Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi do oceny makropinocytarnego pobierania składników odżywczych (węglowodanów i białka) przez komórki nadpobudliwe mTORC1. Opisano szczegółowe kroki ilościowego określania wychwytu znakowanego fluorescencyjnie dekstranu i albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
Makropinocytoza to wysoce konserwatywny, zależny od aktyny proces endocytarny, który umożliwia pobieranie materiału zewnątrzkomórkowego, w tym białek i lipidów. W proliferujących komórkach makropinocytoza może dostarczać zewnątrzkomórkowe składniki odżywcze do lizosomu, przetwarzane na krytyczne bloki budulcowe makrocząsteczek. Ostatnie badania wykazały zależność wielu nowotworów od makropinocytozy, w tym raka piersi, jelita grubego i trzustki. Uważa się, że mutacje Ras są zdarzeniami napędzającymi inicjację makropinocytozy, prowadzącą do aktywacji komórkowych procesów anabolicznych poprzez szlak sygnałowy mTORC1. Co ciekawe, mTORC1 może być również aktywowany przez makropinocytozę niezależnie od Ras. Dlatego makropinocytoza stanowi podatność metaboliczną, którą można wykorzystać do zwalczania guzów makropinocytarnych poprzez terapeutyczne ograniczenie ich dostępu do składników odżywczych.
W zespole stwardnienia guzowatego (TSC) i limfangioleiomiomatozie (LAM), hiperaktywacja mTORC1 prowadzi do zwiększenia makropinocytozy i przeprogramowania metabolicznego. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do ilościowej oceny makropinocytozy w komórkach ssaków. Stosuje się MEF z niedoborem TSC2, które wykazują nieprawidłową aktywację mTORC1 i wykazano, że mają zwiększoną makropinocytozę w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję TSC2. Komórki leczone farmakologicznymi inhibitorami makropinocytozy inkubuje się z znakowaną fluorescencyjnie, utrwalaną lizyną dektranem o masie 70 kDa lub znakowaną fluorescencyjnie albuminą surowicy bydlęcej (BSA) oznaczaną metodą cytometrii przepływowej. Do tej pory opracowano solidne techniki obrazowe do ilościowej oceny makropinocytozy w komórkach nowotworowych in vitro i in vivo. Analiza ta zapewnia ilościową ocenę makropinocytozy w wielu warunkach eksperymentalnych i uzupełnia istniejące techniki obrazowe.
Makropinocytoza jest procesem endocytycznym służącym do masowego pobierania materiału z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, po którym następuje tworzenie makropinozomów, które są następnie recyklingowane do błony komórkowej lub łączą się z lizosomami w celu degradacji zinternalizowanego ładunku1,2. Choć pobieranie ładunku jest nieselektywne, makropinocytoza jest procesem wieloetapowym, ściśle regulowanym przez GTPazy Rab i fosfolipidy błonowe3,4. Warto zauważyć, że komórki nowotworowe wykorzystują makropinocytozę do internalizacji składników odżywczych z z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Leczenie komórkowe
Dzień 1
Dzień 2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ritanseryna hamuje makropinocytozę w TSC2komórki z niedoborem
Wykazaliśmy wcześniej, że pobieranie składników odżywczych drogą makropinocytozy wzrasta trzykrotnie w TSC2komórki z niedoborem [czegoś] w porównaniu do TSC2komórki wykazujące ekspresję16W przypadku TSC i LAM makropinocytoza jest zapśredniczona przez kinazę diacyloglicerolową alfa (DGKA). Produktem metabolicznym DGKA jest kwas fosfatydowy (PA), który stano.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W tym miejscu opisujemy ilościowe podejście do oceny makropinocytozy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta zapewnia dokładny i szybki pomiar znakowanego fluorescencyjnie makropinocytarnego dekstranu ładunkowego i albuminy. Wcześniejsze badania dokładnie scharakteryzowały indeks makropinocytarny komórek nowotworowych przy użyciu metod mikroskopii konfokalnej15,20. Chociaż metody te dokładnie określają ilościowo internalizację, rozmiar i rozkład przestrzenny.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Nagroda za rozwój kariery Fundacji LAM. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Krytycznej lektury dokonał Hilaire C. Lam.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Pożywka wzrostowa |
| EIPA (amiloryd) | Sigma Aldrich | A3085 | Inhibitor makropinocytozy |
| FBS | R& D Systems | S11150 | Płodowa surowica bydlęca |
| FITC-Dekstran | Invitrogen | D1822 | Fluorescencyjny polisacharyd (70kDa) |
| Parafolmadehyd | Pierce | 28906 | Środek utrwalający |
| PBS | Gibco | 10010-023 | Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna |
| Penicilina / Streptomycyna | Sigma Aldrich | P4458-100ML | Antybiotyki |
| do hodowli komórkowychKwas fosfatydowy | Avanti | 840101P | Fosfolipid pochodzący z jaj |
| Ritanserin | Tocris | 1955 | Inhibitor DGKA |
| TMR-BSA | Invitrogen | A23016 | Albumina fluorescencyjna |
| Trypsyna | Sigma Aldrich | 25300-054 | Środek dysocjacyjny |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny