Name: Przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do Cryo-EM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Poznaj protokół przygotowania siatek próbek do cryo-EM w wysokich temperaturach do 70°C. Ta metoda pozwala badać struktury białek zależne od temperatury i ich funkcjonalność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Hervé Remigy z Thermo Fisher Scientific za przydatne rady. Eksperymenty z krio-EM przeprowadzono w Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM jest wspierany przez Academia Sinica (grant nr AS-CFII-108-110) oraz Taiwan Protein Project (nr grantu. AS-KPQ-109-TPP2). Autorzy dziękują również Pani Hui-Ju Huang za pomoc w przygotowaniu próbki.

UWAGA: Ten protokół ma na celu wykorzystanie zmodyfikowanego komercyjnego aparatu do witryfikacji próbek do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) w określonych temperaturach, szczególnie wyższych niż 37 °C. Ogólna konfiguracja eksperymentalna jest pokazana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Jako przykład w protokole podano 55 °C. Aby zapoznać się ze szczegółowymi warunkami w innych temperaturach, zapoznaj się z tabelą uzupełniającą 2 w reference12.
1. Przygotowanie aparatu do witryfikacji
<ol>
	<li>Zrób 1 cm otwór w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na jej zamkniętym końcu.</li>
	<li>Umieść probówkę w komorze aparatu do witryfikacji na wylocie wody ultradźwiękowej, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2. 
	UWAGA: Celem jest zminimalizowanie kondensacji wody poprzez doprowadzenie pary wodnej do wymiennika ciepła przez rurę przed dotarciem do całej komory.</li>
	<li>Ustaw temperaturę aparatu do witryfikacji na określoną temperaturę (np. 55 °C, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3) i pozwól, aby komora aparatu do witryfikacji osiągnęła 55 °C i 100% wilgotności względnej. Odstaw na co najmniej pół godziny, aby ustabilizować warunki przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
2. Rozgrzewka próbki i narzędzi
<ol>
	<li>Umieść łaźnię wodną na płycie grzejnej i ustaw płytę grzejną na żądaną temperaturę (tutaj 55 °C). Sprawdź termometrem, czy woda osiąga 55 °C.</li>
	<li>Inkubować próbkę w łaźni wodnej i podgrzewać końcówkę pipety na krawędzi płyty grzejnej przez 2 minuty lub dłużej przed eksperymentem z blottingiem. 
	UWAGA: Najwyższe ustawienie temperatury dla komory aparatu do witryfikacji to 60 °C. W celu przygotowania siatek o wyższej temperaturze do eksperymentu cyro-EM (np. 70 °C), próbkę inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 80 °C, a średnią między temperaturą próbki a temperaturą aparatu do witryfikacji szacuje się jako rzeczywistą temperaturę próbki na siatce (w tym przypadku 70 °C). Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji i ograniczeń dotyczących tego oszacowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do eksperymentu z blottingiem
<ol>
	<li>Rozładowanie jarzeniowe przez dziurawą siatkę opartą na węglu pod ciśnieniem 25 mA przez 30 s lub alternatywnie do wartości w zależności od zastosowanego urządzenia.</li>
	<li>Inkubować pęsetę z siatką w aparacie do witryfikacji przez 2 minuty lub dłużej.</li>
	<li>Napełnij pojemnik z etanem etanem zgodnie ze standardowymi procedurami. Nie pozwól, aby etan się przelał. 
	UWAGA: Ten krok zajmuje około 10 minut i należy go natychmiast wykonać eksperyment z bibułą, aby uniknąć zamarznięcia.</li>
	<li>Umieść bibułę filtracyjną witryfikacyjną w komorze aparatu do witryfikacji nie wcześniej niż 5 minut przed eksperymentem z bibułą. 
	UWAGA: Zbyt wczesne umieszczenie bibuły filtracyjnej w komorze spowoduje, że stanie się ona zbyt mokra.</li>
</ol>
4. Eksperyment z bibułą
UWAGA: Trzymając siatkę, upewnij się, że siatka jest stabilna i że jest minimalna powierzchnia kontaktu z pęsetą (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Ma to na celu utrzymanie najlepszej wydajności chłodzenia etanu i uniknięcie lodu nieszklistego.
<ol>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety nanieś 7-9 μl próbki na siatkę. Następnie odczekaj 1-2 s, osusz przez 1-1,5 s i szybko zanurz próbkę w ciekłym etanie.</li>
	<li>Przenieś siatkę z ciekłego etanu do krioskrzynki, która jest przechowywana w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo ostrożnie, ponieważ pęseta jest nadal gorąca, więc cały zbiornik chłodzący jest w tym czasie pełen pary.</li>
</ol>
5. Kontrola jakości siatek
<ol>
	<li>Przytnij siatki i prześlij je do instrumentu krio-EM.</li>
	<li>Użyj ekranu wyświetlacza przyrządu cryo-EM i funkcji niskiej dawki w oprogramowaniu, aby sprawdzić stan lodu na siatce i rozkład próbki na siatce. 
	UWAGA: Często kratki są bardzo suche lub warstwa lodu jest zbyt gruba. Wskaźnik powodzenia siatek przygotowanych w wysokich temperaturach jest znacznie niższy niż w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Reprezentatywne wyniki dla siatek dobrych i niezadowalających są przedstawione w następnej sekcji.</li>
	<li>Jeśli jakość powstałej siatki nie jest dobra, powtórz proces przygotowania siatki w różnych warunkach (takich jak czas oczekiwania, czas bibuły itp.). Jeśli jakość powstałej siatki jest dobra, powtórz te same kroki, aby uzyskać siatki w innej temperaturze.</li>
</ol>
6. Zbieranie danych
<ol>
	<li>Przenieś dobrej jakości siatki do instrumentu kriogenicznego o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Gromadzenie i analiza danych odbywa się zgodnie z ustalonymi procedurami. 
	UWAGA: Jak wykazano w naszej poprzedniej publikacji, na rozdzielczość struktury nie ma wpływu wysoka temperatura12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W kroku 1 protokołu upewnij się, że probówka wirówkowa została dobrze zainstalowana i nie spada podczas trwania eksperymentu. Ze względu na gromadzenie się dużej liczby kropelek wody w komorze, które mogą zmienić zdolność adsorpcji bibuły filtracyjnej, zaleca się, aby całkowity czas eksperymentu nie przekraczał 30 minut po osiągnięciu przez komorę aparatu do witryfikacji temperatury równowagi. Jeśli czas pracy przekracza 30 minut, operator musi wymienić bibułę filtracyjną i poczekać, aż kabina ponownie zrównoważy tempera...

Technologia cryo-EM do rozwiązywania struktur kompleksów białkowych jest stale ulepszana, szczególnie w kierunku uzyskiwania struktur o wysokiej rozdzielczości1,2. W międzyczasie krajobraz jego zastosowania został również rozszerzony poprzez zmianę warunków próbki, takich jak pH lub ligandy, przed procesem witryfikacji3, który obejmuje przygotowanie siatek próbek, a następnie zamrażanie wgłębne4,5. Kolejnym ważnym warunkiem jest temperatura. Chociaż eksperymenty krio-EM, takie jak krystalografia rentgenowska, są wykonywane w niskich temperaturach, struktura rozwiązana przez cryo-EM odzwierciedla strukturę w stanie roztworu przed witryfikacją. Do niedawna większość badań krio-EM analizy pojedynczych cząstek (SPA) wykorzystuje próbki, które są przechowywane na lodzie (tj. w temperaturze 4 °C) przed witryfikacją6, chociaż wiele badań wykorzystuje próbki w temperaturze zbliżonej do temperatury pokojowej7,8,9,10 lub nawet 42 °C11. W niedawnym raporcie przeprowadziliśmy zależne od temperatury badania enzymu reduktoizomerazy kwasu ketolowego (KARI) z termofilnego archeonu Sulfolobus solfataricus (Sso) w sześciu różnych temperaturach od 4 °C do 70°C12. Nasze badania sugerują, że ważne jest przygotowanie siatek próbek w funkcjonalnie odpowiednich temperaturach i że cryo-EM jest jedyną metodą strukturalną, która jest praktycznie wykonalna do rozwiązania struktury tego samego kompleksu białkowego w wielu temperaturach.
Główną trudnością w przypadku witryfikacji w wysokich temperaturach jest zminimalizowanie kondensacji pary wodnej i uzyskanie cienkiego lodu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół używany do przygotowania siatek próbek w wysokich temperaturach w naszym poprzednim badaniu klasy Sso-KARI<sup="xref">12. Zakładamy, że czytelnicy lub widzowie mają już doświadczenie w ogólnym przygotowywaniu próbek i procedurach przetwarzania danych do eksperymentów krio-EM i kładziemy nacisk na aspekty związane z wysoką temperaturą.

<table><tbody><tr><td>Rurka Falcon</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>rozmiar: 50 ml</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Ted Pella</td><td>47000-100</td><td>&Oslash; 55/20mm, klasa 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>Kąpiel wodna</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>K100X</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td></td><td>wyładowanie jarzeniowe</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2/1.3 Siatka 200Mesh Cu</td><td>Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>obrazowanie niskodawkowe</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Vitrobot Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do cryo-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Siatki próbek do eksperymentów z mikroskopią krioelektronową (cryo-EM) są zazwyczaj przygotowywane w temperaturze optymalnej do przechowywania próbek biologicznych, przeważnie w temperaturze 4 °C, a czasami w temperaturze pokojowej. Niedawno odkryliśmy, że struktura białka rozpuszczona w niskiej temperaturze może nie być funkcjonalnie istotna, szczególnie w przypadku białek z archeonów ciepłolubnych. Opracowano procedurę przygotowania próbek białek w wyższych temperaturach (do 70 °C) do analizy krioelektromagnetycznej. Wykazaliśmy, że struktury z próbek przygotowanych w wyższych temperaturach są funkcjonalnie istotne i zależne od temperatury. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół przygotowania siatek próbek w wysokiej temperaturze, na przykładzie 55 °C. W doświadczeniu wykorzystano aparat do witryfikacji zmodyfikowany za pomocą dodatkowej probówki wirówkowej, a próbki inkubowano w temperaturze 55 °C. Szczegółowe procedury zostały dopracowane w celu zminimalizowania kondensacji pary wodnej i uzyskania cienkiej warstwy lodu na siatce. Podano przykłady udanych i nieudanych eksperymentów.

Przegląd przy małym powiększeniu przedstawiono na Rycini 5A,B. Panel A jest przykładem prawidłowo przygotowanej siatki. Widoczny jest gradient lodu od lewego górnego rogu (grubszy) do prawego dolnego rogu (cieńszy lub pusty). Taka siatka ułatwia znalezienie w obszarze środkowym odpowiedniej grubości warstwy lodu nadającej się do gromadzenia danych, np. w obszarach zaznaczonych niebieskimi i zielonymi ramkami. Siatka B jest zbyt sucha. Kwadraty w siatce wykazują jasny kontras...

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania siatek próbek w temperaturach tak wysokich jak 70 °C, przed zamrożeniem zanurzeniowym do eksperymentów krio-EM.

Przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Funkcje białek są zależne od temperatury i są optymalne w tej temperaturze. Protokół ten zapewnia sposób rozwiązywania struktur białkowych w wyższych temperaturach. Takie podejście może dostarczyć funkcjonalnie istotnych struktur i poszerzyć wiedzę na temat zależności struktur białkowych od temperatury.Procedurę zademonstruje Yuan-Chih Chang, kierownik placówki Academia Sinica Cryo EM. Zacznij od zrobienia jednocentymetrowego otworu w 50-milimetrowej probówce wirówkowej na jej zamkniętym końcu. Umieścić probówkę w komorze aparatu do witryfikacji na wylocie wody ultradźwiękowej.Ustaw temperaturę aparatu do witryfikacji na określoną temperaturę i pozwól, aby komora aparatu do witryfikacji osiągnęła 55 stopni Celsjusza i 100% wilgotności względnej. Odstaw na co najmniej pół godziny, aby ustabilizować warunki przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieść łaźnię wodną na płycie grzejnej i ustaw płytę grzejną na żądaną temperaturę.Sprawdź termometrem, czy woda osiąga 55 stopni Celsjusza. Inkubować próbkę w łaźni wodnej i podgrzewać końcówkę pipety na krawędzi płyty grzejnej przez dwie minuty lub dłużej przed eksperymentem z blottingiem. Żar wyładowuje dziurawą siatkę węglową o natężeniu 25 miliamperów przez 30 sekund.Umieścić bibułę filtracyjną do witryfikacji w komorze aparatu do witryfikacji nie wcześniej niż pięć minut przed eksperymentem z bitryfikacją. Inkubować pęsetę z siatką w aparacie do witryfikacji przez dwie minuty lub dłużej. Zbuduj pojemnik na etan z etanem zgodnie ze standardowymi procedurami, upewniając się, że etan nie przeleje się.Za pomocą pipety nanieść od siedmiu do dziewięciu mikrolitrów próbki na siatkę. Następnie odczekaj od jednej do dwóch sekund, osusz przez jedną do półtorej sekundy i szybko zanurz próbkę w ciekłym etanie. Przenieś siatkę z ciekłego etanu do kriokomory przechowywanej w ciekłym azocie.Przytnij siatki i rozładuj je, aby uzyskać mikroskop elektronowy lub instrument Cryo EM. Użyj ekranu wyświetlacza przyrządu Cryo EM i funkcji niskiej dawki w oprogramowaniu, aby sprawdzić stan lodu na siatce i rozkład próbki na siatce. Jeśli jakość powstałej siatki nie jest dobra, powtórz proces przygotowania siatki w różnych warunkach, takich jak czas oczekiwania, czas bibułowania i tak dalej.Jeśli jakość powstałej siatki jest dobra, powtórz te same kroki, aby uzyskać siatki w innej temperaturze. Przenieś dobrej jakości siatki do instrumentu Cryo EM o wysokiej rozdzielczości. Gromadzenie i analiza danych odbywa się zgodnie z ustalonymi procedurami.W przypadku udanej siatki utworzył się gradient lodu z grubszym lodem w lewym górnym rogu siatki i cieńszym lodem w prawym dolnym rogu. W udanej siatce zaobserwowano niebieskie i zielone pola nadające się do gromadzenia danych. Jasny kontrast zaobserwowano w drugiej siatce.Wskazujące na cienką warstwę lodu lub brak lodu. Tylko dwa kwadraty okazały się odpowiednie do zbierania danych w drugiej siatce. Jedna z siatek składała się z lodu, w większości w postaci krystalicznej, który nie nadawał się do zbierania danych.Z drugiej strony, druga siatka pokazała, że warstwa lodu była w większości w stanie amorficznym odpowiednim do zbierania danych. Przygotowanie jako pojemnika i innych musi być zakończone zgodnie z punktem czasowym. Najważniejsza jest kontrola czasu oraz szybkie i dokładne zakończenie eksperymentu.W zależności od wyników uzyskanych przy użyciu tego protokołu, badacz może być zmuszony do większej ostrożności w ustawianiu prostych warunków.

preparation-of-high-temperature-sample-grids-for-cryo-em

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół korzystania z urządzenia do szybkiego tworzenia siatki, zarówno do szybkiego tworzenia siatki, jak i do szybkiego mieszania i zamrażania w celu przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową.

Szybkie przygotowanie siatki do czasowo-rozdzielczej mikroskopii krioelektronowej

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Protokół krok po kroku do wytwarzania siatek powinowactwa streptawidyny jest dostępny do wykorzystania w badaniach strukturalnych trudnych próbek makromolekularnych za pomocą mikroskopii krioelektronowej.

Wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj protokół przygotowania siatek próbek do cryo-EM w wysokich temperaturach do 70°C. Ta metoda pozwala badać struktury białek zależne od temperatury i ich funkcjonalność.

Przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do Cryo-EM

Przeglądaj więcej filmów