Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej
9 sierpnia 2021
Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.
Protokół ten rozwiązuje typowe wyzwania związane z przetwarzaniem plwociny, które w przeszłości utrudniały stosowanie cytometrii przepływowej do wysokoprzepustowych klinicznych celów diagnostycznych. Protokół ten ma na celu zaoszczędzenie czasu poprzez wykorzystanie masy plwociny do określenia objętości barwienia przeciwciał i barwnika. Podczas inkubacji barwienia można przeprowadzić zliczanie komórek na dalszych etapach.
Ważne jest, aby uzyskać dokładną liczbę komórek, aby określić prawidłową objętość refuzji, aby zapobiec wszelkim problemom podczas pracy na cytometrze przepływowym. Protokół ten może zapewnić wgląd w obszary badań, które badają zdrowie płuc. Na przykład można badać choroby takie jak POChP, astma, rak płuc lub skutki COVID.
Procedurę zademonstruje dr Michael Lai, naukowiec zajmujący się badaniami i rozwojem z mojego laboratorium. Na początek zważ próbkę plwociny, aby określić objętości odczynników dysocjacyjnych. Przenieś próbkę do naczynia o odpowiedniej wielkości w oparciu o masę plwociny, a następnie dodaj jeden mililitr na gram 0,5% NAC i cztery mililitry na gram 0,1% DTT.
Wirować próbki z maksymalną prędkością przez 15 sekund i kołysać z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć tę próbkę zrównoważonym roztworem soli 4X Hanksa lub HBSS, aby zneutralizować NAC i DTT. A po szybkim wirowaniu kołysz próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko z nylonową siatką o grubości 100 mikrometrów do jednej lub więcej stożkowych probówek wirówek o pojemności 50 mililitrów, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zepchnij komórki w dół. Po zassaniu supernatantu połącz granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i przemyj HBSS w tych samych warunkach.
Zawiesić osad komórkowy w objętości buforu określonej przez początkową masę próbki plwociny. Pobrać podwielokrotność z zawiesiny komórkowej i zmieszać 10 mikrolitrów rozcieńczenia plwociny z 30 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, a następnie załadować do komór zliczających hemocytometru w celu zliczenia żywych/martwych komórek. Oznaczyć plwocinę w probówkach kompensacyjnych.
Dodaj przeciwciało HBSS i barwnik do każdej probówki z plwociną i probówek kompensacyjnych, jak wskazano w tekście. Dodaj komórki plwociny do probówek testowych i dodaj kulki kompensacyjne do probówek kompensacyjnych, jak wspomniano w tekście. Inkubować wszystkie probówki na lodzie, chronić przed światłem przez 35 minut.
Następnie, po napełnieniu probówek lodowatym HBSS, wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 800 razy G. W przypadku probówek kompensacyjnych należy zassać supernatant jak najbliżej granulek i strzepnąć granulki, aby się poluzowały. Następnie dodaj 0,5 mililitra zimnego HBSS do probówek kompensacyjnych i przechowuj probówki na lodzie w miejscu chronionym przed światłem, aż będą potrzebne do analizy cytometrii przepływowej. Następnie odessać supernatant z niezabarwionej plwociny, izotypu, krwi i nabłonków.
Poluzuj granulki, przesuwając rurki. Dodaj dwa mililitry 1% PFA do probówek niebarwionych i izotypowych oraz 10 mililitrów do probówek z krwią i nabłonkiem. Inkubować probówki na lodzie w sposób chroniony światłem przez 30 minut, następnie szybko wirować z maksymalną prędkością i ponownie inkubować przez kolejne 30 minut.
Następnie napełnij probówki lodowatym HBSS. Następnie odwirować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 1 600 razy G. Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i przesunąć probówkę palcami, aby poluzować komórki, a następnie dodać 200 mikrolitrów zimnego HBSS do probówek niebarwionych i izotypowych. Obliczyć i dodać wymaganą objętość HBSS do ponownego zawieszenia krwi i rurki nabłonkowej zgodnie z całkowitą liczbą komórek.
Przechowywać wszystkie próbki w probówkach kompensacyjnych zabezpieczonych przed światłem na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej. Zastosować odpowiednie procedury uruchamiania dla używanego cytometru przepływowego. Użyj mieszaniny koralików National Institute of Standards and Technology lub NIST, aby upewnić się, że napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego są ustawione tak, aby umieścić koraliki NIST tak, aby obejmowały działkę bez umieszczania ściegów zbyt blisko osi.
