Name: Modyfikacja chemiczna reszty tryptofanu w rekombinowanej domenie NCa2+-ATPazy do badania tryptofanu-ANS FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji chemicznej tryptofanu w domenie N Ca²⁺-ATPazy do badania FRET z ANS. Technika fluorescencyjna pozwala określić rolę reszt tryptofanu w wiązaniu sondy ANS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez grant FAI-UASLP numer C19-FAI-05-89.89 oraz grant CONACYT numer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Autorzy dziękują za pomoc techniczną Juliana E. Mata-Moralesa w edycji wideo.

1. Określenie (in silico) interakcji ANS i SERCA w domenie N
<ol>
	<li>Wygeneruj trójwymiarową (3D) strukturę białka (domena N serca) poprzez modelowanie molekularne przy użyciu preferowanego oprogramowania do modelowania białek50.</li>
	<li>Zidentyfikuj reszty aminokwasowe, które tworzą miejsce wiązania nukleotydów, korzystając z preferowanej struktury molekularnej software51, i określ obecność reszt Arg i Lys35; są one wymagane do wiązania ANS i zwiększenia intensywności fluorescencji (wydajności kwantowej).</li>
	<li>Wykonaj dokowanie molekularne (przy użyciu preferowanego oprogramowania do dokowania)52,53,54, aby określić interakcje ATP, izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (który tworzy wiązanie kowalencyjne z Lys515 znakującym miejsce wiązania nukleotydów) i ANS z resztą aminokwasów w miejscu wiązania nukleotydów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Obliczyć odległość molekularną (A) między pozostałością Trp a związanym ANS za pomocą narzędzia pomiarowego w preferowanym oprogramowaniu.</li>
	<li>Wykonaj symulację dynamiki molekularnej kompleksu ANS-domena N, aby określić stabilność interakcji52,54. Następnie należy przeprowadzić eksperymenty in vitro, gdy stabilność kompleksu zostanie potwierdzona.</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej domeny N
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj gen kodujący dla N-domain40.</li>
	<li>Zaprojektuj i skonstruuj plazmid, który zawiera syntetyczny gen kodujący domenę N40.</li>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa (Ni-NTA), zmodyfikowanej rekombinowanej domeny N. Wykonaj SDS-PAGE oczyszczonego białka, aby określić czystość (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)40.</li>
	<li>Określ stężenie białka, badając absorbancję przy λ wynoszącej 280 nm ze współczynnikiem ekstynkcji domeny N (ε= 11,960 M-1·cm-1)40.</li>
</ol>
3. Monitoruj tworzenie kompleksu ANS-domena N na podstawie zmian intensywności fluorescencji ANS i domeny N.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy ANS w N,N-dimetyloformamidzie.
	<ol>
		<li>Odważyć niewielką ilość (1-5 mg) ANS i rozpuścić ją w 1 ml końcowej objętości N,N-dimetyloformamidu, np. 3,2 mg (10,69 mM stężenie końcowe).</li>
		<li>Przygotować 100 μM wodny roztwór podstawowy ANS przy użyciu roztworu ANS w N,N-dimetyloformamidzie, np. dodać 9,4 μl 10,69 mM roztworu ANS do 990,6 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.</li>
		<li>Wymieszaj roztwory, wirując 3 - 5 razy przez 15 s. 
		UWAGA: W poniższym eksperymencie należy używać wyłącznie wodnego roztworu podstawowego ANS. Świeżo przygotować wodny roztwór podstawowy ANS przed rozpoczęciem doświadczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy NBS w N,N-dimetyloformamidzie.
	<ol>
		<li>Odważyć niewielką ilość (1-5 mg) NBS i rozpuścić ją w 1 ml N,N-dimetyloformamidu, np. 5,3 mg w 1 ml (stężenie końcowe 29,78 mM).</li>
		<li>Przygotować 1 mM wodnego roztworu podstawowego NBS przy użyciu roztworu NBS w N,N-dimetyloformamidzie, np. dodać 3,36 μl 29,78 mM roztworu NBS do 96,64 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0, aby uzyskać końcową objętość 0,1 ml.</li>
		<li>Wymieszaj roztwory, wirując 3 - 5 razy przez 15 s. 
		UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przygotować świeżo wodny roztwór podstawowy NBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miareczkować domenę N za pomocą ANS i rejestrować widma fluorescencji przez wzbudzenie przy λ=295 nm w temperaturze 25 °C.
	<ol>
		<li>Uzyskaj linię bazową widma fluorescencji.
		<ol>
			<li>Umieść 1 ml 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0 w 1 ml fluorescencyjnej kuwecie kwarcowej.</li>
			<li>Umieścić ogniwo w termicznej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.</li>
			<li>Zapisać widmo fluorescencji (305 - 550 nm). 
			UWAGA: Widmo fluorescencji buforu fosforanowego o pH 50 mM o pH 8,0, który służy jako próbka ślepa, jest odejmowane od wszystkich uzyskanych widm fluorescencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzyskaj wewnętrzne widmo fluorescencji domeny N.
		<ol>
			<li>Umieścić 900 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 8,0 w fluorescencyjnej kuwecie kwarcowej.</li>
			<li>Dodać 100 μl zawiesiny w domenie N (10 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM w domenie N w końcowej objętości 1 ml.</li>
			<li>Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety 20 razy, aby zapewnić jednorodność roztworu. 
			UWAGA: Białko powinno być świeżo oczyszczone w celu uzyskania wysokiej jakości wewnętrznych widm fluorescencji, np. oczyszczona rekombinowana domena N może być używana tylko przez tydzień po oczyszczeniu.</li>
			<li>Umieścić ogniwo w termicznej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.</li>
			<li>Zapisz wewnętrzne spektrum fluorescencji w domenie N (305-550 nm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać ANS i otrzymać widmo fluorescencji przez wzbudzenie przy λ=295 nm.
		<ol>
			<li>Dodać 2 μl podwielokrotności 100 μM wodnego roztworu podstawowego ANS do zawieszonej domeny N (1 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 μM ANS.</li>
			<li>Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety 20 razy, aby zapewnić jednorodność roztworu.</li>
			<li>Umieścić celę w termostabilnej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.</li>
			<li>Zapisz widmo fluorescencji (305-550 nm).</li>
			<li>Powtórzyć dodawanie ANS i zapis widm fluorescencyjnych powyżej stosunku molowego 1:1 ANS:N-domena.</li>
			<li>Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
			<li>Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie.</li>
			<li>Określ, czy widma tworzą wzór podobny do FRET. Widma fluorescencji w domenie ANS-N tworzą wzór podobny do fret (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Miareczkowanie fluorescencji wewnętrznej w domenie N za pomocą modyfikacji chemicznej Trp za pomocą NBS.
<ol>
	<li>Powtórz kroki 3.3.1 i 3.3.2.</li>
	<li>Dodać 1 μl podwielokrotności 1 mM wodnego roztworu podstawowego NBS do zawieszonej domeny N (1 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM NBS.</li>
	<li>Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety 20 razy, aby zapewnić jednorodność roztworu.</li>
	<li>Umieścić celę w termostabilnej komorze celi (25 °C) spektrofluorometru i ustawić wzbudzenie λ na 295 nm.</li>
	<li>Zapisz widmo fluorescencji (305-550 nm) (<klasa silna="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Powtarzaj dodawanie NBS i zapis widm fluorescencji, aż do momentu zaobserwowania minimalnego wewnętrznego wygaszania fluorescencji w domenie N40. W domenie N zwykle występuje to przy stosunku molowym 5-6 NBS/N-domena40. 
	UWAGA: NBS szybko wygasza (<5 s) wewnętrzną fluorescencję domeny N; Obserwuje się spadek intensywności fluorescencji. Przejdź natychmiast do następnego kroku, ponieważ NBS może również reagować z innymi resztami aminokwasowymi47.</li>
	<li>Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
</ol>
5. Miareczkować zmodyfikowaną przez NBS domenę N za pomocą ANS, rejestrując widma fluorescencji w temperaturze 25 °C.
<ol>
	<li>Wykonaj krok 3.3.3, używając zmodyfikowanej domeny N usługi NBS, która została wygenerowana w kroku 4.</li>
	<li>Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Wygenerowane widma fluorescencji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3C) potwierdzają lub obalają występowanie FRET, tj. gdy występuje FRET, fluorescencja ANS nie wzrasta i odwrotnie.</li>
</ol>
6. Dowód na wiązanie ANS z chemicznie zmodyfikowaną domeną N poprzez wzbudzenie przy λ=370 nm.
<ol>
	<li>Wykonaj krok 3.3.3, używając zmodyfikowanej domeny N NBS, która została wygenerowana w kroku 4, ale zmieniając wzbudzenie λ na 370 nm.</li>
	<li>Odejmij ślepe widmo od każdego widma za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Potwierdź wiązanie ANS z domeną N, obserwując wzrost intensywności fluorescencji ANS. Wiązanie ANS z domeną N wykazuje wzrost fluorescencji po wzbudzeniu przy λ=370 nm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D). Jako kontrolę, widmo fluorescencji ANS (samego) w buforze fosforanowym 50 mM o pH 8,0 uzyskano wzbudzenie przy λ 295 i 370 nm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4, nie pokazany na filmie). 
	UWAGA: Zależność stechiometryczna NBS:Trp, która jest wymagana do modyfikacji chemicznej, zależy od stopnia zakopania resztek Trp w badanym białku46,47,55,56. Dlatego zaleca się wcześniejsze określenie stosunku molowego NBS:białko/(Trp).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Widma fluorescencyjne kompleksu ANS-domena N wykazują wzór podobny do FRET, gdy są wzbudzone przy λ 295 nm, podczas gdy odległość molekularna (20 A) między resztą Trp a ANS wydaje się potwierdzać występowanie FRET (Figura 1). Modyfikacja chemiczna Trp przez NBS powoduje mniej fluorescencyjną domenę N (Rysunek 3B, Widmo f); W związku z tym transfer energii nie jest możliwy. Widma fluorescencji ANS są podobne do widm niezmodyfikowanej domeny N, gdy są wzbudzone pr...

Föster resonance energy transfer (FRET) stał się standardową techniką określania odległości między strukturami molekularnymi po wiązaniu lub interakcji w badaniach struktury i funkcji białek1,2,3,4. W ATPazach typu P, FRET został wykorzystany do zbadania struktury i funkcji retikulum sarko-endoplazmatycznego Ca2+-ATPazy (SERCA)2,5,6,7,8, np. fluktuacje strukturalne podczas cyklu katalitycznego zostały przeanalizowane w całym białku przez FRET7.
Dawcy FRET są różnorodni i obejmują zarówno małe cząsteczki fluorescencyjne (zewnętrzne), a kończąc na białkach fluorescencyjnych9,10. Reszty tryptofanu (Trp) (ze względu na ich fluorescencję) są przydatne do identyfikacji zmian strukturalnych w sekwencjach aminokwasów białkowych11,12. Intensywność fluorescencji Trp zależy w dużej mierze od polaryzacji otaczającego go środowiska13,14. Wiązanie ligandów zwykle powoduje przegrupowania strukturalne w białkach/enzymach15,16. Jeśli Trp jest obecny w miejscu wiązania białka lub znajduje się w jego pobliżu, fluktuacje strukturalne często wpływają na stopień ekspozycji Trp na media wodne13,14; w ten sposób zmiana polaryzacji powoduje wygaszenie intensywności fluorescencji Trp13,14. W związku z tym właściwości fluorescencyjne Trp są przydatne do przeprowadzania badań wiązania ligandów przez enzymy. Inne zjawiska fizyczne mogą również prowadzić do wygaszania fluorescencji Trp17,18,19,20, np. FRET i zmiany polarności medium. Przenoszenie energii ze stanu wzbudzonego Trp do fluoroforu ma również potencjalne zastosowania, np. określanie powinowactwa małych ligandów w białkach21. Rzeczywiście, Trp był przede wszystkim używany jako donor fluorescencji w badaniach FRET w białkach22,23,24, np. w badaniach FRET terbu (Tb3+) reszta Trp jest często używana jako antena do transferu energii do Tb3+ 25,26,27. Trp wykazuje różne zalety w porównaniu z innymi donorami FRET ze względu na swój nieodłączny konstytutywny charakter w strukturze białka, który eliminuje potrzebę procesów przygotowawczych, które mogą wpływać na funkcję/strukturę badanego białka24. W związku z tym identyfikacja rozpadów promieniowania (transfer energii i zmiany polarności ośrodka, które są indukowane przez przegrupowania strukturalne białek) jest ważna dla wyciągnięcia dokładnych wniosków dotyczących wiązania ligandów w badaniach strukturalnych białek13,14,19,28.
W badaniach strukturalnych białek, zewnętrzny fluorofor, a mianowicie 8-anilino-1-naftalenosulfonian (ANS), był głównie używany w eksperymentach związanych z fałdowaniem/rozwijaniem białek28,29. ANS wiąże się z białkami/enzymami w stanie natywnym, zwykle w miejscach wiązania substratów31,32,33; wzrost wydajności kwantowej fluorescencji ANS (ΦF) (czyli wzrost intensywności fluorescencji) jest indukowany przez wzbudzenie białka przy λ=370 nm, gdy zachodzą odpowiednie oddziaływania ANS z resztą Arg i His w kieszeniach hydrofobowych34,35,36,37. W różnych badaniach opisano występowanie FRET (gdy wzbudza się przy λ w zakresie 280-295 nm) między resztami Trp (donorami) a ANS (akceptorem), które opiera się na następujących zasadach: 1) nakładanie się widma emisji fluorescencji Trp i widma wzbudzenia ANS, 2) określenie odpowiedniej odległości między jedną lub kilkoma pozostałościami Trp a ANS dla transferu energii, 3) wysoka wydajność kwantowa ANS po związaniu w kieszeniach białkowych oraz 4) charakterystyczny wzór FRET w widmach fluorescencyjnych białka w obecności ANS3,17,27,37,38.
Ostatnio wiązanie ligandów z domeną wiążącą nukleotydy (domeną N) w SERCA i innymi ATPazami typu P zostało zbadane przy użyciu zmodyfikowanych rekombinowanych N-domen N40,41,42,43,44,45,46. Inżynieria molekularna domeny N SERCA została wykorzystana do przeniesienia jedynej reszty Trp (Trp552Leu) do bardziej dynamicznej struktury (Tyr587Trp), która znajduje się blisko miejsca wiązania nukleotydów, gdzie zmiany fluorescencji (wygaszanie) mogą być wykorzystywane do monitorowania zmian strukturalnych po związaniu liganda34. Wyniki eksperymentalne wykazały, że ANS wiąże się (jako ATP) z miejscem wiązania nukleotydów w oczyszczonej rekombinowanej domenie N SERCA34. Co ciekawe, fluorescencja ANS wzrasta po związaniu się z domeną N po wzbudzeniu przy λ 295 nm, podczas gdy wewnętrzna fluorescencja domeny N maleje34, tworząc w ten sposób wzór FRET, który sugeruje tworzenie pary Trp-ANS FRET.
Zaproponowano użycie NBS do określenia zawartości reszt Trp w białkach47 za pomocą testu absorbancji zmodyfikowanych białek. NBS modyfikuje wysoce absorbującą grupę indolową Trp do mniej chłonnej oksynolozy47,48. Powoduje to utratę (wygaszenie) właściwości fluorescencyjnej Trp40. W związku z tym chemiczna modyfikacja reszt Trp za pośrednictwem NBS może być stosowana jako test do określenia roli Trp (jako dawcy), gdy hipoteza dotyczy FRET.
Ten protokół opisuje chemiczną modyfikację jedynej reszty Trp przez NBS w zmodyfikowanej rekombinowanej domenie N SERCA jako model białka. Wyniki eksperymentalne pokazują, że intensywność fluorescencji ANS nadal wzrasta w chemicznie zmodyfikowanej przez NBS N-domain34, która nie ma wewnętrznej fluorescencji. W związku z tym test jest przydatny do wykazania braku FRET między resztą Trp a ANS po związaniu z domeną N34,40,49. W związku z tym ten test (chemiczna modyfikacja Trp NBS) jest przydatny w udowodnieniu obecności pary Trp-ANS FRET w białkach.

<table><tbody><tr><td>Akrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Kwas 8-anilino-1-naftalenosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Fluorofor</td></tr><tr><td>Bis-akryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-Page</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>Chemiczny modyfikacja</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>Przygotowanie roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Etykieta fluorescencji chemicznej</td></tr><tr><td>Kuweta fluorescencyjna</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>Test fluorescencji</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr fluorescencyjny</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>Test fluorescencji</td></tr><tr><td>HisTrap&trade; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>Oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>IPTG, bez dioksanu</td><td>American Bionalytical</td><td>AB00841-00010</td><td>Ekspresja białka</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>Oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>Pożywka LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td>Fluorescencja test</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>Test fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Test fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Test fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>Test fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Precision plus std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>Przygotowanie buforu</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>Przygotowanie buforu</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 um</td><td>Milipory</td><td>GVWP04700</td><td>Filtracja roztworu</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>STRONA SDS</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>SDS-STRONA</td></tr></tbody></table>

modyfikacja chemiczna reszty tryptofanu w rekombinowanej domenie nca2+-atpazy do badania tryptofanu-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

Ca2+-ATPaza (SERCA) jest ATPazą typu P, która została skrystalizowana w różnych konformacjach. Szczegółowe informacje funkcjonalne można jednak uzyskać z izolowanych domen rekombinowanych. Zmodyfikowana (Trp552Leu i Tyr587Trp) rekombinowana domena wiążąca nukleotydy (domena N) wykazuje wygaszanie fluorescencji po związaniu liganda. Zewnętrzny fluorofor, a mianowicie 8-anilino-1-naftalenosulfonian (ANS), wiąże się z miejscem wiązania nukleotydów poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe z resztą Arg, His, Ala, Leu i Phe. O wiązaniu ANS świadczy wzrost intensywności fluorescencji po wzbudzeniu przy długości fali (λ) 370 nm. Jednak po wzbudzeniu przy λ wynoszącym 295 nm, wzrost intensywności fluorescencji wydaje się być sprzężony z wygaszaniem wewnętrznej fluorescencji w domenie N. Widma fluorescencyjne wykazują wzór podobny do rezonansowego transferu energii Föstera (FRET), co sugeruje obecność pary Trp-ANS FRET, która wydaje się być wspierana przez niewielką odległość (~20 A) między Tyr587Trp a ANS. W niniejszym badaniu opisano analizę pary Trp-ANS FRET przez modyfikację chemiczną Trp (i wygaszanie fluorescencji), w której pośredniczy N-bromosuccinimid (NBS). W chemicznie zmodyfikowanej domenie N fluorescencja ANS wzrastała przy wzbudzeniu przy λ 295 nm, podobnie jak przy wzbudzeniu przy λ 370 nm. W związku z tym chemiczna modyfikacja reszty Trp za pośrednictwem NBS może być wykorzystana do zbadania braku FRET między Trp i ANS. Przy braku fluorescencji Trp nie należy obserwować wzrostu fluorescencji ANS. Modyfikacja chemiczna reszt Trp w białkach za pomocą NBS może być przydatna do badania FRET między resztami Trp, które znajdują się blisko związanego ANS. Ten test będzie prawdopodobnie przydatny również w przypadku stosowania innych fluoroforów.

Dokowanie molekularne wykazuje wiązanie ANS z miejscem wiązania nukleotydów domeny N poprzez oddziaływania elektrostatyczne oraz hydrofobowe (Rycina 1). Odległość molekularna (20 Å) między resztą Trp a ANS (związanym z miejscem wiązania nukleotydów) potwierdza występowanie FRET (Rycina 1). Zaprojektowana (zmodyfikowana) rekombinowana domena N została uzyskana z wysoką czystością za pomocą chromatografii powinowactwa (Rycina 2) i był...

ANS wiąże się z rekombinowaną domeną N Ca2+-ATPazy. Widma fluorescencyjne wykazują wzór podobny do FRET po wzbudzeniu przy długości fali 295 nm. Modyfikacja chemiczna Trp za pośrednictwem NBS wygasza fluorescencję domeny N, co prowadzi do braku transferu energii (FRET) między resztą Trp a ANS.

Modyfikacja chemiczna reszty tryptofanu w rekombinowanej domenie NCa2+-ATPazy do badania tryptofanu-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Testy te mogą pomóc w wyjaśnieniu roli reszt tryptofanu w białkach podczas wykonywania badań wiązania ANS. Fluorescencja ANS wzrasta po związaniu się z określonymi miejscami strukturalnymi w białkach. Czasami miejsce wiązania ANS znajduje się w pobliżu reszty tryptofanu w odległości, która sugeruje istnienie FRET między tryptofanem a ANS.NBS pośredniczy w chemicznej modyfikacji reszt tryptofanu w białkach, wygaszając jego fluorescencję. Dlatego testy te pozwalają określić, czy reszty tryptofanu przyczyniają się do zwiększenia intensywności fluorescencji ANS przez FRET. W tej pracy wykorzystujemy zmodyfikowaną rekombinowaną domenę wiążącą nukleotydy z SERCA zawierającą mutacje, mając na celu zlokalizowanie tryptofanu w pobliżu miejsca wiązania nukleotydu, w którym również wiąże się ANS.Test ten jest szybki i łatwy do wykonania, stąd jego główna zaleta. Oznaczanie in silico oddziaływań ANS i HEART N-Domain. Wygeneruj trójwymiarową strukturę białka poprzez modelowanie molekularne przy użyciu preferowanego oprogramowania do modelowania białek.Zidentyfikuj reszty aminokwasowe, które tworzą miejsce wiązania nukleotydów, używając preferowanego oprogramowania do struktury molekularnej i określ obecność reszt argininy i lizyny. Są one wymagane do wiązania ANS i zwiększają intensywność fluorescencji. Ze względu na obecność reszt argininy i lizyny w miejscu wiązania nukleotydów SERCA, stawiamy hipotezę o wiązaniu ANS z domeną N.W modelu 3D reszty aminokwasowe tworzące miejsce wiązania ATP są identyfikowane i podświetlone na pomarańczowo. Podobnie, mutacja tyrozyny do tryptofanu jest zlokalizowana i podświetlona na niebiesko. Wykonaj dokowanie molekularne za pomocą ATP, FITC i ANS.Wyniki dokowania pokazują, że ANS dobrze pasuje do miejsca wiązania nukleotydów, podobnie jak ATP i FITC. FITC znakuje miejsce wiązania nukleotydów. Obliczyć odległość cząsteczkową między resztą tryptofanu a ANS.20 angstremów wydaje się być odpowiednią odległością dla FRET. Wykonaj symulację molekularno-dynamiczną kompleksu ANS N-Domain w celu określenia stabilności oddziaływania. Symulacja trwająca 10 nanosekund pokazuje stabilność kompleksu.Przystąp do przeprowadzenia eksperymentów in vitro. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej domeny N. Ekspresja i oczyść, za pomocą chromatografii powinowactwa, zmodyfikowaną rekombinowaną domenę N.Wykonaj SDS-PAGE oczyszczonego białka, aby określić czystość. Określić stężenie białka przez absorbancję przy długości fali 280 nanometrów ze współczynnikiem ekstynkcji w domenie N. Monitoruj tworzenie kompleksu N-domeny ANS w oparciu o zmiany intensywności fluorescencji ANS i N-domeny.Przygotować roztwór podstawowy ANS w N, N-dimetyloformamidzie. Zważ niewielką ilość ANS, od jednego do pięciu miligramów. Rozpuścić ANS w jednym ml końcowej objętości N, N-dimetyloformamidu.Przygotować 100-mikromolowy roztwór podstawowy ANS, używając roztworu ANS w N, N-dimetyloformamidzie. Wymieszaj roztwór, wirując trzy do pięciu razy. Przygotować roztwór podstawowy NBS w N, N-dimetyloformamidzie.Zważ niewielką ilość NBS, od jednego do pięciu miligramów. Rozpuścić NBS w jednym ml N, N-dimetyloformamidu. Przygotować jednomilimolowy roztwór podstawowy NBS, używając roztworu NBS w N, N-dimetyloformamidzie.Wymieszaj roztwór, wirując trzy do pięciu razy. Miareczkować domenę N za pomocą ANS i rejestrować widma fluorescencji do wzbudzenia na długości fali 295 nanometrów pod kątem 25 stopni. Uzyskaj linię bazową widma fluorescencji.Umieść jeden ml 50-milimolowego buforu fosforanowego o pH osiem w jednej ml fluorescencyjnej kuwety kwarcowej. Umieść ogniwo w termostatyzowanej komorze celi spektrofotometru i ustaw długość fali wzbudzenia na 295 nanometrów. Zapisz widmo fluorescencji.Widmo fluorescencji ślepej próby pokazuje pik wody, który należy później odjąć. Uzyskaj wewnętrzne widmo fluorescencji domeny N. Umieść 900 mikrolitrów 50-milimolowego buforu fosforanowego o pH 8 w fluorescencyjnej kuwecie kwarcowej.Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny N-Domain, aby uzyskać końcowe stężenie N-Domain o wartości jednego mikromola. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety, aby zapewnić jednorodność roztworu. Umieść ogniwo w termostatyzowanej komorze spektrofotometru.Ustaw długość fali wzbudzenia na 295 nanometrów. Zapisz wewnętrzne widmo fluorescencji w domenie N. Dodaj ANS i uzyskaj widmo fluorescencji przez wzbudzenie na długości fali 295 nanometrów.Dodać dwumikrolitrową podwielokrotność 100-mikromolowego roztworu podstawowego ANS do zawieszonej domeny N, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mikromolowego ANS. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety, aby zapewnić jednorodność tego roztworu. Zapisz widmo fluorescencji.Powtórz dodawanie ANS i zapis spektralny fluorescencji, jak opisano powyżej, dla zależności molowej 1:1 ANS N-domena. Odejmij puste widmo od każdego widma za pomocą oprogramowania. Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie Określ, czy widmo tworzy wzór podobny do FRET.Widma fluorescencji ANS N-domain tworzą wzór podobny do FRET. Miareczkowanie wewnętrznego kwitnienia w domenie N za pomocą modyfikacji chemicznej tryptofanu za pomocą NBS. Uzyskaj ponownie wewnętrzne widmo fluorescencji domeny N.Dodać jedną mikrolitrową podwielokrotność jednego milimolowego roztworu podstawowego NBS do zawieszonej domeny N, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowego NBS. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety, aby zapewnić jednorodność roztworu. Zapisz widmo fluorescencji.Powtórzyć dodawanie NBS i zapis widma fluorescencji, aż do momentu zaobserwowania minimalnego wewnętrznego wygaszania fluorescencji w domenie N. Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety, aby zapewnić jednorodność roztworu. Odejmij puste widmo od każdego widma za pomocą oprogramowania.Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie. Miareczkować zmodyfikowaną domenę N NBS za pomocą ANS, rejestrując widma fluorescencji w temperaturze 25 stopni. Dodaj ANS i uzyskaj widmo fluorescencji przez wzbudzenie na długości fali 295 nanometrów.Delikatnie homogenizować za pomocą mikropipety, aby zapewnić jednorodność roztworu. Zapisz widmo fluorescencji. Odejmij puste widmo od każdego widma za pomocą oprogramowania.Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie. Wygenerowane widma fluorescencyjne potwierdzają lub obalają występowanie FRET. Mianowicie, gdy występuje FRET, fluorescencja ANS nie wzrasta i na odwrót.Dowody na wiązanie ANS z chemicznie zmodyfikowaną domeną N poprzez wzbudzenie na długości fali 370 nanometrów. Dodaj ANS do zmodyfikowanej domeny N NBS i zarejestruj wewnętrzne widmo fluorescencji w domenie N przez wzbudzenie na długości fali 370 nanometrów. Odejmij puste widmo od każdego widma za pomocą oprogramowania.Wykreśl wszystkie widma na jednym wykresie. Potwierdź wiązanie ANS z domeną N poprzez zwiększenie intensywności fluorescencji ANS. Wiązanie ANS z domeną N wykazuje wzrost fluorescencji po wzbudzeniu na długości fali 370 nanometrów.Przegląd wyników. Panel A.ANS N-Domain complex wyświetla wzór podobny do FRET, gdy wzbudza się na długości fali 295 nanometrów. Panel B.NBS wygasza wewnętrzną fluorescencję domeny N poprzez chemiczną modyfikację jedynej reszty tryptofanu w chemicznie zmodyfikowanej domenie N.Panel C. Fluorescencja ANS wzrasta podczas wzbudzania przy długości fali 295 nanometrów. Panel D. Fluorescencja ANS zwiększa się również podczas wzbudzania na długości fali 370 nanometrów. Dlatego bezpośrednie wzbudzenie ANS o długości fali 295 nanometrów jest głównym źródłem fluorescencji ANS, gdy jest ona związana z miejscem wiązania ATP. Wnioski.Testy te mogą być wykorzystane do określenia obecności FRET między resztami tryptofanu a ANS w białkach. Wyjaśnienie FRET, potwierdzone lub nie, między tryptofanem a ANS pozwoli na wyciągnięcie lepszych wniosków w badaniach strukturalnych białek. Test może być również przydatny w przypadku stosowania innych fluoroforów.

chemical-modification-tryptophan-residue-recombinant-ca2-atpase-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Ten protokół opisuje ulepszoną metodę oczyszczania SERCA, która obejmuje trehalozę disacharydową w końcowym etapie wirowania. Węglowodan ten stabilizuje białka w trudnych warunkach. Oczyszczone SERCA było aktywne katalitycznie i wykazywało wysoką czystość, dzięki czemu nadawało się do badań strukturalnych i funkcjonalnych.

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

Poznaj metodę modyfikacji chemicznej tryptofanu w domenie N Ca²⁺-ATPazy do badania FRET z ANS. Technika fluorescencyjna pozwala określić rolę reszt tryptofanu w wiązaniu sondy ANS.

Modyfikacja chemiczna reszty tryptofanu w rekombinowanej domenie N^Ca2+-ATPazy do badania tryptofanu-ANS FRET

Przeglądaj więcej filmów