Name: Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę analizy plwociny za pomocą cytometrii przepływowej do diagnostyki klinicznej. Protokół umożliwia dokładne liczenie komórek i charakteryzację podpopulacji komórkowych w badaniach nad chorobami płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Rodriguezowi za pomoc w przygotowaniu figury. Próbki plwociny przeprowadzono na BD LSR II w UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, wspieranym przez UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC w UT Health) i UL1 TR001120 (grant CTSA).

Wszystkie etapy przetwarzania plwociny są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.
1. Przygotowanie odczynnika przed rozpoczęciem dysocjacji plwociny
<ol>
	<li>Rozmrozić 1% paraformaldehydu (PFA), 25 ml na próbkę na lodzie i przechowywać w chłodzie do momentu użycia. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Przygotować utrwalacz zgodnie z instrukcjami producenta i zamrozić w temperaturze -20 °C w 25 ml porcji do czasu użycia.</li>
	<li>Przybliżyć masę próbki i rozmrozić 0,1% ditiotreitolu (DTT) w kroku 2.2 i doprowadzić do temperatury 37 °C. (Podwielokrotności DTT należy przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem).</li>
	<li>Doprowadź wystarczającą ilość 0,5% N-acetylo-L-cysteiny (NAC) do 37 °C dla kroku 2.2. (NAC powinien być świeży co tydzień i przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.)</li>
</ol>
2. Dysocjacja plwociny
<ol>
	<li>Zważyć próbkę plwociny, aby określić objętości odczynników dysocjacyjnych. 
	UWAGA: Próbkę uważa się za małą, jeśli masa początkowa wynosi ≤3 g, średnią, jeśli >3 g, ale ≤8 g, dużą, jeśli >8, ale ≤16 g, i bardzo dużą, jeśli próbka waży >16 g. Oznaczenia mały, średni, duży i bardzo duży będą używane w całym protokole. Ilość odczynników wymaganych do dysocjacji i znakowania różni się w zależności od wielkości próbki plwociny.</li>
	<li>Przenieś małą próbkę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, pożywkę do czystej plastikowej jednorazowej butelki o pojemności 250 ml lub dużą i bardzo dużą próbkę do czystej plastikowej butelki jednorazowego o pojemności 500 ml. Dodać 1 ml/g masy próbki 0,5% NAC i 4 mL/g masy próbki 0,1% DTT.</li>
	<li>Wiruj z maksymalną prędkością (przez 15 s), a następnie bujaj się w temperaturze pokojowej (z maksymalną prędkością) przez 15 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę czterema objętościami zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) (w oparciu o całkowitą objętość próbki + odczynników) w celu zneutralizowania NAC i DTT; szybko wirować z maksymalną prędkością i kołysać w temperaturze pokojowej przez 5 minut z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko (sitka) do komórek o grubości 100 μm z siatki nylonowej do jednej lub więcej stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, połączyć wszystkie granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie przemyć granulki HBSS w tych samych warunkach.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w objętości buforu określonej przez początkową masę próbki plwociny. 
	UWAGA: Małą próbkę zawiesza się ponownie w 250 μl HBSS. Pożywkę sample zawiesza się ponownie w 760 μl HBSS. Duże i bardzo duże próbki zawiesza się ponownie w 1460 μl HBSS.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórek do zliczania żywych/martwych komórek za pomocą błękitu trypanowego. 
	UWAGA: W przypadku małej próbki użyj 5 μl. W przypadku średniej, dużej lub bardzo dużej próbki należy użyć 10 μl. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 HBSS.
	<ol>
		<li>Zmieszać 10 μl rozcieńczonej plwociny z 30 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie próbki 1:40. Załaduj do komór zliczających hemocytometru w celu zliczenia komórek. 
		UWAGA: Może być konieczne dostosowanie końcowego rozcieńczenia, jeśli liczba komórek jest zbyt niska lub zbyt wysoka, aby uzyskać dokładne zliczenie. Zdecydowanie zaleca się skonsultowanie się z Guiot et al.20 w celu poprawnego odróżnienia komórek plwociny od SEC i zanieczyszczeń. Jest to niezbędne do dokładnego zliczania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z bardzo dużej próbki usuń 50 x 106 komórek z całości i dodaj do nowej probówki z wystarczającą ilością dodanego HBSS, aby uzyskać całkowitą objętość 1700 μL. 
	UWAGA: Potraktuj to jako dużą próbkę dla pozostałej części protokołu. Pozostałe próbki można wyrzucić lub wykorzystać do innych celów.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciałami i barwnikiem żywotności
<ol>
	<li>Wybór przeciwciał i barwnika barwiącego 
	UWAGA: Tabela 1 przedstawia przeciwciała i barwnik żywotności, które są używane w tym protokole, oraz identyfikujące przez nie populacje komórek.
	<ol>
		<li>Oznaczyć probówki zawierające komórki plwociny (etykiety znajdują się w Tabeli 2).</li>
		<li>Użyć probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml (kompatybilnych z zastosowanym cytometrem przepływowym) do probówki z próbką z niebarwionymi komórkami i probówki z kontrolą izotypu. Użyj stożkowych probówek o pojemności 15 ml do próbek krwi i rurki nabłonkowej. 
		UWAGA: Próbki te zostaną przeniesione do probówek do cytometrii przepływowej po barwieniu i utrwaleniu przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz rurki kompensacyjne (Tabela 3). 
	UWAGA: Używać probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml kompatybilnych z używanym cytometrem przepływowym.</li>
