Name: Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę analizy produktów rozpadu białek TGF-beta w blastocoele zarodków Xenopus laevis. Protokół umożliwia szybkie izolowanie i wykrywanie heterodimerów Bmp4 i Bmp7 metodą immunoblottingu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mary Sanchez za doskonałą opiekę nad zwierzętami. Badania autorów są wspierane przez National Institute of Child Health and Human Development of the National Institutes of Health (NIH/NICHD) granty R01HD067473-08 i R21 HD102668-01 oraz przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK/NIH) grant R01DK128068-01.

<ol><li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodomains+regulate+the+synthesis%2C+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li>
<li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li>
<li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li>
<li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+activation+of+pro-activin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052(2016).</li>
<li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li>
<li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li>
<li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+stability+determines+signaling+range%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li>
<li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li>
<li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4%2F7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li>
<li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332(2020).</li>
<li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin%2C+PC6%2C+and+PC7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li>
<li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li>
<li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li>
<li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li>
<li>Sopory, S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSopory%2C+S+%22Analysis+of+Growth+Factor+Signaling+in+Embryos%22">Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos</a>. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).</li>
<li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Activation+of+Bmps%3A+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li>
<li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównymi zaletami opisanego tutaj protokołu jest to, że można go ukończyć stosunkowo szybko, nie wymaga drogich odczynników i stanowi źródło skoncentrowanych produktów rozszczepienia Tgfß w warunkach fizjologicznych. Kolejną zaletą jest to, że pozwala analizować białka znakowane epitopami, a tym samym obejść niedobór komercyjnie dostępnych przeciwciał, które rozpoznają większość prodomen rodziny Tgfß. Chociaż możliwe jest również przeanalizowanie rozszczepienia znakowanych epitopami białek prekursorowych Tgfß w transfeko...

Członkowie nadrodziny Transformującego Czynnika Wzrostu ß (Tgfß) są syntetyzowani jako nieaktywne, dimeryzowane białka prekursorowe. Prekursory są następnie rozszczepiane przez członków rodziny konwertazy proproteinowej (PC), albo w szlaku wydzielniczym, albo na zewnątrz komórek. W ten sposób powstaje aktywny, wiązany dwusiarczkiem dimer ligandu i dwa fragmenty prodomeny1. Chociaż od ponad 30 lat wiadomo, że prodomena prekursorów rodziny Tgfß jest wymagana do wygenerowania aktywnego liganda2, zrozumienie, w jaki sposób prodomeny przyczyniają się do funkcji liganda, jest niepełne.
Chociaż zrozumienie procesu aktywacji proteolitycznej członków rodziny Tgfß pozostaje niekompletne, rośnie zainteresowanie zrozumieniem, które motywy konsensusu PC są rozszczepiane in vivo, czy rozszczepienie występuje w określonym przedziale subkomórkowym czy zewnątrzkomórkowym, i czy prodomena pozostaje kowalencyjnie czy niekowalencyjnie związana z rozszczepionym ligandem3. Kilka badań wykazało, że prodomena nie tylko kieruje fałdowaniem ligandów przed rozszczepieniem4,5, ale może również wpływać na stabilność czynnika wzrostu i zakres działania6,7,8,9, napędzaj powstawanie homodimerów lub heterodimerów10, zakotwicz ligand w macierzy zewnątrzkomórkowej, aby utrzymać opóźnienie liganda11, a w niektórych przypadkach funkcjonuje jako ligand na własnych prawach, aktywując sygnalizację heterologiczną12. Heterozygotyczne mutacje punktowe w obrębie prodomeny wielu członków rodziny Tgfß są związane z wadami oczu, kości, nerek, szkieletu lub innymi wadami u ludzi3. Odkrycia te podkreślają kluczową rolę prodomeny w generowaniu i utrzymywaniu aktywnego liganda oraz podkreślają znaczenie identyfikacji i rozszyfrowania roli produktów rozszczepienia opracowanych podczas proteolitycznego dojrzewania prekursorów z rodziny Tgfß.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół zasysania produktów rozszczepienia powstających podczas dojrzewania prekursorów rodziny Tgfß z blastocoele zarodków X. laevis, a następnie analizowania ich na immunoblotach. Protokół ten może być użyty do określenia, czy jeden lub więcej motywów konsensusu PC w białku prekursorowym jest rozszczepionych in vivo10,13, zidentyfikuj endogenne PC(s), które rozszczepiają każdy motyw13,14, porównaj in vivo tworzenie homodimerów rodziny Tgfß z heterodimerami10 lub przeanalizować, czy mutacje punktowe związane z chorobą człowieka w prekursorach Tgfß wpływają na ich zdolność do tworzenia funkcjonalnych ligandów dimerycznych.

