Name: Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii świetlnej przechodzącej i oprogramowania ImageJ Fiji. Ta technika umożliwia precyzyjne śledzenie dynamiki wzrostu grzybni w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez projekt "Grecka infrastruktura badawcza do wizualizacji i monitorowania podstawowych procesów biologicznych (BioImaging-GR)" (MIS 5002755), który jest realizowany w ramach działania "Wzmocnienie infrastruktury badawczej i innowacyjnej", finansowanego przez Program Operacyjny "Konkurencyjność, Przedsiębiorczość i Innowacje" (NSRO 2014-2020) i współfinansowanego przez Grecję i UE.

1. Przygotowanie inokulum
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane pod komorą z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej rozprowadzić interesujący szczep grzyba z wywaru glicerolu (-80 °C) na płytki z minimalną ilością pożywki (MM) uzupełnione odpowiednimi wymaganiami żywieniowymi istotnymi dla badanego szczepu [MM: 10,0 g/L glukozy, 20 mL/L roztwór soli (roztwór soli: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L chloroformu) i 1 mL/L pierwiastków śladowych (pierwiastki śladowe: 40 mg/L Na2B4O7·H2O, 400 mg/LCuSO4, 8 g/LZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), dostosować pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH, Dodać 1 % (w/v) agaru i wymagane dodatki zgodnie z opisem w<klasa SUP = "xref" >16 i autoklaw] (< klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Roztwór soli, roztwór pierwiastków śladowych i suplementy są sterylizowane w autoklawie.</li>
	<li>Inkubować przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj sterylnej wykałaczki (lub pętli do zaszczepiania), przenieś niewielką ilość konidiów, delikatnie dotykając pojedynczej kolonii, na płytki z kompletnymi pożywkami (CM) [CM: 10,0 g/L glukozy, 2,0 g/L peptonu, 1,0 g/L ekstraktu drożdżowego, 1,0 g/L casaminokwasów, 20 mL/L roztworu soli, 1 mL/L pierwiastków śladowych, 5 mL/L roztworu witaminowego (roztwór witaminy: 0,1 g/l ryboflawiny, 0,1 g/l nikotynamidu, 0,01 g/l kwasu p-aminobenzoesowego, 0,05 g/l chlorowodorku pirydoksyny, 1,0 mg/l biotyny), dostosować pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH, dodać 1 % (w/v) agaru i wymagane suplementy zgodnie z opisem w16 i autoklawie]. Autoklaw i przechowywać roztwór witamin w ciemnej butelce o temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W przypadku, gdy wzrost grzybów jest zbyt gęsty, aby zidentyfikować i wyizolować poszczególne kolonie, ponownie nałóż smugi na nową płytkę agarową, aby uzyskać pojedyncze kolonie.</li>
	<li>Inkubować przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uzyskać zawiesinę konidialną o wymiarach około 2 x 106 komórek/ml, drapiąc 1 cm od powierzchni konidydowanej kolonii grzybów wyhodowanych na płytkach agarowych CM, używając sterylnej wykałaczki (ryc. S1). 
	UWAGA: W razie potrzeby policz konidia za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zebrać konidia A. nidulans w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml z 1,0 ml autoklawowanej wody destylowanej zawierającej 0,05% (v/v) Tween 80 w celu zmniejszenia liczby grudek konidiów. 
	UWAGA: Konidia mogą być przechowywane do 2-3 tygodni w temperaturze 4 °C bez istotnej utraty żywotności (A. Athanasopoulos i V. Sophianopoulou, dane niepublikowane). Zaleca się jednak filtrowanie i/lub płukanie zawiesiny konidialnej w celu usunięcia części grzybni i składników odżywczych, aby zapobiec obrzękowi konidiów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do obrazowania grzybów strzępkowych rosnących na podłożach agarowych (stałych)
UWAGA: Używana jest zmodyfikowana wersja metody 'inverted agar17,18.
<ol>
	<li>Początkowo umieść 10 μl porcji silnie wirowanych konidiałów (około 2 x 104 komórek/ml) w kilku punktach na szalkach Petriego (Ø9 cm) 15 ml MM z 1% (w/v) agarem (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Stosując zmodyfikowaną wersję "metody odwróconego agaru", możliwe jest obrazowanie próbek grzybów przez wiele godzin bez widocznego szkodliwego wpływu na rosnące strzępki.</li>
	<li>Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany.</li>
	<li>Wytnij blok agaru o średnicy ≈0,8 mm2 zawierający kolonię za pomocą sterylnego skalpela. 
	UWAGA: Wymiary bloku agaru, który ma zostać wycięty, zależą od wymiarów sprzętu, który ma być umieszczony później. W niniejszej pracy wykorzystano 8 studni μ-szkiełkowych (patrz poniżej).</li>
	<li>Odwrócić i umieścić blok agarowy w studzience z szkiełka μ lub podobnego 8-komorowego szkła nakrywkowego z szkiełkiem nakrywkowym odpowiednim do obrazowania na żywo. 
	UWAGA: W przypadku, gdy mikroskopia w świetle przechodzącym będzie stosowana w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną (znakowaną), blok agaru można odwrócić na kroplę płynnego podłoża zawierającego barwnik barwiący żywe komórki, tuż przed obrazowaniem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do obrazowania grzybów strzępkowych rosnących na płynnym podłożu
<ol>
	<li>Przenieść 10 μl podwielokrotności silnie wirowanej zawiesiny konidialnej (około 2 x 104 komórek/ml) do studzienek 8-dołkowego szkiełka μ zawierającego 200 μl (płynnego) MM z odpowiednimi dodatkami (patrz wyżej).</li>
	<li>Inkubuj przez żądany czas w żądanej temperaturze (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Jeśli mikroskopia w świetle przechodzącym będzie używana w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną (znakowaną), kultury płynne mają tę wielką zaletę, że barwniki fluorescencyjne mogą być dodawane w dowolnym momencie podczas eksperymentu19.</li>
</ol>
4. Przechwytywanie obrazów
UWAGA: Wybór mikroskopu zależy od dostępnego sprzętu. W każdym przypadku zestaw mikroskopu powinien zawierać odwrócony stolik, komorę środowiskową lub przynajmniej pomieszczenie z precyzyjną kontrolą temperatury powietrza.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem rozgrzej termostatyczną komorę mikroskopu do temperatury 37 °C (chyba że wskazano inaczej lub jest to odpowiednie dla stosowanych gatunków grzybów), aby ustabilizować temperaturę. Komora ta umożliwia modulację temperatury optyki mikroskopu i stolika na próbkę podczas eksperymentów poklatkowych. Należy pamiętać, że aberracje optyczne20 są wprowadzane, gdy normalne olejki immersyjne (przeznaczone do użytku w temperaturze 23 °C) są używane w temperaturze 37 °C lub wyższej. 
	UWAGA: Przy ograniczonym budżecie komory inkubacyjne mogą być wykonane z tektury i izolacyjnego materiału opakowaniowego21 lub za pomocą drukarki 3D22.</li>
	<li>Włącz mikroskop, zasilanie skanera, zasilanie lasera i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania. Umieść μ-szkiełko podstawowe (przygotowane wcześniej) w stoliku mikroskopu i ustaw ostrość.</li>
	<li>Znajdź pola widzenia, które zawierają izolowane/nie nakładające się na siebie komórki (lub przynajmniej nie są przepełnione), aby ułatwić pomiary wzrostu podczas analizy obrazu. Weź co najmniej 50 rosnących komórek na próbkę, aby umożliwić solidną analizę statystyczną.</li>
	<li>Wybierz żądane podejście do mikroskopii w świetle przechodzącym. Skróć czas naświetlania lub moc lasera i czas przebywania pikseli i/lub zwiększ średnice otworków, aby zminimalizować fotowybielanie komórek grzybów, zgodnie z opisem w innym miejscu 23,24.</li>
	<li>Ustaw mikroskop, aby rejestrować obrazy w żądanych odstępach czasu i rozpoczynać akwizycję szeregów czasowych. 
	UWAGA: Aby skorygować przesunięcie ogniskowej w czasie (szczególnie w przypadku długich eksperymentów), spowodowane dryftem termicznym, różnymi rozmiarami komórek i ruchem komórek, użyj strategii autofokusa, jeśli jest dostępna w oprogramowaniu mikroskopu.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
UWAGA: Ta sekcja opisuje kluczowe etapy przetwarzania obrazów z mikroskopii poklatkowej do pomiaru tempa wzrostu A. nidulans. Otwieranie, wizualizacja i przetwarzanie obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji o otwartym kodzie źródłowym25.
<ol>
	<li>Importuj obrazy na Fidżi za pomocą wtyczek | Formaty biologiczne | Importer formatów biologicznych z menu Fidżi z ustawieniami domyślnymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Sprawdź, czy importer formatów biologicznych prawidłowo rozpoznaje kalibrację obrazu. Wymiar obrazu pokazany w oknie obrazu w górnym polu informacyjnym musi być równy oryginalnym wymiarom obrazu (Rysunek 4B). Naciśnij Shift + P, aby wyświetlić i zmienić właściwości obrazu w oprogramowaniu ImageJ/Fiji.</li>
	<li>W razie potrzeby użyj histogramu matching26 do korekcji oświetlenia między różnymi klatkami (Obraz | Dostosuj | Korekcja wybielacza | Dopasowanie histogramu) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>W razie potrzeby użyj algorytmu SIFT (Wtyczki | Rejestracja | Linear Stack Alignment with SIFT) do wyrównywania lub dopasowywania stosów obrazów (Rysunek 4D). Wybranie opcji "Translacja" z menu oczekiwanej transformacji powinno wystarczyć, aby skorygować dryf x-y. 
	UWAGA: Inne wtyczki mogą być również używane do wyrównywania stosu plasterków obrazu, takie jak Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) lub StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).</li>
	<li>Wybierz strzępki, które rosną równolegle do szkiełka nakrywkowego, unikając tych, które są pochylone. Pamiętaj, aby wybrać strzępki, które rozchodzą się przez rozciągnięcie biegunowe i unikać strzępek z rozgałęzieniami bocznymi i/lub wierzchołkowymi.</li>
	<li>Korzystanie z MTrackJ (Wtyczki | MTrackJ) do śledzenia rosnących końcówek strzępek (Rysunek 4E)27. Aby dodać ścieżkę, wybierz przycisk Dodaj na pasku narzędzi i umieść pierwszy punkt na końcówce łącznika, klikając lewym przyciskiem myszy. Szereg czasowy zostanie automatycznie przeniesiony do następnej klatki. Aby zakończyć proces śledzenia, kliknij dwukrotnie myszką na ostatni punkt (lub naciśnij Esc) (Rysunek 4F). Przejdź do innego interesującego punktu (tj. rosnącej końcówki strzępki) w początkowym przedziale czasowym i uruchom ponownie procedurę, mierząc tempo wzrostu innej strzępki. 
	UWAGA: Aby zainstalować MTrackJ, postępuj zgodnie z instrukcjami przedstawionymi na stronie https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/</li>
	<li>Kliknij przycisk Zmierz w oknie dialogowym MTrackJ (Rysunek 4G), aby otworzyć tabelę wyników. Zapisz pomiary ścieżki (punkt menu Plik | Zapisz jako) do żądanego formatu pliku (np. csv), przeanalizuj je i wykreśl (Rysunek 4H). 
	UWAGA: Wybranie przycisku Film powoduje utworzenie filmu pokazującego obraz i postęp ścieżki.</li>
</ol>

<ol><li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+nidulans%3A+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).</li>
<li>Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+Fungi+to+Work%3A+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs%2C+Toxins%2C+and+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li>
<li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus%2C+Fusarium+and+Mucor%5BTitle%5D)+AND+%22Microoraganism%22%5BJournal%5D)">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li>
<li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+Pathogenic+Fungi%3A+Genomics%2C+Molecular+Interactions%2C+and+Genetic+Improvements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li>
<li>Etxebeste, O., Espeso, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+nidulans+in+the+post-genomic+era%3A+a+top-model+filamentous+fungus+for+the+study+of+signaling+and+homeostasis+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms.</a> International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).</li>
<li>Riquelme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Morphogenesis%2C+from+the+Polarized+Growth+of+Hyphae+to+Complex+Reproduction+and+Infection+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews+MMBR%22%5BJournal%5D)">Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).</li>
<li>Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+plasma+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fungal plasma membrane domains.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2019).</li>
<li>Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Dynamics+of+the+Aspergillus+nidulans+Golgi+during+Apical+Extension+and+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).</li>
<li>Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+global+gene+expression+and+secondary+metabolite+accumulation+during+light-dependent+Aspergillus+nidulans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development.</a> Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).</li>
<li>Yu, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Development+in+Aspergillus+nidulans+and+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Mycobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus.</a> Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).</li>
<li>Tomkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth%3A+The+petri+dish+method%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+British+Mycological+Society%22%5BJournal%5D)">Measuring growth: The petri dish method.</a> Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).</li>
<li>Gifford, D. R., Schoustra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+colony+population+growth+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).</li>
<li>Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+live+cell+behaviour%3A+Traditional+label-free+and+quantitative+phase+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).</li>
<li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+microscopy+for+non-invasive+live+cell+population+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring.</a> Scientific Reports. 11, (2021).</li>
<li>Chessel, A., Carazo Salas, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+observing+to+predicting+single-cell+structure+and+function+with+high-throughput%2Fhigh-content+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy.</a> Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).</li>
<li>Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Aspergillus+nidulans%3A+meiotic+progeny+for+genetic+analysis+and+strain+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction.</a> Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).</li>
<li>Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi+Using+Vital+Fluorescent+Dyes+and+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy.</a> Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).</li>
<li>Trinci, A. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinetic+Study+of+the+Growth+of+Aspergillus+nidulans+and+Other+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi.</a> Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).</li>
<li>Lichius, A., Zeilinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Membrane+and+Cell+Wall+Selective+Fluorescent+Dyes+for+Live-Cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60613(2019).</li>
<li>Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersion+oil+for+high-resolution+live-cell+imaging+at+37%C2%B0C%3A+optical+and+physical+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics.</a> Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).</li>
<li>Distel, M., Köster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+of+Zebrafish+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development.</a> CSH protocols. 2007, (2007).</li>
<li>Walzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+low-cost+long-term+live-cell+imaging+platform+for+biomedical+research+and+education%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education.</a> Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494(2020).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).</li>
<li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391(2021).</li>
<li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li>
<li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li>
<li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li>
<li>Peñalva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li>
<li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy%3A+CellStar+and+the+Evaluation+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705(2017).</li>
<li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+of+fungal+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li>
<li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyphaTracker%3A+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li>
<li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Monitorowanie wzrostu i fenotypu komórek grzybów za pomocą mikroskopii poklatkowej jest skutecznym podejściem do oceny zachowania komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowego i dokładnego określenia, czy określone leczenie farmakologiczne i/lub interwencja genetyczna powoduje wykrywalny wzrost komórek lub różnice fenotypowe w czasie.
W tym badaniu opisano wiarygodną metodologię obrazowania żywych komórek w celu pomiaru i ilościowej analizy rozwoju grzybów, w tym dynamiki wzrostu rurki zarodk...

Grzyby strzępkowe mają ogromne znaczenie społeczno-ekonomiczne i ekologiczne, będąc zarówno kluczowymi narzędziami przemysłowymi/rolniczymi do produkcji enzymów i antybiotyków1,2 oraz jako patogeny roślin uprawnych3, szkodniki owady4 i ludzie3. Co więcej, grzyby strzępkowe, takie jak Aspergillus nidulans, są szeroko stosowane jako organizmy modelowe do badań podstawowych, takich jak badania z zakresu genetyki, biologii komórkowej i ewolucyjnej, a także do badania rozszerzenia strzępek5. Grzyby strzępkowe są wysoce spolaryzowanymi organizmami, które wydłużają się poprzez ciągłe dostarczanie lipidów/białek błonowych i syntezę de novo ściany komórkowej na rozszerzającym się końcu6. Kluczową rolę we wzroście końcówki strzępki i utrzymaniu polaryzacji odgrywa wyspecjalizowana struktura o nazwie "Spitzenkorper" (SPK), wysoce uporządkowana struktura składająca się głównie ze składników cytoszkieletu i spolaryzowanego rozkładu klasy Golgi<sup="xref">6,7,8.
Bodźce/sygnały środowiskowe, takie jak interfejs woda-powietrze, światło, stężenie CO2 i stan odżywienia są odpowiedzialne za decyzje rozwojowe podejmowane przez te pleśnie9. W kulturach zanurzonych (płynnych) różnicowanie A. nidulans jest tłumione, a wzrost następuje przez wydłużenie końcówki strzępek6. Podczas wzrostu wegetatywnego bezpłciowe zarodniki (konidia) kiełkują przez przedłużenie wierzchołkowe, tworząc niezróżnicowaną sieć połączonych ze sobą komórek strzępkowych, grzybnię, która może rosnąć w nieskończoność, o ile dostępne są składniki odżywcze i przestrzeń. Z drugiej strony, na podłożu stałym końcówki strzępek wydłużają się i po określonym okresie wzrostu wegetatywnego (kompetencji rozwojowej) inicjowane jest rozmnażanie bezpłciowe, a łodygi konidioforów powietrznych wyrastają z wyspecjalizowanych komórek stopy grzybni6. Powodują one powstawanie wyspecjalizowanych rozwojowych struktur wielokomórkowych zwanych konidioforami, które wytwarzają długie łańcuchy haploidalnych konidiów10, które mogą wznowić wzrost w sprzyjających warunkach środowiskowych.
Powszechnie stosowaną metodą pomiaru wzrostu grzybów nitkowatych jest zaszczepienie zarodników na agarze odżywczym znajdującym się na szalce Petriego i makroskopowe zmierzenie średnicy kolonii kilka dni później11. Średnica/obszar kolonii, najbardziej zależny od zmian w tempie wzrostu grzybni, a mniej od gęstości konidioforów12, jest następnie używany jako wartość wzrostu. Chociaż pomiar wielkości populacji (kolonii) grzybów rosnących na powierzchniach stałych jest całkiem wystarczający, w żadnym wypadku nie jest to najdokładniejsza miara wzrostu. W porównaniu ze średnimi poziomami populacji (średnimi wielkościami kolonii grzybów), pomiary pojedynczych komórek mogą uchwycić heterogeniczność populacji komórek i umożliwić identyfikację nowych subpopulacji komórek, stanów13, dynamiki, szlaków, a także biologicznych mechanizmów, za pomocą których komórki reagują na zmiany endogenne i środowiskowe14,15. Monitorowanie wzrostu i fenotypu komórek grzybów za pomocą mikroskopii poklatkowej jest prawdopodobnie najpowszechniej stosowanym ilościowym podejściem do obserwacji pojedynczych komórek.
Tutaj szczegółowo opisujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego (takie jak kontrast fazowy, kontrast interferencyjny różnicowy (DIC) i mikroskopia spolaryzowana) do przechwytywania obrazów, które niezależnie od połączonego użycia mikroskopii fluorescencyjnej mogą być wykorzystane do analizy i ilościowego określenia wzrostu polarnego szczepów A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w pożywkach stałych.

<table><tbody><tr><td>&mikro;-Slide 8 Well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Szkiełka obrazowe</td></tr><tr><td>Kwas 4-aminobenzoesowy</td><td>Merck</td><td>A9878</td><td></td></tr><tr><td>azhA&Delta; ngnA&Delta;</td><td></td><td></td><td>Genotyp: zhA&Delta;::p yrGAf; ngnA&Delta;::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Referencje:Kolekcja laboratoryjna, Athanasopoulos et al., 2013</td></tr><tr><td>Bacto Casamino Acids</td><td>Gibco</td><td>223030</td> Biotyna Merck B4639 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Penhydrat siarczanu miedzi(II)</td><td>Merck</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> GraphPad <td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów Pętla</td></tr><tr><td>inokulacyjna</td><td>Merck</td><td>I8263-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan żelaza(III)</td><td>Merck</td><td>1.03935</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Oprogramowanie mikroskopu</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Merck</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Jednowodny siarczan manganu(II)</td><td>Merck</td><td>M7899</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid (niacynamid)</td><td>Supelco</td><td>47865-U</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Millipore</td><td>68971</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego do hodowli mikrobiologicznej</td><td>KISKER</td><td>G090</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Merck</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek pirydoksyny</td><td>Merck</td><td>P6280</td><td></td></tr><tr><td>Quali - Probówki do mikrowirówek, 1,7 mL, wolne od DNaz, RNaz i pirogenów, sterylne</td><td>KISKER</td><td>G052-S</td><td></td></tr><tr><td>Quali - Probówki do mikrowirówek, 2,0 mL, sterylne</td><td>KISKER</td><td>G053-S</td><td></td></tr><tr><td>Quali - Końcówki standardowe, fazowane, 100-1000 &mikro; L</td><td>KISKER</td><td>VL004G</td><td></td></tr><tr><td>Quali - Końcówki standardowe, skośne, 1-200 &mikro; L</td><td>Końcówki mikroobjętościowe KISKER</td><td>VL700G</td><td></td></tr><tr><td>Quali, bez DNaz, RNaz, 0,1-10 i mikro; L/przezroczysty</td><td>KISKER</td><td>GC. PORADY. B</td><td></td></tr><tr><td>Ryboflawina (B2)</td><td>Supelco</td><td>47861</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela NR 11</td><td>OdontoMed2011</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu dekahydrat</td><td>Merck</td><td>S9640</td><td></td></tr><tr><td>VS151 (PilA-GFP i H1-mRFP)</td><td></td><td></td><td>Genotyp: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&Delta;::argB+&nbsp; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ ryboB2 / Referencje:Kolekcja laboratoryjna, Biratsi et al., 2021</td></tr><tr><td>WT</td><td></td><td></td><td>Genotyp: nkuA&Delta;::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Referencje: TN02A3 -FGSC A1149</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Millipore</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa tempa wzrostu aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Jest dobrze ustalone, że wzrost kolonii grzybów strzępkowych, głównie zależny od zmian w tempie wzrostu wierzchołków strzępek/grzybni, jest makroskopowo szacowany na zastygłych podłożach, porównując wielkość kolonii. Jednak ilościowy pomiar tempa wzrostu genetycznie różnych szczepów grzybów lub szczepów w różnych warunkach środowiskowych/wzrostu (pH, temperatura, źródła węgla i azotu, antybiotyki itp.) jest wyzwaniem. W związku z tym konieczne staje się poszukiwanie uzupełniających podejść do ilościowego określania kinetyki wzrostu, aby lepiej zrozumieć wzrost komórek grzybów. Ponadto dobrze wiadomo, że grzyby strzępkowe, w tym Aspergillus spp., mają odrębne tryby wzrostu i różnicowania w warunkach podpowietrznych na podłożach stałych lub zanurzonych kulturach. W tym miejscu szczegółowo opisujemy ilościową metodę mikroskopową do analizy kinetyki wzrostu modelowego grzyba Aspergillus nidulans, wykorzystując obrazowanie na żywo zarówno w zanurzonych kulturach, jak i w pożywkach stałych. Przechwytujemy obrazy, analizujemy i określamy ilościowo tempo wzrostu różnych szczepów grzybów w powtarzalny i niezawodny sposób przy użyciu bezpłatnego oprogramowania typu open source do obrazów biologicznych (np. Fidżi), w sposób, który nie wymaga od użytkownika żadnej wcześniejszej wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Postępując zgodnie z niniejszym protokołem, zarejestrowaliśmy i przeanalizowaliśmy różne obrazy odpowiadające różnym etapom wzrostu i rozwoju grzyba nitkowatego A. nidulans. Dane przedstawione w niniejszym badaniu zostały przetworzone i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Fiji. Pomiary zapisano w plikach csv, poddano analizie statystycznej i przedstawiono w formie wykresów przy użyciu komercyjnego oprogramowania statystycznego i/lub języka programowania Python z wykorzystaniem bibliotek takich jak pandas,...

Prezentujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego do przechwytywania obrazów, analizy i ilościowego określania kinetyki wzrostu nitkowatego grzyba A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w podłożach stałych. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną.

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

W tym filmie opisujemy protokół obrazowania na żywo bez etykiet do przechwytywania obrazów modelowego grzyba aspergillus nidulans przy użyciu technik mikroskopii światła przechodzącego. Używamy tych obrazów do analizy i ilościowego określenia kinetyki wzrostu Aspergillus nidulans zarówno w pożywkach ciekłych, jak i stałych. Wizualna reprezentacja tego protokołu pozwala użytkownikom zapoznać się z istotnymi etapami przechwytywania obrazu i przetwarzania obrazu w mikroskopii.Powszechną metodą stosowaną do pomiaru wzrostu grzybów nitkowatych jest zaszczepienie dwóch zarodników grzybów na szalce Petriego zawierającej agar odżywczy i zmierzenie średnicy rozwijającej się kolonii kilka dni później. Podejście to nie jest jednak wystarczająco czułe, aby określić ilościowo drobne różnice we wzroście. W związku z tym opracowano pomiary pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej.Pomiary te są w stanie nie tylko dostarczyć dokładnych i ilościowych wyników, ale także odzwierciedlić dynamikę wzrostu różnych komórek w populacji. Co więcej, podejście to ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w reakcje wzrostu grzybów na sygnały endogenne i środowiskowe. Zacznij od wlania 15 mililitrów płynnego agaru odżywczego do szalek Petriego.Umieść pokrywkę na wierzchu i pozwól jej ostygnąć. Użyj promieniowania UV do sterylizacji płytek. Przed usunięciem interesującego szczepu grzyba z bulionu, podgrzej pętlę guzkową w palniku Bunsena, aż będzie rozgrzana do czerwoności, ostudź pętlę, wbijając ją do agaru.Zmieszać probówkę i rozprowadzić pętlę po powierzchni agaru minimalnym podłożem uzupełnionym odpowiednimi wymaganiami żywieniowymi. Inkubuj płytki przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej wykałaczki przenieś niewielką liczbę konidiów, delikatnie dotykając pojedynczej kolonii na płytki z kompletną pożywką.Inkubuj płytki przez trzy do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Konidia z rodzaju aspergillus nidulans zbiera się w sterylnej 1,5-mililitrowej probówce wirowej, z 1,0 mililitrem wody destylowanej w autoklawie zawierającej 0,05% objętości na objętość, Tween 80, w celu zmniejszenia liczby grudek konidiów. Zmodyfikowana wersja metody odwróconego agaru służy do obrazowania grzybów strzępkowych na powierzchni podłoża agarowego.Początkowo należy zauważyć 10 mikrolitrów energicznie wirowej zawiesiny konidialnej, około dwa razy 104 komórki na mililitr na szalkach Petriego o minimalnej pożywce 15 mililitrów z jedną wagą na objętość. Inkubować kulturę eksperymentalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Tutaj inkubujemy przez trzy dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Następnie wytnij blok agaru zawierający kolonię za pomocą sterylnego skalpela. Tutaj wycinamy klin agaru na brzegu kolonii, odwracamy i umieszczamy plasterek agaru w ośmiodołkowym szkiełku. Przenieść 10 mikrolitrów energicznie wirowej zawiesiny konidialnej o sile około dwa razy 10 w sile czterech do studzienek szkiełka studziennego zawierającego 200 mikrolitrów minimalnej pożywki z odpowiednimi dodatkami.Inkubować za każdym razem przez czas i temperaturę, które mają być badane. Wybór mikroskopu zależy od dostępnego sprzętu. W każdym przypadku zestaw mikroskopowy powinien zawierać odwrócony stolik, komorę środowiskową lub przynajmniej pomieszczenie z precyzyjną kontrolą temperatury powietrza.Wstępnie podgrzej termostat i komorę mikroskopu, aby ustabilizować żądaną temperaturę. Tutaj ustawiamy temperaturę na 30 stopni Celsjusza. Włącz mikroskop, zasilanie skanera, zasilanie lasera i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania.Umieść wcześniej przygotowany szkiełko w stoliku mikroskopowym i ustaw ostrość. Znajdź pola widzenia, które zawierają izolowane, nie nakładające się na siebie komórki, a przynajmniej nie są przepełnione, aby ułatwić pomiary wzrostu podczas analizy obrazu. Wybierz technikę mikroskopii światła przechodzącego, która ma być zastosowana, i w razie potrzeby aktywuj detektor światła przechodzącego, a także detektory fluorescencji.Ustaw mikroskop tak, aby rejestrował obrazy w żądanych odstępach czasu i rozpoczynał akwizycję szeregów czasowych. Ładowanie, wizualizacja i przetwarzanie obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania imageJ Fiji o otwartym kodzie źródłowym. Zacznij od zaimportowania obrazów na Fidżi za pomocą wtyczek według formatu.Wybierz domyślny tryb kolorów i automatyczne skalowanie. Aby zobrazować znacznik czasu i pasek skali jako nakładkę, przejdź do analizy, narzędzi, paska skali. Ustaw żądane parametry dotyczące szerokości, wysokości, koloru i położenia podziałki liniowej.Przejdź do obrazu, właściwości, aby wyświetlić właściwości obrazu w oprogramowaniu imageJ Fiji. Obserwuj informacje o odstępach między klatkami. Tutaj używamy przedziału czasowego około 15 minut i wciskamy OK.Następnie przejdź do obrazu, stosów, etykiety i ustaw prawidłowe informacje na interwał. Ustaw położenie etykiety, modyfikując X i Y.Ustaw jednostkę miary w tekście pola i naciśnij przycisk podglądu. Użyj dopasowania histogramu do korekcji oświetlenia między różnymi klatkami, wybierając obraz, regulację, korekcję wybielania, dopasowanie histogramu.Pojawi się nowe okno z poprawionym podświetleniem. Użyj wtyczki MtrackJ we wtyczkach, MtrackJ, aby śledzić rosnącą końcówkę strzępka Aby dodać ścieżkę, wybierz przycisk dodawania na pasku narzędzi i umieść pierwszy punkt na końcówce łącznika za pomocą lewego przycisku myszy. Szereg czasowy zostanie automatycznie przeniesiony do następnej klatki.Aby zakończyć proces śledzenia, kliknij dwukrotnie myszą ostatni punkt lub naciśnij Escape. Przewijanie tabeli wyjściowej, najważniejszą kolumną do obliczania wzrostu końcówki strzępek, jest prędkość w dowolnej klatce. Bezpieczne śledzenie pomiarów, dodawanie pliku, zapisywanie jako, do wybranego formatu pliku, na przykład CSV, importowanie zapisanego pliku do programu arkusza kalkulacyjnego i obliczanie wizualizacji oraz dalszych testów.Naciśnij przycisk filmu, aby wygenerować film w kolorze RGB, zawierający klatki z narysowanymi w nich ścieżkami, które można zobrazować w dowolnym standardowym odtwarzaczu multimedialnym. Postępując zgodnie z tym protokołem, uchwyciliśmy i przeanalizowaliśmy różne obrazy odpowiadające różnym etapom wzrostu i rozwoju grzyba nitkowatego aspergillus nidulans. Rysunek przedstawia porównanie pomiarów szybkości wzrostu typu dzikiego i azhAD Delta ngnA Delta.Azhad Delta ngnA Delta jest podwójnie usuniętym szczepem w dwóch genach biorących udział w detoksykacji i asymilacji toksycznego produktu bojowego L, dodanego do dwóch kwasów karboksylowych. Wykazuje statystycznie istotnie niższe pomiary szybkości wzrostu w porównaniu ze szczepem typu dzikiego w zanurzonych kulturach płynnych. Ta różnica we wzroście nie jest wykrywalna poprzez pomiar powierzchni kolonii tych dwóch szczepów w stałym minimalnym podłożu.Jednokomórkowe, długoterminowe obrazowanie na żywo ma znaczącą wartość w wysiłkach zmierzających do uzyskania przestrzennych i czasowych informacji o dynamice białek komórkowych. Protokół ten nadaje się również do przeprowadzania długoterminowego obrazowania żywych komórek. Tutaj widzimy kiełkowanie konidiów koeksprymujących rdzeń eizosomalny PilA znakowany GFP i histonen H1 mRFP. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół analizy kinetyki wzrostu grzybów w powtarzalny i wiarygodny sposób bez konieczności wcześniejszego doświadczenia użytkownika w analizie obrazu.Protokół ten pozwala na obiektywną, dokładną ocenę ilościową wzrostu grzybów.

quantitative-analysis-aspergillus-nidulans-growth-rate-using-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Ilościowa Analiza Przystosowania (QFA) to komplementarna seria metod eksperymentalnych i obliczeniowych służąca do szacowania przystosowania kultur mikrobiologicznych. QFA pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych zastosowanych zabiegów na wzrost drobnoustrojów. Możliwe jest zaprojektowanie eksperymentów o skali od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur po tysiące kultur prowadzonych równolegle.

Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Opisano metodę precyzyjnego generowania i kompleksowej charakterystyki morfologicznej grzyba nitkowatego Aspergillus niger, która pozwala na matematyczną korelację wyglądu morfologicznego z produktywnością.

Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Tutaj opisujemy protokół do określania obciążenia grzybami płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą poprzez ilościowe zabarwienie srebrem zmodyfikowanej metanaminy Gomoriego w przekrojach histologicznych. Zastosowanie tej metody przyniosło porównywalne wyniki przy mniejszej liczbie zwierząt w porównaniu z oceną obciążenia grzybami za pomocą ilościowej reakcji PCR DNA grzyba płuc.

Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę ilościowej analizy tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii świetlnej przechodzącej i oprogramowania ImageJ Fiji. Ta technika umożliwia precyzyjne śledzenie dynamiki wzrostu grzybni w czasie rzeczywistym.

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

Przeglądaj więcej filmów