	<li>Dodać ilość HBSS, przeciwciała i/lub barwnika do każdej z probówek z komórkami plwociny i probówek kompensacyjnych, jak wskazano odpowiednio w tabeli 2 i tabeli 3. 
	UWAGA: Dodaj bufor (HBBS), przeciwciała i barwnik do wszystkich probówek przed dodaniem komórek lub kulek kompensacyjnych, aby upewnić się, że czas barwienia wszystkich probówek jest spójny.</li>
	<li>Dodać ilości objętości komórek plwociny wymienione w tabeli 2 do probówek.</li>
	<li>Dodaj koraliki kompensacyjne do rurek kompensacyjnych, jak podano w tabeli 3.</li>
	<li>Inkubować wszystkie probówki (probówki do oznaczania i kompensacji) na lodzie, chronione przed światłem, przez 35 minut. Następnie napełnić probówki lodowatym HBSS i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 800 x g.</li>
	<li>W przypadku probówek kompensacyjnych należy zassać supernatant jak najbliżej granulek i strzepnąć granulki, aby się poluzowały.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml zimnego HBSS do probówek kompensacyjnych, przechowywać je na lodzie w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu, gdy będą potrzebne do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Odessać supernatant z niebarwionego izotypu, krwi i probówek nabłonkowych po odwirowaniu (krok 3.6 z sekcji barwienia przeciwciał) i poluzować granulki, przesuwając probówki.</li>
</ol>
4. Utrwalenie za pomocą 1% paraformaldehydu (PFA)
<ol>
	<li>Dodaj zimny 1% PFA (który powinien być już rozmrożony) do niebarwionych probówek z izotypem, krwią i nabłonkiem; 2 ml do probówek niebarwionych i izotypowych oraz 10 ml do probówek z krwią i nabłonkiem.</li>
	<li>Inkubować probówki na lodzie, chronione przed światłem przez 1 godzinę. Wirować szybko z maksymalną prędkością po 30 minutach.</li>
	<li>Napełnij probówki lodowatym HBSS. Następnie odwirować probówki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 1600 x g.</li>
	<li>Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i przesunąć rurkę palcami, aby poluzować komórki.</li>
	<li>Dodać 200 μl zimnego HBSS do probówek niebarwionych i izotypowych.</li>
	<li>Obliczyć objętość HBSS do ponownego zawieszenia krwi i rurki nabłonkowej zgodnie z całkowitą liczbą komórek. 
	UWAGA: Objętość rekompozycji = 0,15 x [całkowita liczba komórek (etap 8 dysocjacji plwociny) / 106]. Użyj 50 x 106 jako liczby komórek dla bardzo dużej próbki.</li>
	<li>Przechowywać wszystkie probówki do pobierania próbek i kompensacji, chronione przed światłem, na lodzie w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej. 
	UWAGA: Ten protokół nie został przetestowany pod kątem przechowywania przez więcej niż 24 godziny.</li>
</ol>
5. Akwizycja danych na cytometrze przepływowym
<ol>
	<li>Zastosować odpowiednie procedury uruchamiania dla używanego cytometru przepływowego. 
	UWAGA: W tej części protokołu założono, że osoba obsługująca cytometr przepływowy jest przeszkolona w zakresie korzystania z dostępnego dla niej przyrządu, w szczególności w zakresie codziennych procedur, w tym sprawdzania stabilności układów optycznych i fluidycznych, technik standaryzacji rozpraszania światła i intensywności fluorescencji, a także obliczania i stosowania prawidłowej matrycy kompensacji.</li>
	<li>Użyj mieszaniny ściegów National Institute of Standards and Technology (NIST), aby upewnić się, że napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego są ustawione tak, aby koraliki NIST obejmowały całą działkę bez umieszczania ściegów zbyt blisko osi. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że zanieczyszczenia mniejsze niż 5 μm mogą zostać wyeliminowane przez analizę bramkowania po akwizycji. W zależności od zastosowanego cytometru przepływowego należy pamiętać, że najmniejsze kulki nie są wykluczane za pomocą progu (w przypadku korzystania z LSR II lub Lyric) lub z wysokim dyskryminatorem (przy użyciu cytometru przepływowego Navios EX). W przypadku Navios EX zastosowano wzmocnienie 2 dla rozproszenia przedniego i bocznego, napięcie 236 dla rozproszenia do przodu i 250 dla rozproszenia bocznego. W przypadku LSR II zastosowano napięcie rozproszenia przewodzenia 165 i napięcie rozproszenia bocznego 190</li>.
	<li>Ustaw natężenie przepływu na średnie (LSR II) lub wysokie (Navios EX). 
	UWAGA: Średnie lub wysokie natężenie przepływu dla większości instrumentów może być wykorzystane do uzyskania probówek plwociny. Ważne jest, aby pamiętać, że użycie zbyt małego natężenia przepływu lub zbyt rozcieńczenia próbki może spowodować osiadanie komórek, co skutkuje zwiększonym wirowaniem, co nie jest pożądane. W związku z tym przestrzeganie obliczonej objętości zawiesiny w kroku 4.6 powinno skutkować uzyskaniem gęstości komórkowej, którą można szybko uzyskać, ale nie zatkać maszyny.</li>
	<li>Dostosuj napięcia dla każdego parametru używanego dla parametrów rozproszenia i fluorescencji, aby umieścić populacje komórek na skali. Użyj liczb ze strategią bramkowania jako wskazówek, jak odpowiednio dostosować napięcia. 
	UWAGA: Upewnij się, że wszystkie potrzebne parametry są wybrane w oknie wyboru parametrów przed akwizycją, w przeciwnym razie dane nie zostaną pobrane.</li>
	<li>Najpierw uzyskaj dane dla niebarwionej próbki plwociny, następnie próbki barwionej izotypem, a następnie probówki z krwią i rurki nabłonkowej. 
	UWAGA: Jeśli zawiesina komórek jest zbyt stężona, aby cytometr przepływowy mógł uruchomić próbki bez zatykania, próbki można dodatkowo rozcieńczyć HBSS.</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są byłymi lub obecnymi pracownikami bioAffinity Technologies.

Zawartość komórkowa plwociny obejmuje dużą różnorodność komórek o szerokim zasięgu, którym często towarzyszy dużo zanieczyszczeń37. Ponadto analiza plwociny wymaga kontroli jakości, która potwierdza, że próbka została pobrana z płuc, a nie z jamy ustnej38. Dlatego analiza plwociny za pomocą cytometrii przepływowej nie jest tak prosta, jak na przykład w przypadku krwi, która uwalnia znacznie czystszą i jednorodną zawiesinę komórek. Protokół ten rozwiązał wszystkie te problem...

Postęp techniczny w sprzęcie i oprogramowaniu cytometrów przepływowych umożliwił jednoczesną identyfikację wielu różnych populacji komórek1,2,3,4. Na przykład wykorzystanie cytometru przepływowego w badaniach nad komórkami krwiotwórczymi doprowadziło do znacznie lepszego zrozumienia układu odpornościowego2 i hierarchii komórkowej układu krwiotwórczego5, a także diagnostycznego rozróżnienia wielu różnych nowotworów krwi6,7,8. Chociaż większość komórek plwociny jest pochodzenia krwiotwórczego9,10,11, cytometria przepływowa nie jest szeroko stosowana do analizy plwociny do celów diagnostycznych. Jednak kilka badań sugeruje, że ocena populacji komórek odpornościowych w plwocinie (najbardziej znaczący podzbiór komórek) może być bardzo pomocna w diagnozowaniu i/lub monitorowaniu chorób, takich jak astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP)12,13,14,15. Co więcej, istnienie markerów specyficznych dla nabłonka, które można wykorzystać w cytometrii przepływowej, pozwala na zbadanie następującego najbardziej znaczącego podzbioru komórek w plwocinie, komórek nabłonka płuc.
Oprócz możliwości analizy wielu różnych populacji komórek o różnym pochodzeniu tkankowym, cytometr przepływowy może ocenić dużą liczbę komórek w stosunkowo krótkim czasie. Dla porównania, analizy cytologiczne oparte na szkiełkach często wymagają wysoce wyspecjalizowanego personelu i/lub sprzętu. Analizy te mogą być pracochłonne, co prowadzi do tego, że analizowana jest tylko część próbki plwociny16.
Trzy krytyczne kwestie ograniczają powszechne stosowanie plwociny w cytometrii przepływowej. Pierwsza kwestia dotyczy pobierania plwociny. Plwocina jest zbierana przez kaszel, który wydala śluz z płuc do jamy ustnej, a następnie pluje do kubka zbiorczego. Ponieważ śluz przemieszcza się przez jamę ustną, istnieje duże prawdopodobieństwo zanieczyszczenia SEC. Zanieczyszczenie to komplikuje analizę próbki, ale problem można łatwo rozwiązać na platformie cytometrii przepływowej, jak pokazano w tym badaniu.
Nie każdy może wytwarzać plwocinę spontanicznie; dlatego opracowano kilka urządzeń, które pomagają w zbieraniu plwociny w sposób nieinwazyjny17. Jednym z takich urządzeń jest nebulizator, który okazał się wytwarzać wiarygodne próbki plwociny18,19,20. Chociaż nebulizator jest bardzo skutecznym sposobem nieinwazyjnego pobierania plwociny, jego użycie nadal wymaga ustawienia w placówce medycznej z wyspecjalizowanym personelem21. Natomiast urządzenia przenośne, takie jak flet płucny22,23,24 i acapella16,25 mogą być używane w domu, ponieważ są bardzo przyjazne dla użytkownika. Te urządzenia wspomagające są zarówno bezpieczne, jak i ekonomiczne.
Dla nas, acapella dawała konsekwentnie lepsze wyniki niż flet płucny16, dlatego urządzenie acapella zostało wybrane do pobierania plwociny. Zdecydowano się na 3-dniowe pobranie próbki, ponieważ głównym celem użycia plwociny jest opracowanie testu wykrywającego raka płuc16. Wykazano, że próbka 3-dniowa zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia raka płuc w porównaniu z próbką 1- lub 2-dniową26,27,28. Jednak inne metody pobierania plwociny mogą być preferowane do różnych celów. Jeśli stosowana jest inna metoda pobierania plwociny niż opisana tutaj, zaleca się staranne miareczkowanie każdego przeciwciała lub barwnika używanego do analizy cytometrii przepływowej; Dostępnych jest bardzo niewiele danych na temat wpływu różnych metod pobierania plwociny na białka docelowe w cytometrii przepływowej.
Drugą kwestią tłumiącą entuzjazm do używania plwociny do diagnostyki, głównie związaną z cytometrią przepływową, jest liczba komórek. Problemem jest zebranie wystarczającej liczby żywotnych komórek do wiarygodnej analizy. Dwa badania wykazały, że próbki plwociny pobrane metodami nieinwazyjnymi, za pomocą urządzenia wspomagającego, zawierają wystarczającą ilość żywotnych komórek, które można wykorzystać w diagnostyce klinicznej lub badaniach naukowych16,24. Jednak żadne z tych badań nie dotyczyło kwestii liczby komórek w odniesieniu do cytometrii przepływowej.