Ustaw natężenie przepływu na średnie dla LSRII lub wysokie dla Navios EX. Dostosuj napięcia dla każdego parametru używanego dla parametrów rozpraszania i fluorescencji, aby umieścić populacje komórek na skali. Użyj liczb ze strategią bramkowania jako wskazówek, aby odpowiednio dostosować napięcia. Najpierw należy zebrać dane dla niebarwionej próbki plwociny, następnie próbki barwionej izotypem, a następnie probówki z krwią i rurki nabłonkowej.
Masę plwociny wykorzystano do określenia objętości przeciwciał lub barwnika do barwienia. Korelacja między masą plwociny a wydajnością komórek nie była silna. Próbki plwociny podzielono na cztery kategorie wagowe, które skupiały się w rozkładzie wydajności komórek.
Każde użyte przeciwciało miareczkowano w stężeniu w fazie plateau, przy czym jako stężenie robocze wybrano najwyższy wskaźnik barwienia. We wszystkich kategoriach wagowych średnie zanieczyszczenie SEC wynosiło mniej niż 20%, przy czym wykazano odsetek żywotnych komórek. Przedstawiono strategię bramkowania wykorzystaną do analizy.
Koraliki NIST użyto do ustawienia bramki, którą przyłożono do próbki plwociny w celu wyeliminowania zanieczyszczeń. Drobne zanieczyszczenia były dodatkowo eliminowane przez bramę o szerokości wrotnej. Barwnik żywotności użyto do eliminacji martwych komórek, podczas gdy bramka singletowa usunęła dublety.
Znakowanie przeciwciałami anty-CD45 pozwoliło na oddzielenie żywych pojedynczych komórek plwociny na komórkę krwi i przedział nienależący do komórek krwi. Porównano profile uzyskane od Navios EX, LSRII i Lyric. Pokazano strategię bramkowania w celu eliminacji zanieczyszczeń, martwych komórek, dubletów oraz porównywania profili krwi i bez krwi.
Ta technika pozwoliła nam zastosować te metody do wykrywania ryzyka raka płuc do wykorzystania jako nieinwazyjny test kliniczny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół rozwiązuje powszechne problemy występujące podczas przetwarzania plwociny, ułatwiając jej wykorzystanie w cytometrii przepływowej do wysokoprzepustowej diagnostyki klinicznej. Podkreśla on znaczenie dokładnego zliczania komórek oraz objętości resuspensji dla powodzenia analizy cytometrycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Cytometria przepływowa
- Biologia komórki
- Badania nad zdrowiem płuc
Wstęp
- Opracowywanie plwocy historycznie stanowiło wyzwanie dla cytometrii przepływowej.
- Dokładne liczenie komórek jest kluczowe dla skutecznej analizy.
- Obszary badawcze obejmują POCHP, astmę, raka płuc oraz COVID-19.
- Celem niniejszego protokołu jest usprawnienie analizy plwocy w diagnostyce klinicznej.
Cel badania
- Aby zapewnić wydajną metodę dysocjacji plwociny do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
- Aby scharakteryzować subpopulacje komórkowe przy użyciu standardowych platform cytometrii przepływowej.
- Aby usprawnić badania nad zdrowiem płuc i chorobami powiązanymi.
Zastosowane metody
- Wyznaczanie objętości przeciwciał i barwników na podstawie masy plwociny.
- Wykonywanie obliczeń liczby komórek podczas inkubacji z barwnikami.
- Wykorzystanie cytometrii przepływowej do analizy końcowej.
- Charakteryzacja subpopulacji komórkowych w celu uzyskania informacji badawczych.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczną dysocjację plwociny do postaci zawiesin pojedynczych komórek.
- Uzyskano dokładne zliczenia komórek, co umożliwia efektywne przeprowadzenie cytometrii przepływowej.
- Zapewniono wgląd w stan zdrowia płuc oraz mechanizmy chorobowe.
- Usprawniony proces zwiększa możliwości diagnostyki klinicznej.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje niezawodną metodę analizy plwociny.
- Rozwiązuje on wcześniejsze problemy związane z przygotowaniem plwociny do cytometrii przepływowej.
- Wyniki te stanowią podstawę do dalszych badań nad chorobami płuc.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad chorobami płuc, umożliwiając wysokoprzepustową, ilościową analizę plwociny za pomocą cytometrii przepływowej. Przekształca on tradycyjną, niskowydajną i pracochłonną metodę cytologiczną w skalowalną, powtarzalną platformę odpowiednią do odkrywania biomarkerów oraz walidacji celów w terapeutyce układu oddechowego. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego, zapewniając rozdzielczość immunofenotypową linii krwiotwórczych i nabłonkowych przy jednoczesnym wykluczeniu zakłócających resztek komórkowych oraz komórek nabłonka płaskiego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej w mikrośrodowisku płuc w celu walidacji celów terapeutycznych w szlakach zapalnych i onkologicznych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zależność od wyspecjalizowanego personelu cytopatologicznego dzięki zautomatyzowanemu, standaryzowanemu fenotypowaniu.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez ilościowe określenie infiltracji komórek odpornościowych i stanów aktywacji nabłonka istotnych dla COPD, astmy, raka płuca oraz patologii płuc po COVID.
Przesiewanie i rozwój testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, multiparametryczne odczyty populacji CD45+ i CD45− w celu standaryzacji testów w ramach kampanii przesiewowych leków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe przetwarzanie próbek dzięki normalizacji reagentów w oparciu o wagę, co poprawia powtarzalność między ośrodkami i operatorami.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wykazano kompatybilność z cytometrami Navios EX, LSR II i Lyric, co wspiera transfer testów między platformami i centralne wykorzystanie laboratoriów głównych (core lab).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wykorzystanie identyfikacji makrofagów specyficznych dla płuc jako kontroli jakości w celu potwierdzenia pochodzenia próbki, co zwiększa pewność co do ciągłości przejścia z fazy przedklinicznej do klinicznej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia podłużny monitoring zmian immunologicznych i nabłonkowych w modelach chorobowych, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) podczas optymalizacji wiodących kandydatów.
- Pewność prognostyczna: Zapewnia gotowy do zastosowania model biomarkerów do oceny zaangażowania celu w zapaleniu płuc lub modulacji mikrośrodowiska guza.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając standaryzowane profilowanie immunologiczne próbek pochodzących z płuc, co wspiera weryfikację hipotez we wczesnej fazie odkrywania oraz walidację mechanistyczną na etapach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia badanie krajobrazów odpornościowych płuc i interakcji zmiennymi w modelach chorób w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiew: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów komórkowych odpowiednich do przesiewu bibliotek związków oraz testów zaangażowania celu.
- Analityka: Generuje wieloparametryczne dane z cytometrii przepływowej, umożliwiające statystyczne porównanie efektów terapeutycznych w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez bramkowanie specyficzne dla linii komórkowych oraz wykluczanie komórek nieżywotnych lub zanieczyszczeń na podstawie żywotności.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia ustandaryzowany, znormalizowany pod względem masy proces, który może być wdrożony w wielu ośrodkach i na różnych platformach instrumentów w celu spójnego generowania danych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez redukcję szumu wynikającego z obecności zanieczyszczeń i komórek nabłonka płaskiego.
- Wartość operacyjna: Poprawia przepustowość i powtarzalność dzięki dawkowaniu odczynników w oparciu o masę plwociny oraz znormalizowane strategie bramkowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze, oparte na danych decyzje typu go/no-go w programach leków na schorzenia dróg oddechowych, dostarczając mierzalnych fenotypów immunologicznych i nabłonkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez generowanie translacyjalnych danych biomarkerowych z nieinwazyjnych próbek płuc.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie kompensacji w cytometrii przepływowej, bramkowania oraz immunofenotypowania pierwotnych ludzkich komórek.
- Zależne od dostępu do cytometrów przepływowych z odpowiednią detekcją fluorescencji i rozdzielczością rozproszonego światła.
- Wymaga standaryzacji protokołów barwienia i wskaźników QC (np. normalizacji za pomocą kulek NIST) pomiędzy ośrodkami.
- Wymaga adaptacji paneli przeciwciał w zależności od biologii celu, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek i bramkowania singletów.
- Ograniczone przez jakość próbek i lepkość plwociny, co może wpływać na wydajność dysocjacji i liczbę uzyskanych komórek.
