Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej
August 9th, 2021
Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.
Protokół ten rozwiązuje typowe wyzwania związane z przetwarzaniem plwociny, które w przeszłości utrudniały stosowanie cytometrii przepływowej do wysokoprzepustowych klinicznych celów diagnostycznych. Protokół ten ma na celu zaoszczędzenie czasu poprzez wykorzystanie masy plwociny do określenia objętości barwienia przeciwciał i barwnika. Podczas inkubacji barwienia można przeprowadzić zliczanie komórek na dalszych etapach.
Ważne jest, aby uzyskać dokładną liczbę komórek, aby określić prawidłową objętość refuzji, aby zapobiec wszelkim problemom podczas pracy na cytometrze przepływowym. Protokół ten może zapewnić wgląd w obszary badań, które badają zdrowie płuc. Na przykład można badać choroby takie jak POChP, astma, rak płuc lub skutki COVID.
Procedurę zademonstruje dr Michael Lai, naukowiec zajmujący się badaniami i rozwojem z mojego laboratorium. Na początek zważ próbkę plwociny, aby określić objętości odczynników dysocjacyjnych. Przenieś próbkę do naczynia o odpowiedniej wielkości w oparciu o masę plwociny, a następnie dodaj jeden mililitr na gram 0,5% NAC i cztery mililitry na gram 0,1% DTT.
Wirować próbki z maksymalną prędkością przez 15 sekund i kołysać z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć tę próbkę zrównoważonym roztworem soli 4X Hanksa lub HBSS, aby zneutralizować NAC i DTT. A po szybkim wirowaniu kołysz próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko z nylonową siatką o grubości 100 mikrometrów do jednej lub więcej stożkowych probówek wirówek o pojemności 50 mililitrów, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zepchnij komórki w dół. Po zassaniu supernatantu połącz granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i przemyj HBSS w tych samych warunkach.
Zawiesić osad komórkowy w objętości buforu określonej przez początkową masę próbki plwociny. Pobrać podwielokrotność z zawiesiny komórkowej i zmieszać 10 mikrolitrów rozcieńczenia plwociny z 30 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, a następnie załadować do komór zliczających hemocytometru w celu zliczenia żywych/martwych komórek. Oznaczyć plwocinę w probówkach kompensacyjnych.
Dodaj przeciwciało HBSS i barwnik do każdej probówki z plwociną i probówek kompensacyjnych, jak wskazano w tekście. Dodaj komórki plwociny do probówek testowych i dodaj kulki kompensacyjne do probówek kompensacyjnych, jak wspomniano w tekście. Inkubować wszystkie probówki na lodzie, chronić przed światłem przez 35 minut.
Następnie, po napełnieniu probówek lodowatym HBSS, wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 800 razy G. W przypadku probówek kompensacyjnych należy zassać supernatant jak najbliżej granulek i strzepnąć granulki, aby się poluzowały. Następnie dodaj 0,5 mililitra zimnego HBSS do probówek kompensacyjnych i przechowuj probówki na lodzie w miejscu chronionym przed światłem, aż będą potrzebne do analizy cytometrii przepływowej. Następnie odessać supernatant z niezabarwionej plwociny, izotypu, krwi i nabłonków.
Poluzuj granulki, przesuwając rurki. Dodaj dwa mililitry 1% PFA do probówek niebarwionych i izotypowych oraz 10 mililitrów do probówek z krwią i nabłonkiem. Inkubować probówki na lodzie w sposób chroniony światłem przez 30 minut, następnie szybko wirować z maksymalną prędkością i ponownie inkubować przez kolejne 30 minut.
Następnie napełnij probówki lodowatym HBSS. Następnie odwirować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 1 600 razy G. Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i przesunąć probówkę palcami, aby poluzować komórki, a następnie dodać 200 mikrolitrów zimnego HBSS do probówek niebarwionych i izotypowych. Obliczyć i dodać wymaganą objętość HBSS do ponownego zawieszenia krwi i rurki nabłonkowej zgodnie z całkowitą liczbą komórek.
Przechowywać wszystkie próbki w probówkach kompensacyjnych zabezpieczonych przed światłem na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej. Zastosować odpowiednie procedury uruchamiania dla używanego cytometru przepływowego. Użyj mieszaniny koralików National Institute of Standards and Technology lub NIST, aby upewnić się, że napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego są ustawione tak, aby umieścić koraliki NIST tak, aby obejmowały działkę bez umieszczania ściegów zbyt blisko osi.
Ustaw natężenie przepływu na średnie dla LSRII lub wysokie dla Navios EX. Dostosuj napięcia dla każdego parametru używanego dla parametrów rozpraszania i fluorescencji, aby umieścić populacje komórek na skali. Użyj liczb ze strategią bramkowania jako wskazówek, aby odpowiednio dostosować napięcia. Najpierw należy zebrać dane dla niebarwionej próbki plwociny, następnie próbki barwionej izotypem, a następnie probówki z krwią i rurki nabłonkowej.
Masę plwociny wykorzystano do określenia objętości przeciwciał lub barwnika do barwienia. Korelacja między masą plwociny a wydajnością komórek nie była silna. Próbki plwociny podzielono na cztery kategorie wagowe, które skupiały się w rozkładzie wydajności komórek.
Każde użyte przeciwciało miareczkowano w stężeniu w fazie plateau, przy czym jako stężenie robocze wybrano najwyższy wskaźnik barwienia. We wszystkich kategoriach wagowych średnie zanieczyszczenie SEC wynosiło mniej niż 20%, przy czym wykazano odsetek żywotnych komórek. Przedstawiono strategię bramkowania wykorzystaną do analizy.
Koraliki NIST użyto do ustawienia bramki, którą przyłożono do próbki plwociny w celu wyeliminowania zanieczyszczeń. Drobne zanieczyszczenia były dodatkowo eliminowane przez bramę o szerokości wrotnej. Barwnik żywotności użyto do eliminacji martwych komórek, podczas gdy bramka singletowa usunęła dublety.
Znakowanie przeciwciałami anty-CD45 pozwoliło na oddzielenie żywych pojedynczych komórek plwociny na komórkę krwi i przedział nienależący do komórek krwi. Porównano profile uzyskane od Navios EX, LSRII i Lyric. Pokazano strategię bramkowania w celu eliminacji zanieczyszczeń, martwych komórek, dubletów oraz porównywania profili krwi i bez krwi.
Ta technika pozwoliła nam zastosować te metody do wykrywania ryzyka raka płuc do wykorzystania jako nieinwazyjny test kliniczny.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół rozwiązuje typowe wyzwania związane z przetwarzaniem plwociny, ułatwiając jej zastosowanie w cytometrii przepływowej do diagnostyki klinicznej o wysokiej wydajności. Podkreśla znaczenie dokładnego liczenia komórek i objętości ponownego zawiesiny dla pomyślnej analizy cytometrii przepływowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Cytometria przepływowa
- Biologia komórki
- Badania nad zdrowiem płuc
Tło
- Przetwarzanie plwociny historycznie stanowiło wyzwanie dla cytometrii przepływowej.
- Dokładne liczenie komórek jest kluczowe dla skutecznej analizy.
- Obszary badań obejmują POChP, astmę, raka płuc i COVID-19.
- Ten protokół ma na celu usprawnienie analizy plwociny do diagnostyki klinicznej.
Cel badania
- Zapewnić efektywną metodę dysocjacji plwociny w pojedynczą zawiesinę komórkową.
- Zcharakteryzować podzbiory komórkowe za pomocą standardowych platform cytometrii przepływowej.
- Poprawić badania nad zdrowiem płuc i chorobami związanymi z nimi.
Stosowane metody
- Określanie objętości barwników i substancji barwiących w oparciu o wagę plwociny.
- Przeprowadzanie liczenia komórek podczas inkubacji z barwnikiem.
- Wykorzystanie cytometrii przepływowej do dalszej analizy.
- Zcharakteryzowanie podzbiorów komórkowych dla uzyskania wnikliwych informacji.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem dysocjuje plwocinę w pojedyncze zawiesiny komórkowe.
- Uzyskano dokładne liczenie komórek, ułatwiając skuteczną cytometrię przepływową.
- Zostały uzyskane wglądy dotyczące zdrowia płuc i mechanizmów chorobowych.
- Usprawniony proces poprawia zdolności diagnostyczne kliniczne.
Konkluzje
- Ten protokół oferuje niezawodną metodę analizy plwociny.
- Rozwiązuje wcześniejsze wyzwania w przetwarzaniu plwociny dla cytometrii przepływowej.
- Wyniki wspierają dalsze badania nad chorobami związanymi z płucami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