Dla badań, które stanowią podstawę tego protokołu, próbki plwociny zostały pobrane od uczestników o wysokim ryzyku zachorowania na raka płuc zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi dla każdego ośrodka badawczego. Uczestnicy wysokiego ryzyka zostali zdefiniowani jako osoby w wieku od 55 do 75 lat, palące 30 paczkolat i nie rzucające palenia w ciągu ostatnich 15 lat. Pacjentom pokazano, jak korzystać z urządzenia acapella zgodnie z instrukcjami producenta29 i pobierali plwocinę przez trzy kolejne dni w domu. Próbkę przechowywano w lodówce do ostatniego pobrania. W ostatnim dniu pobierania próbki zostały wysłane do laboratorium w nocy z zamrożonym zimnym opakowaniem. Próbki poddano obróbce w postaci zawiesiny jednokomórkowej w dniu ich otrzymania. Dzięki tej metodzie pobierania plwociny uzyskuje się więcej niż wystarczającą ilość żywotnych komórek do wiarygodnej analizy cytometrii przepływowej.
Na koniec, w związku z poprzednim problemem z numerem komórki, pojawia się pytanie, jak uwolnić komórki plwociny z jej śluzowego środowiska. W jaki sposób można utrzymać komórki przy życiu i stworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, która nie zatyka cytometru przepływowego? Opierając się na wstępnych pracach Pizzichini et al.30 i Miller et al.31, protokół ten opisuje łatwą i niezawodną metodę przetwarzania plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki, która jest odpowiednia do analizy cytometrycznej przepływowej. W tej metodzie wykorzystano ugruntowane wytyczne w zakresie cytometrii przepływowej32,33,34 w celu opracowania skutecznej strategii znakowania przeciwciał w celu identyfikacji komórek krwiotwórczych i nabłonkowych w plwocinie oraz zapewnienia ustawień instrumentu, środków kontroli jakości i wytycznych dotyczących analizy standaryzujących analizę plwociny na platformie cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>1% Paraformaldehyd Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; Nylonowe sitka do komórek M, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowa rurka sokoła</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anty-ludzka CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anty-ludzka CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anty-ludzka cytokeratyna</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Izotyp PanCK, CD3 i CD19</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 anty-ludzki CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>Izotyp CD66b FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne CompBead Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polistyrenowa sterylna butelka jednorazowego użytku 250 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna butelka z polistyrenu Corning 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& Koraliki T</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzki CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>Naprawialna plama żywotności</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki NIST, 05 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki NIST, 20 i mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki NIST, 30 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 anty-ludzki EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206/EpCAM Izotyp</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 anty-ludzki CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>dwuwodny EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Sputum, powszechnie używane do badania zawartości komórek i innych cech mikrośrodowiska w celu zrozumienia zdrowia płuc, jest tradycyjnie analizowane przy użyciu metodologii opartej na cytologii. Jego użyteczność jest ograniczona, ponieważ czytanie slajdów jest czasochłonne i wymaga wysoce wyspecjalizowanego personelu. Co więcej, rozległe szczątki i obecność zbyt wielu płaskonabłonkowych komórek nabłonka (SEC) lub komórek policzków często sprawiają, że próbka nie nadaje się do diagnozy. Natomiast cytometria przepływowa pozwala na wysokoprzepustowe fenotypowanie populacji komórkowych przy jednoczesnym wykluczeniu szczątków i SEC.
Protokół przedstawiony tutaj opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki, barwienie przeciwciał i utrwalanie populacji komórkowych oraz pobieranie próbek na platformie cytometrii przepływowej. Przedstawiono tutaj strategię bramkowania, która opisuje wykluczenie szczątków, martwych komórek (w tym SEC) i dubletów komórkowych. Ponadto praca ta wyjaśnia również, jak analizować żywotne, pojedyncze komórki plwociny w oparciu o klaster dodatnich i ujemnych populacji różnicowania (CD)45 w celu scharakteryzowania podzbiorów linii krwiotwórczych i nabłonkowych. Środek kontroli jakości jest również zapewniony poprzez identyfikację makrofagów specyficznych dla płuc jako dowodu na to, że próbka pochodzi z płuc i nie jest śliną. Wreszcie wykazano, że metoda ta może być stosowana do różnych platform cytometrycznych, dostarczając profile plwociny od tego samego pacjenta analizowane na trzech cytometrach przepływowych; Navios EX, LSR II i Lyric. Co więcej, protokół ten może być modyfikowany w celu uwzględnienia dodatkowych markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiono tutaj metodę analizy całej próbki plwociny na platformie cytometrii przepływowej, która sprawia, że plwocina jest podatna na opracowanie wysokoprzepustowej diagnostyki chorób płuc.