<table><tbody><tr><td>&szlig;-merkaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>AC125470100</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Fisher</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Azotan wapnia</td><td>Fisher</td><td>C109-500</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy tłuczek do granulek/młynek</td><td>do tkanek Fisher</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td> <td>Dumont #5Narzędzia Fine Science</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana, 1 X 90 mm</td><td>Narshige</td><td>G-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Kosmówka ludzka gonadotropina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka iniekcyjna, 1 ml</td><td>Fisher</td><td>8881501368</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Igła, 26 g</td><td>Fisher</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz Picoliter</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Narashige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina-S</td><td>Pentair</td><td>TRS5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków xenopus laevis

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Dwa ramiona nadrodziny Transformującego Czynnika Wzrostu ß (Tgfß), reprezentowane odpowiednio przez ligandy Tgfß/Nodal lub Bone morphogenetic protein (Bmp), odgrywają zasadnicze role w rozwoju embrionalnym i homeostazie dorosłych. Członkowie rodziny Tgfß są wytwarzani jako nieaktywne prekursory, które dimeryzują i fałdują się w retikulum endoplazmatycznym. Prekursor jest następnie rozszczepiany na fragmenty liganda i prodomeny. Chociaż tylko dimeryczny ligand może angażować receptory Tgfß i aktywować sygnalizację w dół, rośnie świadomość, że ugrupowanie prodomenowe przyczynia się do aktywności liganda. W artykule opisano protokół, który można wykorzystać do identyfikacji produktów rozszczepienia powstających podczas aktywacji białek prekursorowych Tgfß. Prekursory Tgfß kodujące RNA są najpierw mikrowstrzykiwane do zarodków X. laevis. Następnego dnia produkty rozszczepienia są pobierane z blastocoele zarodków w stadium gastrula i analizowane na zachodnich plamach. Protokół ten można wykonać stosunkowo szybko, nie wymaga drogich odczynników i stanowi źródło skoncentrowanych produktów rozszczepienia Tgfß w warunkach fizjologicznych.

Celem opisanego poniżej eksperymentu było ustalenie, czy Bmp4 i Bmp7 tworzą heterodimery (dimery składające się z jednego ligandu Bmp4 i jednego ligandu Bmp7), homodimery (składające się z dwóch ligandów Bmp4 lub dwóch ligandów Bmp7), czy też mieszaninę obu tych form podczas ich współekspresji w X. laevis. Dane przedstawione na Rysunku 2 zostały pobrane z wcześniej opublikowanego badania10. Rysunek 2A przedstawia schemat produktó...

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Protokół ten można wykorzystać do badania procesu, w którym szerszy zakres segregowanych białek prekursorowych, w tym członków rodziny TGF-beta, jest przekształcany w białka aktywne po rozszczepieniu proteolitycznym. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia bardzo szybkie i niedrogie metody uzyskania wysoce skoncentrowanego produktu rozszczepienia TGF-beta in vivo w warunkach wizualizacji. Na początek, po wstrzyknięciu następnego dnia, usuń roztwór Ficoll i wszelkie martwe lub umierające zarodki, a następnie przepłucz zarodki raz lub dwa razy MBS i hoduj zarodki w MBS na stole w temperaturze pokojowej lub 16 stopni Celsjusza w inkubatorze, aby spowolnić rozwój.Podgrzej i pociągnij szklane kapilary do drobnego punktu za pomocą ściągacza do mikropipet z żądanymi ustawieniami. Za pomocą kleszczy odetnij końcówkę wyciągniętej igły. Aby zapobiec zatykaniu, otwór igły do aspiracji blastocele powinien być większy niż igły do mikroiniekcji.Włożyć igłę zasysającą do uchwytu igły podłączonego do mikrowstrzykiwacza i przymocować uchwyt igły do mikromanipulatora. Zarodki w stadium wczesnym i środkowym należy umieścić na naczyniu lub naczyniu do wstrzykiwań wypełnionych MBS. Wbić igłę pod powierzchnię zarodka w pobliżu tyczki zwierzęcia.Nacisnąć przycisk napełniania na mikrowstrzykiwaczu, obserwując igłę i zarodek przez mikroskop preparacyjny. W ciągu kilku sekund poziom przezroczystego płynu w igle wzrasta, a zarodek zapada się i staje się wklęsły. Naciskać pulsacyjnie przycisk wstrzykiwania jeden lub więcej razy, aby usunąć mętną białą istotę dostającą się do igły zawierającej zanieczyszczenia lub proteazy.Aby wykryć produkty rozszczepienia na immunoplamach, należy odessać płyn blastocele od 10 do 20 lub więcej zarodków w zależności od przeciwciała. Odpipetować jeden mikrolitr wody wolnej od jąder na kawałek parafiny umieszczony na tacce iniekcyjnej. Zanurz igłę w kropli wody i naciśnij przycisk wstrzykiwania, aby rozproszyć płyn blastocele do wody.Alternatywnie, aby wyrzucić płyn bezpośrednio na parafilm i zapobiec jego spłaszczeniu, naciśnij pulsacyjnie przycisk wstrzykiwania, aby usunąć płyn pod niższym ciśnieniem. Przenieś zebrany płyn z blastocele do sterylnej probówki mikrowirówkowej na lodzie i dodaj wodę bez jąder, aby dostosować końcową objętość do 30 mikrolitrów. Aby wykryć białka prekursorowe TGF-beta, przenieś zarodki pozbawione płynu blastocele do oddzielnej probówki na lodzie.Usuń nadmiar MBS i dodaj 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu lizatu zarodkowego. Aby w pełni homogenizować zarodki, pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aż nie pozostaną żadne grudki. Odwirować homogenizowane zarodki w schłodzonej mikrowirówce o temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut, a następnie usunąć 160 mikrolitrów supernatantu za pomocą pipety P200 i przenieść do nowej probówki na lodzie, uważając, aby uniknąć białych białek żółtka i innych zanieczyszczeń komórkowych w dolnej połowie probówki.Powtórzyć mikrowirowanie jeden raz i przenieść 128 mikrolitrów klarownego supernatantu do nowej probówki na lodzie. W tym momencie oczyszczone lizaty zarodkowe i zebrany płyn blastocele mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza tak długo, jak jest to pożądane. Deglikozyluj rozszczepione białka obecne w płynie blastocele zmodyfikowanym przez sieć trans-Golgiego za pomocą PNGazy F, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Deglikozylowane produkty migrowałyby jako bardziej skondensowane pasmo na żelach SDS, co może pomóc w dokładnej identyfikacji. Aby ocenić monomery fragmentów prodomeny i niesfałdowane białka w blastocele i lizacie, należy przeanalizować białka w warunkach redukujących, dodając pięć mikrolitrów redukującego buforu próbki 4X do 15 mikrolitrów płynu blastocelei i 15 mikrolitrów oczyszczonego lizatu zarodkowego. Aby ocenić tworzenie się rozszczepionych homodimerycznych lub heterodimerycznych ligandów w blastocele, przeanalizuj białka w warunkach nieredukujących, dodając pięć mikrolitrów nieredukującego buforu próbki 4X do pozostałych 15 mikrolitrów płynu blastocele, a następnie podgrzej go przez pięć minut i umieść na lodzie.Po zastosowaniu tego protokołu, białka zostały oddzielone za pomocą SDS-PAGE, a immunobloty zostały zbadane przeciwciałami, które rozpoznały znacznik epitopu myc. W warunkach redukcyjnych, w lizatach pochodzących z zarodków wykazujących ekspresję tylko Bmp4 lub Bmp7, wykryto pojedyncze prążko odpowiadające rozszczepionym monomerom Bmp4 i wolniej migrujące prążki odpowiadające rozszczepionym monomerom Bmp7. Oba prążki wykryto w zarodkach wykazujących jednoczesną ekspresję Bmp4 i Bmp7.Gdy białka zostały rozdzielone w warunkach nieredukcyjnych, wykryto pojedyncze dojrzałe prążki heterodimerów Bmp4 i 7 o pośredniej ruchliwości wraz ze śladową ilością homodimeru Bmp4 w zarodkach wykazujących koekspresję Bmp4 i Bmp7. Tworzenie heterodimerów Bmp4 i Bmp7 obserwowano również, gdy poziomy białka Bmp7 były wysokie. Jednak w tym przypadku nadmiar Bmp7 tworzył homodimery, a zarodki ulegały koekspresji Bmp4 i Bmp7.Wyniki te wykazały, że Bmp4 i 7 preferencyjnie tworzą heterodimery, gdy ulegają jednoczesnej ekspresji w zarodkach Xenopus laevis. W tym eksperymencie pobranie czystego blastocele jest najważniejszym krokiem, który wymaga doświadczenia w precyzyjnym obchodzeniu się z igłą. Więc po prostu próbuj i naprawiaj błędy.Ta procedura sprawdza, czy tworzą się heterodimery BMP i które aminokwasy są dla tego ważne. W następnym kroku można wygenerować mysz knockin, aby zapytać, czy te aminokwasy są funkcjonalnie ważne podczas rozwoju ssaków.

analysis-transforming-growth-factor-family-cleavage-products-secreted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Olbrzymie komórki trofoblastu (TGC) odgrywają kluczową rolę w łożysku, zapewniając zdrową ciążę. Przedstawiamy protokół oceny statusu transkrypcyjnego genów w TGC poprzez powstającą fluorescencyjną hybrydyzację in situ na skriostatach zarodków poimplantacyjnych lub krótkoterminowych hodowlach embrionalnych czopków ektołożyskowych dnia 7.

Analiza transkrypcyjna za pomocą powstającego RNA FISH gigantycznych komórek trofoblastu in vivo lub krótkoterminowe hodowle in vitro eksplantatów czopków ektołożyskowych

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Protokół opisujący tworzenie ludzkich blastoidów, które efektywnie, w odpowiednim czasie i sekwencyjnie generują komórki podobne do blastocyst.

Protokół modelowania rozwoju i implantacji blastocyst u ludzi

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Poznaj metodę analizy produktów rozpadu białek TGF-beta w blastocoele zarodków Xenopus laevis. Protokół umożliwia szybkie izolowanie i wykrywanie heterodimerów Bmp4 i Bmp7 metodą immunoblottingu.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów