Name: Funkcjonalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego implantów Ti (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: Poznaj metodę funkcjonalizacji powierzchni implantów tytanowych za pomocą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego. Technika drop casting oferuje proste i niskokosztowe rozwiązanie w medycynie regeneracyjnej oraz ortopedii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, współfinansowane przez EFS Europejski Fundusz Społeczny i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego EFRR (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) oraz PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansowane z podatku od zrównoważonej turystyki na Balearach.

Lizat płytek krwi (PL) otrzymuje się zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi3, wykorzystując świeże warstwy leukocyto-trombocytarne dostarczone przez Biobank IdISBa jako materiał wyjściowy. Ich wykorzystanie w obecnym projekcie zostało zatwierdzone przez odpowiednią Komisję Etyczną (IB 1995/12 BIO).
1. Izolacja EV z PL
<ol>
	<li>Usuwanie większych ciałek
	<ol>
		<li>Rozmrozić PL w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować PL przy 1,500 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić osad, ponieważ zawiera on szczątki komórkowe.</li>
		<li>Zebrać supernatant i przeprowadzić dwa kolejne wirowania przy 10,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Osad odpowiada większym EV, takim jak mikropęcherzyki; w tym przypadku zostaje on odrzucony.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant najpierw przez membranę porowatą 0,8 µm, a następnie przez membranę porowatą 0,2 µm. 
		UWAGA: Kroki te usuwają wszystkie niepożądane EV.</li>
		<li>Połączyć przefiltrowane PL i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia do wykluczania cząsteczek
	<ol>
		<li>Równoważyć kolumnę podłączoną do urządzenia chromatograficznego za pomocą przefiltrowanego PBS przy żądanej szybkości przepływu. 
		UWAGA: Stosowana szybkość przepływu zależy od charakterystyki kolumny; w tym przypadku ustawiono ją na 0,5 mL/min.</li>
		<li>Napić przetworzone PL (5 mL) do urządzenia za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Wstrzyknąć PL do kolumny i rozpocząć zbieranie frakcji 5 mL do probówek 15 mL.</li>
		<li>Zebrać frakcje wzbogacone w EV i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Przy pierwszym przeprowadzeniu eksperymentu należy scharakteryzować wszystkie frakcje poprzez ilościowe oznaczenie białek i immunodetekcję, aby wyznaczyć frakcję wzbogaconą w EV3,11. W tym eksperymencie zbiera się 9tą frakcję.</li>
		<li>Przemyć kolumnę chromatograficzną 30 mL 0,2% roztworu NaOH i przechowywać ją w 20% roztworze etanolu po osiągnięciu stanu równowagi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych; filtracja, wirowanie, kolumna Sepharose, zbieranie EV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62781/62781fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) z lizatu płytek krwi (PL). PL jest najpierw wirowany przy 1,500 x g, a następnie przy 10,000 x g w celu usunięcia większych ciałek. Nadfiltr jest filtrowany przez filtry 0,8 i 0,2 µm. Przetworzony PL jest nanoszony na kolumnę, a EV są rozdzielane za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62781/62781fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Charakterystyka EV
UWAGA: Charakterystyka EV jest niezbędna do przeprowadzenia badań funkcjonalnych12. Wcześniej opisano charakterystykę z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej lub western blot13. Niniejszy raport skupi się na podstawowych technikach charakterystyki w kontekście funkcjonalizacji powierzchni Ti.
<ol>
	<li>Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć EV (1:1000) w PBS filtrowanym przez filtr 0,2 µm. 
		UWAGA: Próbki zbyt skoncentrowane lub zbyt rozcieńczone będą poza zakresem pomiaru NTA, co będzie wymagało ich dostosowania.</li>
		<li>Pobrać 1 mL rozcieńczonych EV za pomocą strzykawki i wprowadzić je do urządzenia NTA.</li>
		<li>Postępować zgodnie z protokołem producenta w celu wyznaczenia stężenia i rozkładu wielkości cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stężenie białka
	<ol>
		<li>Wyznaczyć stężenie, wykorzystując 1 µL roztworu EV. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długości fali 280 nm. 
		UWAGA: EV powinny wykazywać niski poziom białek w stosunku do liczby cząstek.</li>
		<li>Postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać odczyt absorbancji za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Funkcjonalizacja powierzchni tytanu
UWAGA: W tej metodzie zastosowano obrobione mechanicznie dyski tytanowe, stop c.p. stopnia IV, o średnicy 6,2 mm i wysokości 2 mm. Dyski można przenosić za pomocą pęsety tytanowej, jednak należy zadbać o to, aby nie porysować ich powierzchni. Ponadto przez cały czas trwania procesu strona obrobiona mechanicznie musi być skierowana do góry.
<ol>
	<li>Mycie dysków Ti 
	UWAGA: Objętość roztworów użytych do mycia Ti powinna być wystarczająca, aby całkowicie pokryć dyski Ti. Umieść dyski Ti w zlewce szklanej i wlej na nie roztwory. Następnie usuń roztwór poprzez odlanie.
	<ol>
		<li>Umyj implanty Ti wodą dejonizowaną (DI), a następnie wylej wodę.</li>
		<li>Umyj implanty Ti 70% etanolem, a następnie odlej roztwór.</li>
		<li>Umieść implanty w wodzie DI i poddaj sonikacji w temperaturze 50 °C przez 5 min. Wylej wodę.</li>
		<li>Inkubuj implanty Ti w 40% roztworze NaOH w temperaturze 50 °C przez 10 min przy mieszaniu. Odlej roztwór. 
		OSTROŻNIE: Roztwór NaOH nagrzewa się podczas przygotowywania. Roztwór jest żrący i należy go używać w dygestorium.</li>
		<li>Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min, a następnie usuń wodę.</li>
		<li>Przeprowadź kilka płukań wodą DI (co najmniej 5), aż do osiągnięcia obojętnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.</li>
		<li>Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min i usuń wodę.</li>
		<li>Inkubuj implanty Ti w 50% roztworze HNO3 w temperaturze 50 °C przez 10 min przy mieszaniu. Usuń roztwór. 
		OSTROŻNIE: HNO3 jest substancją żrącą i utleniającą i należy go używać w dygestorium.</li>
		<li>Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min. Usuń wodę.</li>
		<li>Przeprowadź kilka płukań wodą DI (co najmniej 5), aż do uzyskania obojętnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.</li>
		<li>Soniakuj implanty w wodzie DI w temperaturze 50 °C przez 5 min. Usuń wodę. 
		UWAGA: Na tym etapie eksperyment można przerwać, przechowując implanty Ti w 70% roztworze etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasywacja Ti 
	UWAGA: Kroki pasywacji Ti są wykonywane poprzez całkowite pokrycie dysków Ti różnymi roztworami w kolejności wymienionej poniżej. Dyski Ti umieszcza się w zlewce szklanej, a roztwory delikatnie wlewa na nie. Objętości używane we wszystkich etapach płukania muszą całkowicie pokrywać implanty i są usuwane poprzez odlanie.
	<ol>
		<li>Inkubuj implanty Ti w 30% roztworze HNO3 przez 30 min w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Usuń roztwór.</li>
		<li>Przeprowadź kilka płukań wodą DI (co najmniej 5), aż do osiągnięcia obojętnego pH. Sprawdź pH za pomocą wskaźników pH.</li>
		<li>Inkubuj implanty Ti przez noc w temperaturze pokojowej w wodzie DI.</li>
		<li>Wysusz implanty w warunkach próżni w temperaturze 40 °C przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naniesienie kropelkowe EVs 
	UWAGA: W przypadku funkcjonalnych badań komórkowych ważne jest prowadzenie prac w komorze do hodowli komórek.
	<ol>
		<li>Umieść implanty Ti w płytce 96-dołkowej stroną obrobioną do góry. 
		UWAGA: Jeśli implanty zostaną odwrócone do góry nogami, można użyć igły, aby je poprawić.</li>
		<li>Rozmroź roztwór EVs i wymieszaj go przy mieszaniu. Użyj vortexa, aby wymieszać przez 3 s.</li>
		<li>Naniesiesz EVs na powierzchnię Ti. W niniejszym badaniu na Ti naniesiono krople 40 µL roztworu EVs, aby unieruchomić maksymalnie 4 x 1011 EVs na implant, zgodnie z stężeniem określonym przez NTA.</li>
		<li>Umieść płytki zawierające Ti w warunkach próżni w temperaturze 37 °C, aż krople całkowicie wyschną (~2 h). 
		​UWAGA: Dostosuj czas w zależności od liczby implantów i ilości wody obecnej w komorze próżniowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat pasywacji Ti i odlewania kropelkowego; proces przygotowania Ti-EV i ich osadzania na tytanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62781/62781fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat pasywacji Ti i funkcjonalizacji EV metodą odlewania kropelkowego. Implanty Ti są najpierw pasywowane poprzez inkubację przez 30 min w 30% roztworze HNO3 w temperaturze pokojowej. Po kilku przemyciach wodą DI pH osiąga wartość neutralną. Następnie implanty Ti są inkubowane przez noc w temperaturze pokojowej w wodzie DI. Po tym czasie implanty są suszone w warunkach próżni w 40 °C. W celu immobilizacji EV, 40 µL roztworu EV jest nanoszonych na implanty Ti. Następnie implanty są inkubowane w próżni przez 2 h, aż do fizycznego związania EV z powierzchnią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62781/62781fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
4. Charakterystyka powierzchni Ti
<ol>
	<li>Badanie uwalniania
	<ol>
		<li>Inkubować powierzchnię Ti w 200 µL przefiltrowanego PBS w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: PBS jest filtrowany, aby uniknąć zakłóceń w pomiarze NTA.</li>
		<li>Wymieniać PBS w różnych punktach czasowych i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu analizowano punkty czasowe: 2, 6, 10 i 14 dni.</li>
		<li>Analizować przechowywany PBS pod kątem obecności cząstek metodą NTA zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Stężenie cząstek w PBS w różnych odstępach czasu reprezentuje profil uwalniania EVs w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania biokompatybilności 
	UWAGA: Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej pępowiny (hUC-MSC) są pozyskiwane z Biobanku IdISBa zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
	<ol>
		<li>Utrzymywać hUC-MSC w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy z dodatkiem 20% FBS do momentu użycia. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Przed wysianiem komórek, przemyć komórki w kolbach 5 mL PBS dwa razy.</li>
		<li>Trypsynizować hUC-MSC, dodając 1 mL roztworu trypsyny. Upewnić się, że całkowicie pokrywa on monowarstwę komórek. Usunąć roztwór trypsyny i pozostawić kolbę z hodowlą komórkową w temperaturze 37 °C przez około 2 min. Sprawdzić odklejenie komórek pod mikroskopem. Odklejone komórki będą miały okrągły kształt i będą znajdować się w zawiesinie.</li>
		<li>Resuspendować komórki w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy z 1% FBS pozbawionego EVs. 
		UWAGA: Przygotować pożywkę z dodatkiem 1% FBS, a następnie poddać ją ultrawirowaniu przy 120,000 x g przez 18 h w celu usunięcia FBS-EVs. Usunięcie EVs jest istotne, aby uniknąć zakłóceń w analizie EVs pochodzących z płytek krwi.</li>
		<li>Określić stężenie komórek, licząc ich liczbę za pomocą komory Neubauera14.</li>
		<li>Dostosować stężenie hUC-MSC do poziomu 50,000 komórek/mL.</li>
		<li>Nasiać 200 µL zawiesiny komórkowej na implanty Ti.</li>
		<li>Po 48 h zebrać 50 µL pożywki i przeprowadzić oznaczenie cytotoksyczności przy użyciu zestawu do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Torreggiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+novel+effectors+of+human+platelet+lysate+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity.</a> European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).</li>
<li>Antich-Rosselló, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+extracellular+vesicles+promote+osteoinduction+of+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells.</a> Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+of+Ti-based+alloys+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">New developments of Ti-based alloys for biomedical applications.</a> Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).</li>
<li>Lan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+a+nanostructured+titanium+oxide+layer+with+self-assembled+monolayers+for+biomedical+applications%3A+Surface+properties+and+biomechanical+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors.</a> Applied Sciences. 10 (2), 590(2020).</li>
<li>Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+and+their+effects+on+titanium+dental+implants%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Surface modifications and their effects on titanium dental implants.</a> BioMed Research International. 2015, 791725(2015).</li>
<li>Damiati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+surface+topography+and+coating+on+osteogenesis+and+bacterial+attachment+on+titanium+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants.</a> Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694(2017).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+human+adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicle-functionalized+biotin-doped+polypyrrole+titanium+with+long-term+stability+and+potential+osteoinductive+ability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).</li>
<li>Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-integrated+titanium+oxide+nanotubes+for+targeted+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+influence+the+behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+titanium+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces.</a> Biomaterials. 230, 119571(2020).</li>
<li>Lozano-Ramos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+enrichment+of+extracellular+vesicles+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369(2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+adult+schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541(2018).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+titanium+surface+modification+techniques+and+coatings+for+antibacterial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications.</a> Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).</li>
<li>Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+quercitrin+nanocoatings%3A+A+fluorescence-based+method+for+their+surface+quantification%2C+and+their+effect+on+stem+cell+adhesion+and+differentiation+to+the+osteoblastic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten ma na celu dostarczenie jasnych instrukcji dotyczących funkcjonalności pojazdów elektrycznych na powierzchniach Ti. Przedstawiona metoda opiera się na strategii odlewania kroplowego, która jest funkcjonalizacją typu fizysorpcji. Istnieje uboga bibliografia dotycząca funkcjonalizacji pojazdów elektrycznych na nawierzchniach Ti, chociaż istnieje niewiele badań wykazujących różne korzyści płynące z unieruchomienia pojazdów elektrycznych na Ti10. W każdym razie, niektóre z badanych strate...

EV to pęcherzyki błonowe (30-200 nm) wydzielane przez dowolną komórkę i odgrywają kluczową rolę w komunikacji między komórkami, dostarczając swój ładunek. Zawierają różne aktywne biomolekuły, które mogą obejmować kwasy nukleinowe, czynniki wzrostu lub bioaktywne lipidy1. Z tych powodów pojazdy elektryczne zostały ocenione pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii. Pod kątem ortopedii i regeneracji kości przetestowano pojazdy elektryczne z różnych źródeł. Wśród nich wykazano, że EV pochodzące z płytek krwi wywołują efekt różnicowania komórek macierzystych przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego profilu cytotoksycznego2,3. W związku z tym konieczne są dalsze badania w celu zbadania możliwości łączenia pojazdów elektrycznych z biomateriałami w celu wykorzystania ich w codziennej praktyce klinicznej.
Biomateriały na bazie tytanu są powszechnie stosowane jako rusztowania do klinicznych interwencji leczniczych kości ze względu na ich właściwości mechaniczne, wysoką biokompatybilność i długoterminową trwałość4. Niemniej jednak implanty Ti są materiałem biologicznym i dlatego wykazują słabą zdolność do łączenia się z otaczającą tkanką kostną5. Z tego powodu modyfikacje tytanu są badane w celu poprawy ich wydajności poprzez osiągnięcie bardziej funkcjonalnego mikrośrodowiska na jego powierzchni4,6,7. W tym sensie EV mogą być zakotwiczone w tytanie przez chemical8 lub physical interactions9,10. Unieruchomione EV pochodzące z komórek macierzystych lub makrofagów zwiększają bioaktywność Ti, promując adhezję i proliferację komórek, wywołując w ten sposób efekt osteogenny8,9,10.
Ten artykuł skupi się szczegółowo na strategii odlewania matrycowego do powlekania powierzchni Ti za pomocą EV pochodzących z PL. Ponadto ocenimy profil uwalniania EV z powlekanej powierzchni w czasie i potwierdzimy jego biokompatybilność komórkową in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,8 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius</td><td>16592K</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka wirówkowa</td><td>SPL nauki przyrodnicze</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>hodowlana SPL nauki przyrodnicze</td><td>PLC30096</td><td></td></tr><tr><td>Absolut</td> etanol <td>Scharlau</td><td>ET0006005P</td><td>Służy do przygotowania 20 %&nbsp; etanolu z wodą Milli-Q&reg;</td></tr><tr><td>AKTA System oczyszczania</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-0014</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-15R</td><td>Wirówka Beckman Coutler</td><td>392934</td><td>SX4750A wirnik wahadłowy</td></tr><tr><td>Wirówka 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa, stożkowe dno, 50ml</td><td></td> SPL Zestaw do wykrywania cytotoksyczności PLC50050 <td></td><td>nauk przyrodniczych</td></tr><tr><td>(LDH)</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>BDH307736</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low Glucose Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>21885025</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS) Embrionic Certyfikowana</td><td>GIBCO</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0,2 &micro; m filtr strzykawkowy</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep&nbsp; 16/60 Sefakryl&nbsp; S-400 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9356-04</td><td>Prefabrykowane kolumny</td></tr><tr><td>ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny (hUC-MSC)</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 analiza śledzenia nanocząstek</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td>Urządzenie z wbudowanym laserem przy &lambda;= 532 nm i kamerą sCMOS</td></tr><tr><td>Igła</td><td>Terumo</td><td>946077135</td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy 69,5%</td><td>Scharlau</td><td>AC16071000</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1124</td><td>SW-32Ti Rotor</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>Paski testowe pH 4,5-10,0</td><td>Sigma</td><td>P-4536</td><td></td></tr><tr><td>Lizat płytek krwi (PL)</td><td>Biobank IdISBa</td><td>Uzyskane z&nbsp; kożuchów wyrzucanych po oddaniu krwi</td>Polipropylenowe wanny wirówkowe Beckman Coutler 326823 Power wave HT BioTek 10340763 Probówka z nakrętką, 15 ml, (Lx&Oslash;): 120 x 17 mm, PP, z nadrukiem Sarstedt 62554502 Hirtlenek sodu Sharlau SO04251000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repliki implantów tytanowych</td><td>Implantmedia, SA</td><td>NA</td><td>Tytan klasy IV. Średnica: 6,2 mm. Wysokość: 1,95 mm</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 1 X</td><td>Biowest</td><td>L0930</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego implantów ti

Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to biologiczne nanopęcherzyki, które odgrywają kluczową rolę w komunikacji komórkowej. Ich zawartość obejmuje aktywne biomolekuły, takie jak białka i kwasy nukleinowe, które mają ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej. Ostatnio EV pochodzące z lizatu płytek krwi (PL) wykazały zdolność osteogenną porównywalną z PL. Poza tym biomateriały są często stosowane w ortopedii lub odbudowie zębów. W tym miejscu przedstawiamy metodę funkcjonalizacji powierzchni Ti za pomocą EV pochodzących z PL w celu poprawy ich właściwości osteogennych.
EVs są izolowane z PL za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, a następnie powierzchnie Ti są funkcjonalizowane za pomocą PL-EVs przez odlewanie kroplowe. Funkcjonalizacja jest udowodniona przez uwalnianie EV i jego biokompatybilność w teście uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH).

Metoda przedstawiona w tym artykule pozwala na otrzymanie dysków tytanowych funkcjonalizowanych przez EV. EV są fizycznie związane z powierzchnią, co umożliwia ich przedłużone uwalnianie w czasie. Ilość uwalnianych EV można zmierzyć za pomocą NTA w 2., 6., 10. i 14. dniu. Pierwsze pomiary, wykonane w 2. dniu, wykazują uwolnienie około 109 EV, po czym następuje przedłużone uwalnianie w 6. dniu (~108 EV), 10. dniu (~107 EV) i 14. dniu (~107 EV). Potwierdza to proces przedłużonego...

Tutaj prezentujemy metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z lizatów płytek krwi (PL) i ich zastosowanie do powlekania powierzchni implantów tytanowych (Ti). Opisujemy metodę powlekania metodą odlewania matrycowego, profil uwalniania EV z powierzchni oraz biokompatybilność in vitro powierzchni Ti pokrytych EV.

Funkcjonalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego implantów Ti

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...

Połączenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biomateriałami jest pożądanym podejściem do badań medycyny regeneracyjnej. W związku z tym badanie to donosi o funkcjonalizacji tytanu za pomocą EV jako praktycznego narzędzia w ortopedii i regeneracji kości. Funkcjonalizacja odlewania matrycowego jest łatwą i tanią metodą w porównaniu z innymi strategiami, takimi jak uwięzienie polimerowe lub wiązanie biochemiczne.Rozpocznij funkcjonalizację powierzchni tytanu od umycia dysków tytanowych wodą dejonizowaną w szklanej zlewce. Następnie wylej wodę przed umyciem dysków 70% etanolem. Zdekantować roztwór do sonikacji umytych implantów w temperaturze 50 C przez pięć minut w wodzie dejonizowanej.Po wyrzuceniu wody inkubuj implanty tytanowe w 40% roztworze wodorotlenku sodu w temperaturze 50 C przez 10 minut z mieszaniem, a następnie poddaj je sonikacji w wodzie dejonizowanej, jak pokazano. Następnie należy wykonać co najmniej pięć przemyć implanty wodą dejonizowaną. Dopóki pH nie będzie neutralne na wskaźniku pH.Powtórz proces sonikacji i inkubacji, jak wyjaśniono wcześniej, zastępując wodorotlenek sodu 50% kwasem azotowym. Wykonaj płukanie i sonikację wodą dejonizowaną przed przechowywaniem im

platelet-derived-extracellular-vesicle-functionalization-ti

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Bioaktywne i mechanicznie niezawodne rusztowania metalowe zostały wyprodukowane metodą składającą się z dwóch procesów, dynamicznego odlewania zamrażalnego w celu wytworzenia porowatego Ti oraz powlekania i zagęszczenia rusztowań Ti. Proces zagęszczania jest prosty, skuteczny i ma zastosowanie do wytwarzania rusztowań o stopniu funkcjonalnym.

Produkcja mechanicznie przestrajalnych i bioaktywnych rusztowań metalowych do zastosowań biomedycznych

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Tutaj prezentujemy technikę obrazowania opartą na fluoroforach, która pozwala na wykrywanie żywotności komórek na nieprzezroczystym tytanowym rusztowaniu, jak również wykrywanie przebłysków zanieczyszczeń rusztowania. Ten protokół rozwiązuje problem z obrazowaniem interakcji komórka-komórka lub komórka-metal na nieprzezroczystych rusztowaniach.

Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Prezentowany tutaj jest protokół dołączania peptydu CD47 (pepCD47) do metalowych stentów za pomocą chemii polibisfosfonianów. Funkcjonalizacja stentów metalowych za pomocą pepCD47 zapobiega przyłączaniu się i aktywacji komórek zapalnych, poprawiając w ten sposób ich biokompatybilność.

Łagodzenie przyczepiania się komórek krwiopochodnych do metalowych implantów poprzez immobilizację peptydów pochodzących z CD47

Obecny protokół opisuje narzędzia do obsługi mikroelektrod wewnętrznych z krzemu podczas zabiegów modyfikacji powierzchni poprzez osadzanie gazu i reakcje roztworu wodnego. Szczegółowo wyjaśniono montaż komponentów używanych do obsługi urządzeń podczas całej procedury.

Narzędzia do obróbki powierzchniowej krzemowych płaskich mikroelektrod wewnątrzkorowych

W niniejszej pracy opisujemy prostą metodę wzorowania wolnego od tlenków krzemu i germanu za pomocą reaktywnych monowarstw organicznych oraz demonstrujemy funkcjonalizację wzorowanych podłoży małymi cząsteczkami i białkami. Podejście to zapewnia całkowitą ochronę powierzchni przed utlenianiem chemicznym, umożliwia precyzyjną kontrolę nad morfologią struktur oraz zapewnia łatwy dostęp do wzorów rozróżnialnych chemicznie.

Funkcjonalizacja i wzorowanie krzemu oraz germanu beztlenkowego metodą miękkiej litografii

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Grafen oferuje potencjał jako materiał powłokowy dla implantów biomedycznych.  W niniejszej pracy przedstawiono metodę powlekania stopów nitinolu warstwami grafenu o grubości nanometrów i określono, w jaki sposób grafen może wpływać na odpowiedź implantu.

Powłoki grafenowe do implantów biomedycznych

Poznaj metodę funkcjonalizacji powierzchni implantów tytanowych za pomocą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego. Technika drop casting oferuje proste i niskokosztowe rozwiązanie w medycynie regeneracyjnej oraz ortopedii.

Funkcjonalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia płytkowego implantów Ti

Przeglądaj więcej filmów