łatwy do nauczenia się i obsługi w porównaniu z innymi na rynku i generalnie potrzeba tylko kilku dni praktyki.
Powodzenie procedury przeszczepu można zwiększyć, podejmując kilka środków ostrożności. Jednym z kroków jest upewnienie się, że mikromanipulator jest dobrej jakości i zdolny do płynnej pracy. Dodanie okularu o większym powiększeniu do mikroskopu stereoskopowego może pomóc w precyzyjnym ustawieniu igły względem zarodka. Korzystanie z dobrze hodowanych danio pręgowanego lub medaka w celu uzyskania zdrowych zarodków i ostrożnie, aby nie uszkodzić zarodków podczas obchodzenia się z nim (zwłaszcza w trakcie i po etapie dekorionacji) również zwiększy wskaźnik sukcesu.
Problemy z opóźnioną toksycznością mogą być trudniejsze do rozwiązania. Jeśli zarodek umrze po kilku godzinach - ale nie bezpośrednio po przeszczepie - żółtko mogło zostać uszkodzone przez igłę (np. przez zbyt głębokie wbicie do zarodka) lub być może komórki zostały wyrzucone zbyt mocno. Opóźniona toksyczność i śmierć zarodka mogą również wynikać z żółtka lub resztek komórkowych wstrzykniętych wraz z komórkami dawcy; Inną przyczyną może być pogarszający się bufor HEPES w roztworze Ringera. Problemy te można przezwyciężyć poprzez mycie komórek (patrz krok 1.3.8) lub po prostu użycie nowej partii buforu. Co więcej, zdeformowane zarodki gospodarza w eksperymentach z przeszczepem linii zarodkowej mogą wynikać z nadmiernie wysokich stężeń morfolino. Bardzo ważne jest, aby użyć wystarczającej ilości morfolinu, aby w pełni usunąć linię zarodkową typu dzikiego gospodarza, zapobiegając w ten sposób przyczynianiu się tych komórek do potomstwa - ale jednocześnie należy unikać zbyt wysokich stężeń morfolinu. Stałe ilości morfolino we wszystkich wstrzykiwanych zarodkach gospodarza (kilkaset w typowym eksperymencie) są zatem kluczem do powodzenia przeszczepów linii zarodkowej. Można w tym pomóc, uzupełniając mieszaninę iniekcyjną morfolino łatwo widocznym barwnikiem znacznikowym14, który można śledzić pod stereomikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że wszystkie zarodki otrzymają tę samą objętość wstrzyknięcia.
Procedury opisane w tym protokole obejmują wyłącznie manipulacje komórkami w stadium blastuli lub zarodków medaki, ale w przyszłości prawdopodobnie będzie możliwe dostosowanie urządzenia do różnych etapów i gatunków poprzez zmianę średnicy i kształtu igły do przeszczepu.

Z klasycznych eksperymentów Mangolda i Spemanna, które wykazały istnienie organizatora instruującego tworzenie osi embrionalnej1, przeszczepianie komórek między embrionami stało się uznaną techniką badania rozwoju embrionalnego2,3,4,5,6,7,8,9,10. Powszechnie stosowana konfiguracja do przeszczepów składa się z gazoszczelnej strzykawki sterowanej napędem mikrometrycznym, połączonej z uchwytem na mikropipety za pomocą elastycznej rurki i zbiornika wypełnionego olejem mineralnym12,13. W tej konfiguracji tłok strzykawki jest przesuwany przez. Wytworzone w ten sposób ciśnienie jest przenoszone do mikropipety i wykorzystywane do pobierania komórek z jednego zarodka i umieszczania ich w innym. Jednak to hydraulicznie sterowane urządzenie składa się z wielu części, a jego montaż od podstaw jest pracochłonny. Podobne urządzenia można również kupić jako kompletny zestaw roboczy, zwykle sprzedawany jako ręczne mikrowtryskiwacze, a te komercyjne wersje zwykle kosztują ponad 1500 USD. Zarówno w wersji domowej, jak i komercyjnej, mikropipeta do manipulacji zarodkami jest oddzielona od urządzenia wytwarzającego ciśnienie (gazoszczelnej strzykawki) za pomocą rurki wypełnionej olejem. W związku z tym manipulowanie mikropipetą i ruch tłoka muszą być obsługiwane oddzielnie przez różne ręce, co zmniejsza przepustowość i użyteczność. Co więcej, przygotowanie urządzeń do przeszczepu jest kłopotliwe, ponieważ rurki muszą być ostrożnie wypełnione olejem, unikając tworzenia się pęcherzyków. W tym miejscu opisujemy alternatywne pneumatycznie sterowane urządzenie do usuwania i przeszczepiania komórek, które jest niedrogie, łatwe w montażu i proste w użyciu.
Prezentowane tutaj urządzenie składa się z gazoszczelnej strzykawki o pojemności 25 μL wyposażonej w uchwyt na mikropipety i kosztuje mniej niż 80 US$. Urządzenie można łatwo zmontować, wkładając uchwyt na mikropipetę do strzykawki za pomocą złączki Luer lock (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Urządzenie jest następnie montowane bezpośrednio na mikromanipulatorze, dzięki czemu użytkownik może kontrolować zarówno jego położenie, jak i ssanie jedną ręką bezpośrednio przy mikromanipulatorze. Dzięki temu druga ręka może swobodnie stabilizować i przesuwać szalkę transplantacyjną zawierającą zarodki dawcy i gospodarza. Urządzenie działa na zasadzie bezpośredniego zasysania powietrza i nie wymaga napełniania olejem mineralnym. Ze względu na siły przyciągania między wodą a ściankami szklanej igły, duży ruch tłoka strzykawki przekłada się na mniejszy ruch poziomu wody w igle, o ile poziom wody znajduje się w zwężającym się końcu szklanej igły. Pozwala to na precyzyjną kontrolę nad liczbą odsysanych komórek i miejscem ich wprowadzenia.
Aby zademonstrować użyteczność tego urządzenia, prezentujemy trzy zastosowania w zarodkach danio pręgowanego (Danio rerio). Po pierwsze, pokazujemy, jak generować zlokalizowane źródła wydzielanych cząsteczek sygnałowych, które można wykorzystać do badania powstawania gradientów2,4,6. W tym przypadku zarodkom dawcy wstrzykuje się mRNA kodujące fluorescencyjnie znakowaną cząsteczkę sygnałową. Znakowane fluorescencyjnie komórki dawcy są następnie przeszczepiane do zarodków gospodarza typu dzikiego, gdzie można obrazować i analizować tworzenie gradientu sygnału. Po drugie, opisujemy, w jaki sposób urządzenie może być używane do usuwania komórek przez ekstypację w celu wygenerowania zarodków o zmniejszonym rozmiarze5,13. Na koniec pokazujemy, jak solidnie wytwarzać matczyno-zygotyczne mutanty poprzez przeszczepianie komórek niosących pierwotny reporter komórki rozrodczej do embrionów gospodarza, w których linia zarodkowa została ablowana6,10. W przyszłości opisane tutaj urządzenie do przeszczepu może być łatwo przystosowane do innych manipulacji embriologicznych wymagających usunięcia lub przeszczepienia komórek.

<table><tbody><tr><td>Kapilara szklana 1,0 mm, końce cięte bez filamentu</td><td></td><td></td><td>Do wykonania igły transplantacyjnej</td></tr><tr><td>Kapilara szklana 1,0 mm, końce odcięte włóknem</td><td></td><td></td><td>Do wykonania igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td> szklana 200 ml <td>Do dechoracji zarodków</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td></td><td></td> z tworzywa sztucznego <td>Do pokrycia agarozą w celu inkubacji zarodków</td></tr><tr><td>Szklana szalka</td><td></td><td></td> Petriego o średnicy 5 cm <td>Do dechorionacji zarodków</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td></td><td></td> z tworzywa sztucznego <td>Do pokrycia agarozą w celu inkubacji zarodków</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td></td><td></td><td>Do powlekania plastikowych naczyń</td></tr> <tr><td>dnd1 morpholino</td><td>Narzędzia</td><td></td> genowe <td>Sekwencja: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> <td>dla zarodków250 mg/L Instant Sól oceaniczna, 1 mg/L błękit metylenowy w wodzie z odwróconej osmozy dostosowanej do pH 7 za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego NaHCO3</td></tr> z <tr><td>filtrami GFP/RFP i źródłem</td><td></td><td></td> światła <td>Do oceny iniekcji YSL i przeszczepów linii zarodkowej</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet szklanych</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td>Aby wykonać igłę do przeszczepu</td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td> <td>PasteuraKimble Chase (przez Fishera)</td><td>63A53WT</td><td>Do pipetowania zarodków; końcówki można podpalić, aby wygładzić krawędź</td></tr><tr><td>Inkubator pod kątem 28 stopni; C</td><td></td><td></td><td>Do inkubacji zarodków danio pręgowanego Luer</td></tr><tr><td>tip 25 &mu; L Strzykawka Hamilton, seria 1700</td><td>Hamilton</td><td>Nr ref.: 80201</td><td>Część urządzenia do przeszczepu</td></tr><tr><td>Ręczny mikromanipulator z 3 osiami ruchu</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Do sterowania urządzeniem do przeszczepu</td></tr><tr><td>Ręczna pompa pipetująca</td><td>Bio-Tek</td><td>Kat. # 641</td><td>Do użytku ze szklanymi pipetami do transferu zarodków</td></tr><tr><td>Metalowa sonda</td><td></td><td></td> preparcyjna <td>Do przesuwania i obracania Zarodki danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF2</td><td>Do wykonania igły do przeszczepu</td></tr><tr>Aparat <td></td><td></td><td>do mikroiniekcji</td><td>Do wstrzykiwania mRNA i morfoliny do zarodków Formy</td></tr> do <tr><td>mikroiniekcji, rowki trójkątne Adaptacyjne</td><td>narzędzia naukowe</td><td>TU-1</td><td>Do przygotowania płytek do mikroiniekcji z agarozą</td></tr><tr><td>Formy mikroiniekcyjne, pojedyncze dołki Adaptacyjne</td><td>narzędzia naukowe</td><td>PT-1</td><td>Do przygotowania płytek transplantacyjnych z agarozą</td></tr><tr><td>Uchwyt do mikropipet ze złączką Luer do szklanej kapilary 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH6S10</td><td>Część urządzenia do transplantacji</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 zestaw do transkrypcji</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340M</td><td>Do generowania zamkniętego mRNA do wstrzykiwań do zarodków</td></tr><tr><td>Plazmid z GFP-nos1 3'UTR </td><td></td><td></td><td>Plazmid, który może być transkrybowany w celu wytworzenia mRNA kodującego GFP za pomocą 3'UTR nos1</td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego 100 mm</td><td></td><td></td><td>Do pokrycia agarozą w celu wykonania naczyń do iniekcji i przeszczepów</td></tr><tr><td>Proteaza z Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Do dechorionacji zarodka: Przygotować wywar 5 mg/ml i stosować w stężeniu 1 mg/ml do dechorionacji zarodków</td></tr><tr><td>Ringer' s roztwór</td><td></td><td></td><td>Dla 1 l: dodać 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 i 1,19 g HEPES; następnie napełnić do 1 l; dostosować pH do 7,2; sterylizować przez filtrację</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td>Do wstrzykiwań i przeszczepów</td></tr></tbody></table>

proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Klasyczne manipulacje embriologiczne, takie jak usuwanie komórek i przeszczepianie komórek wewnątrz lub pomiędzy embrionami, są potężnymi technikami do badania złożonych procesów rozwojowych. Zarodki danio pręgowanego idealnie nadają się do tych manipulacji, ponieważ są łatwo dostępne, stosunkowo duże i przezroczyste. Jednak wcześniej opracowane urządzenia do usuwania i przeszczepiania komórek są kłopotliwe w użyciu lub drogie w zakupie. Natomiast prezentowane tutaj urządzenie do przeszczepu jest ekonomiczne, łatwe w montażu i proste w użyciu. W niniejszym protokole w pierwszej kolejności wprowadzamy obchodzenie się z urządzeniem do przeszczepiania, a także jego montaż z dostępnych na rynku i powszechnie dostępnych części. Następnie przedstawiamy trzy zastosowania do jego wykorzystania: generowanie ektopowych klonów w celu badania dyspersji sygnału z lokalnych źródeł, wykorzenianie komórek w celu wytworzenia zarodków o zmniejszonej wielkości oraz przeszczepianie linii zarodkowej w celu wygenerowania mutantów matczyno-zygotycznych. Na koniec pokazujemy, że narzędzie może być również wykorzystywane do manipulacji embriologicznych u innych gatunków, takich jak japońska ryba ryżowa medaka.

Sukces lub niepowodzenie w użyciu urządzenia do transplantacji w trzech opisanych powyżej zastosowaniach można łatwo ocenić poprzez inspekcję wizualną pod stereomikroskopem. W przypadku udanych transplantacji embrion powinien wyglądać normalnie, a jego kształt i klarowność żółtka powinny być zbliżone do embrionów niepoddanych transplantacji, bez dużych rozdarć w blastodermie. Jeśli embrion jest widocznie uszkodzony (Rycina 4B), nie będzie on rozwijał się prawidłowo. W idealnych warunkach przeszczepione komórki wykazujące marker fluorescencyjny powinny widzieć się jako ciągła kolumna podczas obserwacji pod stereomikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 2A, Rycina 4A). Jeśli kolumna jest pofragmentowana, wskazuje to, że komórki zostały rozerwane przez ssanie podczas zasysania do igły transplantacyjnej lub że osadzanie komórek zostało przeprowadzone zbyt gwałtownie. Można tego uniknąć, przesuwając tłok wolniej i delikatniej.
Choć urządzenie do transplantacji było wykorzystywane głównie u embrionów danio pręgowanego w stadium blastuli5,6, transplantacja i ekstirpacja komórek sprawdzają się równie dobrze w przypadku zdechorionowanych embrionów w stadium blastuli japońskiej rybki ryżowej medaka (Oryzias latipes) (Rysunek 2B). Poza zdechorionowaniem embrionów, które zostało opisane przez Porazinskiego, S. R. i współpracowników17, można stosować te same procedury, które opisano powyżej.
W konkretnym przypadku transplantacji linii zarodkowej prawidłowy przeszczep zaowocuje embrionem z długą poziomą kolumną komórek bezpośrednio nad brzegiem żółtka (Rysunek 4A). Jednak to, czy komórki zarodkowe zostały pomyślnie przeszczepione, można ocenić dopiero następnego dnia (Rysunek 4C-F) ze względu na tło ekspresji GFP w stadiach blastuli (Rysunek 1F). Pierwotne komórki zarodkowe będą widoczne jako małe fluorescencyjne sfery w bruździe bezpośrednio nad przedłużeniem żółtka (Rysunek 4C-E). Obecność tych komórek w odpowiednim miejscu świadczy o pomyślnej transplantacji linii zarodkowej. Komórki o innym kształcie nie są komórkami zarodkowymi (np. komórki wydłużone to zazwyczaj komórki mięśniowe, Rysunek 4F). Ponadto, jeśli pierwotne komórki zarodkowe znajdują się poza bruzdą, oznacza to, że nie migrowały prawidłowo i nie będą mogły przyczynić się do linii zarodkowej embrionu. Na koniec, ogólna morfologia przeszczepionych embrionów powinna być zbliżona do embrionów nieprzeszczepionych (Rysunek 4D); ogon nie powinien być zdeformowany, a głowa nie powinna być zapadnięta ani pozbawiona oczu (Rysunek 4E). Defekty te wynikają zazwyczaj ze zbyt wysokich stężeń morfolino lub z uszkodzenia embrionu podczas transplantacji. Eksperymenty z transplantacji linii zarodkowej opisane w niniejszym protokole zazwyczaj kończą się pomyślnym przeszczepieniem komórek zarodkowych u 1-2 z 6 embrionów biorców dla 60%-80% embrionów dawców, w zależności od doświadczenia eksperymentatora. Zatem komórki z 40-50 homozygotycznych embrionów dawców muszą zostać przeszczepione do 200-300 embrionów biorców, aby wyhodować około 30 osobników z mutantowymi komórkami zarodkowymi.
<img alt="Tworzenie chimery danio pręgowanego; konfiguracja mikromanipulatora; schematy transplantacji do analizy komórek zarodkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Montaż i użytkowanie urządzenia do transplantacji. (A) Urządzenie do transplantacji składa się poprzez połączenie strzykawki szczelnej gazowo z uchwytem mikropipety za pomocą złączki Luer lock. Następnie szklana igła do transplantacji jest wkładana do uchwytu mikropipety. (B) Zdjęcie zmontowanego urządzenia do transplantacji zamontowanego na mikromanipulatorze (należy zauważyć, że tło i etykiety zostały usunięte z obrazu). (C) Podczas korzystania z urządzenia do transplantacji ważne jest, aby poziom wody w igle transplantacyjnej znajdował się na jej zwężonym końcu. (D) Urządzenie jest wykorzystywane pod stereomikroskopem do pobierania i wprowadzania komórek z i do embrionów ryb kostnoszkieletowych umieszczonych w poszczególnych dołkach naczynia do transplantacji. (E) W celu generowania ektopowych źródeł, komórki są pobierane z bieguna zwierzęcego embrionu donora (i-ii) i przenoszone do bieguna zwierzęcego embrionu biorcy (iii-vi). (F) W przypadku transplantacji linii zarodkowej, większą liczbę komórek pobiera się z brzegu embrionu donora (i-ii), gdzie znajdują się komórki zarodkowe. Następnie komórki te są przenoszone na brzeg embrionów biorców (iii-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Embriogeneza zebrafish i medaka, klony komórek znakowane fluorescencyjnie, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Generowanie klonów poprzez transplantację komórek. (A) Przykład podwójnego klonu wygenerowanego poprzez sekwencyjną transplantację komórek fluorescencyjnych (zielonych) od donora zebrafish do zarodka gospodarza zebrafish. Pojedyncze i podwójne klony mogą być wykorzystywane do badania sposobu, w jaki wydzielane cząsteczki sygnałowe tworzą gradienty czasoprzestrzenne2,4,5,6. (B) Przykład pojedynczego klonu wygenerowanego poprzez transplantację komórek od transgenicznego donora medaka (Wimbledon) wykazującego ekspresję eGFP17 do gospodarza medaka typu dzikiego. Paski skali reprezentują 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wstrzykiwania do YSL i ekstirpację; proces rozwoju embrionalnego; wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Generowanie embrionów o zredukowanym rozmiarze poprzez ekstirpację komórek. (A) Przed usunięciem komórek metodą ekstirpacją, YSL można oznakować, wstrzykując barwniki fluorescencyjne po dwóch przeciwległych stronach YSL. (B) Przykład embrionu po wstrzyknięciu do YSL. (C) Aby uzyskać embriony o zredukowanym rozmiarze, komórki z bieguna zwierzęcego są usuwane poprzez ekstirpację5. (D) Przykład embrionu po ekstirpacji komórek. Należy zauważyć, że YSL pozostaje nienaruszone. Paski skali reprezentują 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat transplantacji pierwotnych komórek płciowych i obrazy mikroskopowe przedstawiające stadia rozwoju embrionalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Transplantacja linii płciowej. (A) Przykład udanej transplantacji komórek donora (zielone) do strefy brzeżnej gospodarza. (B) Przykład nieudanej transplantacji. Żółtko zarodka gospodarza zostało poważnie uszkodzone, w związku z czym zarodek nie będzie w stanie rozwijać się prawidłowo. (C) W 30 hpf pomyślnie przeszczepione komórki płciowe będą znajdować się wyłącznie w mezodermie gonadalnej w przedniej części wyrostka żółtkowego. (D) Przykład udanej transplantacji, w której kilka oznakowanych GFP komórek płciowych donora zasiedliło przyszłą gonadę gospodarza. (E) Przykład nieudanej transplantacji. Chociaż komórki płciowe dotarły do mezodermy gonadalnej, zarodek gospodarza jest silnie zdeformowany i nie będzie rozwijał się prawidłowo. (F) Przykład nieudanej transplantacji. Fluorescencyjne komórki płciowe, które nie zmigrowały w odpowiednie miejsce, nie zasiedlą gonad. Paski skali reprezentują 100 µm. Obrazy D-F zostały wykonane przy całkowitym powiększeniu około 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Technika ta umożliwia badanie funkcji i zakresu cząsteczek sygnałowych podczas embriogenezy poprzez przeszczepianie ektopowych źródeł sygnałowych. Ułatwia również efektywne wytwarzanie mutantów linii zarodkowej. Protokół może być stosowany do zarodków danio pręgowanego i medaka w stadium blastuli, a prawdopodobnie także do innych stadiów embrionalnych i gatunków TDO.Aby zmontować urządzenie do przeszczepu, podłącz gazoszczelną strzykawkę z końcówką przynęty o pojemności 25 mikrolitrów do uchwytu na mikropipety za pomocą złączki z blokadą przynęty. Następnie zamontuj urządzenie bezpośrednio na ręcznym mikromanipulatorze. Aby skorzystać z urządzenia do przeszczepu, umieść mikromanipulator ze zmontowanym urządzeniem obok mikroskopu stereoskopowego.Następnie wyjąć tłok i wprowadzić igłę do przeszczepu. Opuść igłę do naczynia wypełnionego roztworem Ringera pod kątem 45 stopni, aż końcówka igły zostanie zanurzona. Włożyć tłok mniej więcej do połowy, aby wypłukać roztwory Ringera, pozostawiając tylko niewielką ilość wody w cienkiej, zwężającej się części igły.Przy pierwszym użyciu igły do przeszczepu należy pokryć wnętrze igły, pobierając jarzmo z ofiarowanego zarodka i całkowicie usuwając materiał jarzma. Następnie, za pomocą igły do przeszczepu, delikatnie ustaw zarodek dawcy, a następnie ustaw otwór igły prostopadle do powierzchni zarodka i ostrożnie pociągnij tłok, aby wciągnąć komórki do igły. Po pobraniu żądanej liczby komórek należy przerwać ssanie, delikatnie popychając tłok w dół i wyjąć igłę z zarodka, szarpiąc igłę na bok krótkimi i szybkimi ruchami.Pozostaw trochę roztworu Ringera po obu stronach kolumny komórkowej, ograniczając komórki do zwężającego się końca igły. Usuń wszelkie pozostałe żółtka lub resztki komórek, powoli przesuwając tłok w górę i w dół i myjąc komórki roztworem Ringera. Następnie przesuń naczynie do przeszczepu ręką niedominującą, aby ustawić igłę prostopadle do powierzchni zarodka gospodarza.Lekko dociśnij zarodek, ostrożnie dociskając go do ścian. Następnie szybkim, ostrym ruchem przebij otaczającą warstwę zarodka gospodarza, uważając, aby nie zarysować żółtka igłą. Gdy igła znajdzie się w środku, delikatnie popchnij tłok, aby wytłoczyć kolumnę komórek do zarodka i jednocześnie powoli wycofaj igłę.W celu przeszczepienia komórek rozrodczych należy napełnić naczynie transplantacyjne roztworem Ringera, a następnie przenieść zdekorionowaną sferę do zarodków w stadium kopułowym do naczynia transplantacyjnego i ustawić zarodki gospodarza i dawcy w naprzemiennych kolumnach, aby przesadzić komórki z jednego zarodka dawcy do sześciu różnych zarodków gospodarza. Aby przeprowadzić przeszczepienie, należy ustawić zarodki z marginesem w kierunku igły do przeszczepu. W przypadku przeszczepu linii zarodkowej należy pobrać komórki źródłowe z marginesu i umieścić je w tym samym miejscu w zarodku gospodarza.Po zakończeniu przeszczepu należy pozwolić zarodkowi dojść do siebie w roztworze Ringera przez 30 minut do jednej godziny. Następnie za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego zbadaj przeszczepione komórki. Następnie przenieś zarodki do 24-dołkowej płytki pokrytej agarozą z pożywką dla zarodków grupującą wszystkie zarodki gospodarza, które otrzymały komórki od tego samego dawcy, do tego samego dołka.Następnie wysiaduj zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza do następnego dnia. W razie potrzeby przenieść zarodki dawcy do znakowanych pasków PCR w celu genotypowania. 30 godzin po zapłodnieniu należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków gospodarza pod kątem udanych przeszczepów linii zarodkowej pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.Komórki rozrodcze powinny być obecne w rowku nad przedłużeniem żółtka. Wyhoduj pomyślnie przesadzoną larwę do dorosłego wieku zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli. W udanych przeszczepach zarodek wygląda normalnie i podobnie kształtem i klarownością żółtka do nieprzeszczepionych zarodków bez dużych rozdarć blastodermy.Natomiast jeśli zarodek zostanie widocznie uszkodzony podczas przeszczepu, nie będzie się normalnie rozwijał. Chociaż urządzenie do przeszczepu było stosowane głównie na zarodkach danio pręgowanego w stadium blastuli, przeszczep i wytępienie komórek można również przeprowadzić w zarodkach w stadium blastuli z dechorionacją japońskiej ryby ryżowej medaka. W szczególnym przypadku przeszczepienia linii zarodkowej, dobry przeszczep skutkuje uzyskaniem zarodka z długą poziomą kolumną komórek bezpośrednio nad brzegiem żółtka.Jednak powodzenie zabiegu można ocenić dopiero po 24 do 30 godzinach od zapłodnienia, gdy komórki rozrodcze różnią się fluorescencją od komórek somatycznych. Pierwotne komórki rozrodcze pojawią się jako małe fluorescencyjne kulki w rowku bezpośrednio nad przedłużeniem żółtka. Obecność tych komórek rozrodczych we właściwym miejscu wskazuje na pomyślny przeszczep linii zarodkowej.Przykłady nieudanych przeszczepów przedstawiono tutaj. W pierwszym przykładzie, chociaż komórki rozrodcze dotarły do mezodermy gonadalnej, ponieważ zarodek gospodarza jest poważnie zdeformowany, nie będzie się normalnie rozwijał. W drugim przykładzie komórki fluorescencyjne są wykrywane tylko poza rowkiem.Komórki te są albo komórkami somatycznymi, albo komórkami rozrodczymi, które nie migrowały prawidłowo. I oba typy komórek nie przyczynią się do linii zarodkowej zarodka. Bardzo ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia przeszczepionych komórek i zarodka gospodarza.Komórki należy powoli pobierać, oczyścić z resztek żółtka i ostrożnie wkładać. Metoda ta zapewnia łatwy sposób przeszczepiania komórek w zarodkach danio pręgowanego i będzie przydatna do generowania źródeł ektopowych i mutantów linii zarodkowej. Główną zaletą tego urządzenia jest niski koszt, a także dużo i zastosowań.

a-simple-and-effective-transplantation-device-for-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i produkcji szablonu do układania zarodków danio pręgowanego, a następnie szczegółową procedurę użycia takiego szablonu do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce.

Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Naucz się techniki przeszczepiania komórek w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu prostego urządzenia. Metoda umożliwia badanie sygnałowania podczas embriogenezy oraz generowanie mutantów linii zarodowej.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów