System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

System hodowli narządów jelitowych łączy w sobie zalety testów in vitro i in vivo, a tym samym służy jako pośredni etap doświadczalny między prostymi testami in vitro a złożonymi doświadczeniami in vivo. Główną zaletą tej techniki jest połączenie ścisłej kontroli eksperymentalnej z zachowaniem fizjologii jelit. Metoda ta zapewnia wgląd w analizę reakcji jelit na określony bodziec z wysokim poziomem kontroli nad gospodarzem, drobnoustrojami i składnikami środowiska.

Procedurę zademonstrują Alon Shemesh, student studiów magisterskich z mojego laboratorium, oraz dr Sivan Amidror, kierownik naszego laboratorium. Aby rozpocząć, włóż igły w odpowiednie miejsce w formie urządzenia i odlej około 20 gramów mieszanki polidimetylosiloksanu lub PDMS na jeden zestaw urządzenia i pokrywkę. Umieść formy w komorze próżniowej na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszanki PDMS, a następnie inkubuj formy w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez noc, aby zakończyć polimeryzację PDMS.

Po ustawieniu PDMS wyciągnij igły z formy i ostrożnie zwolnij urządzenie do hodowli i pokrywkę z plastikowych foremek. Usuń pozostałości PDMS z obrysu studni za pomocą ostrza chirurgicznego. Przymocuj urządzenie PDMS i pokrywę urządzenia do szkła nakrywkowego z mikroszkiełek o wymiarach 75 na 50 milimetrów za pomocą nietoksycznego kleju silikonowego i pozostaw części do zastygnięcia na noc.

Nałóż przyklejony do gładkiej strony urządzenia. Włóż igły o rozmiarze 12, 22 do światła i igły o rozmiarze 12, 18 do studzienki. Zamocuj wszystkie igły na miejscu za pomocą silikonu i pozostaw na noc.

Oczyść strzykawki wejściowe i upewnij się, że medium studzienkowe wypływa ze wszystkich probówek do szklanki na odpady, a następnie wyczyść strzykawki wejściowe i upewnij się, że stymulacje wypływają ze wszystkich probówek do szklanki na odpady, uważając, aby nie zanieczyścić różnych stymulacji. Po poświęceniu myszy użyj ostrych nożyczek i kleszczy, aby ją wypreparować i usunąć przewód pokarmowy od żołądka do odbytu, przecinając cały tłuszcz i tkankę łączną. Wytnij dwukropek i umieść go na nowym talerzu.

Zminimalizuj kontakt, trzymając tkankę delikatnie i tylko na krawędziach. Wykonaj płukanie jelita grubego pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie przepłukać zawartość jelita grubego sterylnym IMDM za pomocą przygotowanej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, jak opisano w tekście.

Po usunięciu kału z tkanki jelitowej umieść okrężnicę w nowej sześciodołkowej płytce wypełnionej 0,5 mililitra sterylnego IMDM. Następnie weź tkankę okrężnicy i ostrożnie połącz ją z igłą o rozmiarze 22, tworząc ciasne wiązanie z dwiema nitkami. Utrzymuj prawidłową orientację okrężnicy do przepływu światła, tak aby proksymalna i dystalna była równa odpowiednio wejściu i wyjściu.

Powtórz płukanie jelita grubego i zawiązanie igłą dla wszystkich tkanek. Podłącz rurki wejściowe i wyjściowe do urządzenia, a następnie rozpocznij eksperyment od uruchomienia pomp z żądaną szybkością. Wykryto wypełnione śluzem komórki kubkowe w nabłonku okrężnicy i wydzielanie śluzu w świetle, a także proliferację IEC w kryptach okrężnicy, na co wskazuje barwienie KI67.

Wyniki te wykazały, że system hodowli jelit utrzymuje funkcję i strukturę jelit ex vivo. Po dwóch godzinach wprowadzania segmentowanych bakterii nitkowatych lub SFB, typowe włókna SFB wykryto w ścisłym związku z kosmkami jelita cienkiego za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Dodatkowo transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała SFB w odległości kilku mikronów od granicy szczoteczki nabłonka jelita cienkiego.

Profile ekspresji genów w próbkach całych tkanek uzyskano w trzech egzemplarzach dwie godziny po infuzji z SFB. Kultury kontrolne podawano zawiesinami kałowymi myszy wolnych od zarazków lub monokolonizowanych przez Bacteroides fragilis. Zmiany te, do których przekonał się SFB, miały głównie małą amplitudę w porównaniu z kontrolą wolną od zarazków.

Orientacja jelita grubego jest bardzo ważna. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wiązania jelita grubego na igle. Prawidłowe wiązanie zapobiegnie zanieczyszczeniu studni zawartością światła.

Za tym protokołem może być stosowany szeroki zakres technik odczytu, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji, obrazowanie, sortowanie komórek i wiele innych. Odczyty te dostarczają nowych informacji na temat interakcji mikrobiomu gospodarza w zdrowiu i chorobie.