Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

W tym filmie opisujemy protokół obrazowania na żywo bez etykiet do przechwytywania obrazów modelowego grzyba aspergillus nidulans przy użyciu technik mikroskopii światła przechodzącego. Używamy tych obrazów do analizy i ilościowego określenia kinetyki wzrostu Aspergillus nidulans zarówno w pożywkach ciekłych, jak i stałych. Wizualna reprezentacja tego protokołu pozwala użytkownikom zapoznać się z istotnymi etapami przechwytywania obrazu i przetwarzania obrazu w mikroskopii.

Powszechną metodą stosowaną do pomiaru wzrostu grzybów nitkowatych jest zaszczepienie dwóch zarodników grzybów na szalce Petriego zawierającej agar odżywczy i zmierzenie średnicy rozwijającej się kolonii kilka dni później. Podejście to nie jest jednak wystarczająco czułe, aby określić ilościowo drobne różnice we wzroście. W związku z tym opracowano pomiary pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej.

Pomiary te są w stanie nie tylko dostarczyć dokładnych i ilościowych wyników, ale także odzwierciedlić dynamikę wzrostu różnych komórek w populacji. Co więcej, podejście to ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w reakcje wzrostu grzybów na sygnały endogenne i środowiskowe. Zacznij od wlania 15 mililitrów płynnego agaru odżywczego do szalek Petriego.

Umieść pokrywkę na wierzchu i pozwól jej ostygnąć. Użyj promieniowania UV do sterylizacji płytek. Przed usunięciem interesującego szczepu grzyba z bulionu, podgrzej pętlę guzkową w palniku Bunsena, aż będzie rozgrzana do czerwoności, ostudź pętlę, wbijając ją do agaru.

Zmieszać probówkę i rozprowadzić pętlę po powierzchni agaru minimalnym podłożem uzupełnionym odpowiednimi wymaganiami żywieniowymi. Inkubuj płytki przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej wykałaczki przenieś niewielką liczbę konidiów, delikatnie dotykając pojedynczej kolonii na płytki z kompletną pożywką.

Inkubuj płytki przez trzy do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Konidia z rodzaju aspergillus nidulans zbiera się w sterylnej 1,5-mililitrowej probówce wirowej, z 1,0 mililitrem wody destylowanej w autoklawie zawierającej 0,05% objętości na objętość, Tween 80, w celu zmniejszenia liczby grudek konidiów. Zmodyfikowana wersja metody odwróconego agaru służy do obrazowania grzybów strzępkowych na powierzchni podłoża agarowego.

Początkowo należy zauważyć 10 mikrolitrów energicznie wirowej zawiesiny konidialnej, około dwa razy 104 komórki na mililitr na szalkach Petriego o minimalnej pożywce 15 mililitrów z jedną wagą na objętość. Inkubować kulturę eksperymentalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Tutaj inkubujemy przez trzy dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie wytnij blok agaru zawierający kolonię za pomocą sterylnego skalpela. Tutaj wycinamy klin agaru na brzegu kolonii, odwracamy i umieszczamy plasterek agaru w ośmiodołkowym szkiełku. Przenieść 10 mikrolitrów energicznie wirowej zawiesiny konidialnej o sile około dwa razy 10 w sile czterech do studzienek szkiełka studziennego zawierającego 200 mikrolitrów minimalnej pożywki z odpowiednimi dodatkami.

Inkubować za każdym razem przez czas i temperaturę, które mają być badane. Wybór mikroskopu zależy od dostępnego sprzętu. W każdym przypadku zestaw mikroskopowy powinien zawierać odwrócony stolik, komorę środowiskową lub przynajmniej pomieszczenie z precyzyjną kontrolą temperatury powietrza.

Wstępnie podgrzej termostat i komorę mikroskopu, aby ustabilizować żądaną temperaturę. Tutaj ustawiamy temperaturę na 30 stopni Celsjusza. Włącz mikroskop, zasilanie skanera, zasilanie lasera i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania.

Umieść wcześniej przygotowany szkiełko w stoliku mikroskopowym i ustaw ostrość. Znajdź pola widzenia, które zawierają izolowane, nie nakładające się na siebie komórki, a przynajmniej nie są przepełnione, aby ułatwić pomiary wzrostu podczas analizy obrazu. Wybierz technikę mikroskopii światła przechodzącego, która ma być zastosowana, i w razie potrzeby aktywuj detektor światła przechodzącego, a także detektory fluorescencji.

Ustaw mikroskop tak, aby rejestrował obrazy w żądanych odstępach czasu i rozpoczynał akwizycję szeregów czasowych. Ładowanie, wizualizacja i przetwarzanie obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania imageJ Fiji o otwartym kodzie źródłowym. Zacznij od zaimportowania obrazów na Fidżi za pomocą wtyczek według formatu.

Wybierz domyślny tryb kolorów i automatyczne skalowanie. Aby zobrazować znacznik czasu i pasek skali jako nakładkę, przejdź do analizy, narzędzi, paska skali. Ustaw żądane parametry dotyczące szerokości, wysokości, koloru i położenia podziałki liniowej.

Przejdź do obrazu, właściwości, aby wyświetlić właściwości obrazu w oprogramowaniu imageJ Fiji. Obserwuj informacje o odstępach między klatkami. Tutaj używamy przedziału czasowego około 15 minut i wciskamy OK.

Następnie przejdź do obrazu, stosów, etykiety i ustaw prawidłowe informacje na interwał. Ustaw położenie etykiety, modyfikując X i Y.Ustaw jednostkę miary w tekście pola i naciśnij przycisk podglądu. Użyj dopasowania histogramu do korekcji oświetlenia między różnymi klatkami, wybierając obraz, regulację, korekcję wybielania, dopasowanie histogramu.

Pojawi się nowe okno z poprawionym podświetleniem. Użyj wtyczki MtrackJ we wtyczkach, MtrackJ, aby śledzić rosnącą końcówkę strzępka Aby dodać ścieżkę, wybierz przycisk dodawania na pasku narzędzi i umieść pierwszy punkt na końcówce łącznika za pomocą lewego przycisku myszy. Szereg czasowy zostanie automatycznie przeniesiony do następnej klatki.

Aby zakończyć proces śledzenia, kliknij dwukrotnie myszą ostatni punkt lub naciśnij Escape. Przewijanie tabeli wyjściowej, najważniejszą kolumną do obliczania wzrostu końcówki strzępek, jest prędkość w dowolnej klatce. Bezpieczne śledzenie pomiarów, dodawanie pliku, zapisywanie jako, do wybranego formatu pliku, na przykład CSV, importowanie zapisanego pliku do programu arkusza kalkulacyjnego i obliczanie wizualizacji oraz dalszych testów.

Naciśnij przycisk filmu, aby wygenerować film w kolorze RGB, zawierający klatki z narysowanymi w nich ścieżkami, które można zobrazować w dowolnym standardowym odtwarzaczu multimedialnym. Postępując zgodnie z tym protokołem, uchwyciliśmy i przeanalizowaliśmy różne obrazy odpowiadające różnym etapom wzrostu i rozwoju grzyba nitkowatego aspergillus nidulans. Rysunek przedstawia porównanie pomiarów szybkości wzrostu typu dzikiego i azhAD Delta ngnA Delta.

Azhad Delta ngnA Delta jest podwójnie usuniętym szczepem w dwóch genach biorących udział w detoksykacji i asymilacji toksycznego produktu bojowego L, dodanego do dwóch kwasów karboksylowych. Wykazuje statystycznie istotnie niższe pomiary szybkości wzrostu w porównaniu ze szczepem typu dzikiego w zanurzonych kulturach płynnych. Ta różnica we wzroście nie jest wykrywalna poprzez pomiar powierzchni kolonii tych dwóch szczepów w stałym minimalnym podłożu.

Jednokomórkowe, długoterminowe obrazowanie na żywo ma znaczącą wartość w wysiłkach zmierzających do uzyskania przestrzennych i czasowych informacji o dynamice białek komórkowych. Protokół ten nadaje się również do przeprowadzania długoterminowego obrazowania żywych komórek. Tutaj widzimy kiełkowanie konidiów koeksprymujących rdzeń eizosomalny PilA znakowany GFP i histonen H1 mRFP. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół analizy kinetyki wzrostu grzybów w powtarzalny i wiarygodny sposób bez konieczności wcześniejszego doświadczenia użytkownika w analizie obrazu.

Protokół ten pozwala na obiektywną, dokładną ocenę ilościową wzrostu grzybów.