Niniejszy protokół został opracowany z myślą o warunkach laboratoryjnych w klinice. Podczas jego opracowania skupiono się na prostocie, efektywności i powtarzalności. Stwierdzono, że najbardziej czasochłonnym etapem przetwarzania plwociny jest liczenie komórek. Dlatego protokół został skonstruowany w taki sposób, aby przetwarzanie plwociny i znakowanie komórek mogły być wykonywane niezależnie od liczenia komórek, bez straty czasu. Precyzyjne policzenie komórek, które jest nadal niezbędne do odpowiedniego rozcieńczenia pr...

Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.

Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Protokół ten rozwiązuje typowe wyzwania związane z przetwarzaniem plwociny, które w przeszłości utrudniały stosowanie cytometrii przepływowej do wysokoprzepustowych klinicznych celów diagnostycznych. Protokół ten ma na celu zaoszczędzenie czasu poprzez wykorzystanie masy plwociny do określenia objętości barwienia przeciwciał i barwnika. Podczas inkubacji barwienia można przeprowadzić zliczanie komórek na dalszych etapach.Ważne jest, aby uzyskać dokładną liczbę komórek, aby określić prawidłową objętość refuzji, aby zapobiec wszelkim problemom podczas pracy na cytometrze przepływowym. Protokół ten może zapewnić wgląd w obszary badań, które badają zdrowie płuc. Na przykład można badać choroby takie jak POChP, astma, rak płuc lub skutki COVID.Procedurę zademonstruje dr Michael Lai, naukowiec zajmujący się badaniami i rozwojem z mojego laboratorium. Na początek zważ próbkę plwociny, aby określić objętości odczynników dysocjacyjnych. Przenieś próbkę do naczynia o odpowiedniej wielkości w oparciu o masę plwociny, a następnie dodaj jeden mililitr na gram 0,5% NAC i cztery mililitry na gram 0,1% DTT.Wirować próbki z maksymalną prędkością przez 15 sekund i kołysać z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć tę próbkę zrównoważonym roztworem soli 4X Hanksa lub HBSS, aby zneutralizować NAC i DTT. A po szybkim wirowaniu kołysz próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko z nylonową siatką o grubości 100 mikrometrów do jednej lub więcej stożkowych probówek wirówek o pojemności 50 mililitrów, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zepchnij komórki w dół. Po zassaniu supernatantu połącz granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i przemyj HBSS w tych samych warunkach.Zawiesić osad komórkowy w objętości buforu określonej przez początkową masę próbki plwociny. Pobrać podwielokrotność z zawiesiny komórkowej i zmieszać 10 mikrolitrów rozcieńczenia plwociny z 30 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, a następnie załadować do komór zliczających hemocytometru w celu zliczenia żywych/martwych komórek. Oznaczyć plwocinę w probówkach kompensacyjnych.Dodaj przeciwciało HBSS i barwnik do każdej probówki z plwociną i probówek kompensacyjnych, jak wskazano w tekście. Dodaj komórki plwociny do probówek testowych i dodaj kulki kompensacyjne do probówek kompensacyjnych, jak wspomniano w tekście. Inkubować wszystkie probówki na lodzie, chronić przed światłem przez 35 minut.Następnie, po napełnieniu probówek lodowatym HBSS, wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 800 razy G. W przypadku probówek kompensacyjnych należy zassać supernatant jak najbliżej granulek i strzepnąć granulki, aby się poluzowały. Następnie dodaj 0,5 mililitra zimnego HBSS do probówek kompensacyjnych i przechowuj probówki na lodzie w miejscu chronionym przed światłem, aż będą potrzebne do analizy cytometrii przepływowej. Następnie odessać supernatant z niezabarwionej plwociny, izotypu, krwi i nabłonków.Poluzuj granulki, przesuwając rurki. Dodaj dwa mililitry 1% PFA do probówek niebarwionych i izotypowych oraz 10 mililitrów do probówek z krwią i nabłonkiem. Inkubować probówki na lodzie w sposób chroniony światłem przez 30 minut, następnie szybko wirować z maksymalną prędkością i ponownie inkubować przez kolejne 30 minut.Następnie napełnij probówki lodowatym HBSS. Następnie odwirować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 1 600 razy G. Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i przesunąć probówkę palcami, aby poluzować komórki, a następnie dodać 200 mikrolitrów zimnego HBSS do probówek niebarwionych i izotypowych. Obliczyć i dodać wymaganą objętość HBSS do ponownego zawieszenia krwi i rurki nabłonkowej zgodnie z całkowitą liczbą komórek.Przechowywać wszystkie próbki w probówkach kompensacyjnych zabezpieczonych przed światłem na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej. Zastosować odpowiednie procedury uruchamiania dla używanego cytometru przepływowego. Użyj mieszaniny koralików National Institute of Standards and Technology lub NIST, aby upewnić się, że napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego są ustawione tak, aby umieścić koraliki NIST tak, aby obejmowały działkę bez umieszczania ściegów zbyt blisko osi.Ustaw natężenie przepływu na średnie dla LSRII lub wysokie dla Navios EX. Dostosuj napięcia dla każdego parametru używanego dla parametrów rozpraszania i fluorescencji, aby umieścić populacje komórek na skali. Użyj liczb ze strategią bramkowania jako wskazówek, aby odpowiednio dostosować napięcia. Najpierw należy zebrać dane dla niebarwionej próbki plwociny, następnie próbki barwionej izotypem, a następnie probówki z krwią i rurki nabłonkowej.Masę plwociny wykorzystano do określenia objętości przeciwciał lub barwnika do barwienia. Korelacja między masą plwociny a wydajnością komórek nie była silna. Próbki plwociny podzielono na cztery kategorie wagowe, które skupiały się w rozkładzie wydajności komórek.Każde użyte przeciwciało miareczkowano w stężeniu w fazie plateau, przy czym jako stężenie robocze wybrano najwyższy wskaźnik barwienia. We wszystkich kategoriach wagowych średnie zanieczyszczenie SEC wynosiło mniej niż 20%, przy czym wykazano odsetek żywotnych komórek. Przedstawiono strategię bramkowania wykorzystaną do analizy.Koraliki NIST użyto do ustawienia bramki, którą przyłożono do próbki plwociny w celu wyeliminowania zanieczyszczeń. Drobne zanieczyszczenia były dodatkowo eliminowane przez bramę o szerokości wrotnej. Barwnik żywotności użyto do eliminacji martwych komórek, podczas gdy bramka singletowa usunęła dublety.Znakowanie przeciwciałami anty-CD45 pozwoliło na oddzielenie żywych pojedynczych komórek plwociny na komórkę krwi i przedział nienależący do komórek krwi. Porównano profile uzyskane od Navios EX, LSRII i Lyric. Pokazano strategię bramkowania w celu eliminacji zanieczyszczeń, martwych komórek, dubletów oraz porównywania profili krwi i bez krwi.Ta technika pozwoliła nam zastosować te metody do wykrywania ryzyka raka płuc do wykorzystania jako nieinwazyjny test kliniczny.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji i liczenia różnych komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Początkowo pojedyncze komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą barwnika żywotności, a następnie następuje różnicowe barwienie powierzchniowych białek markerowych, co umożliwia precyzyjne wyliczenie każdego typu komórek.

Identyfikacja i liczenie komórek odpornościowych w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym metodą cytometrii przepływowej

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.

Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania cząstek obciążonych alergenami za pomocą cytometrii przepływowej. Cząstki pyłu zawieszonego w otoczeniu mogą pełnić rolę nośników zaadsorbowanych alergenów. Pokazujemy tutaj, że cytometria przepływowa, metoda szeroko stosowana do charakteryzowania zawieszonych ciał stałych o średnicy &gt;0,5 μm, może być stosowana do pomiaru tych cząstek obciążonych alergenami.

Analiza cytometryczna przepływowa alergenu związanego z cząstkami bet v 1 w PM10

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy technikę indukcji plwociny. Protokół ten wyjaśnia również przetwarzanie plwociny w celu przeprowadzenia różnicowej liczby komórek oraz pobrania supernatantu plwociny i komórek do dalszej analizy.

Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Opisane tutaj protokoły dostarczają przewodnika do wizualizacji i ilościowego określenia aktywności proteaz neutrofilowych w ludzkiej plwocinie. Zastosowania takiej analizy obejmują zarówno ocenę leczenia przeciwzapalnego, jak i walidację biomarkerów, badania przesiewowe leków i badania kliniczne na dużych kohortach.

Monitorowanie aktywności elastazy neutrofilowej i katepsyny G w próbkach ludzkiej plwociny

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Poznaj metodę analizy plwociny za pomocą cytometrii przepływowej do diagnostyki klinicznej. Protokół umożliwia dokładne liczenie komórek i charakteryzację podpopulacji komórkowych w badaniach nad chorobami płuc.

Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów