Name: Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę mezoskopowego obrazowania całego serca myszy z zachowaniem trójwymiarowej organizacji tkanek. Technika łączy protokół przezroczystości z mikroskopią light-sheet, umożliwiając rekonstrukcję z rozdzielczością mikrometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant nr 952166 (REPAIR), MUR w ramach programu FISR, projektu FISR2019_00320 i Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projektu PERCARE.

Wszystkie procedury dotyczące postępowania ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych oraz zgodne z zasadami i przepisami włoskiego Ministerstwa Zdrowia. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (numer protokołu 647/2015-PR). Wszystkie zwierzęta zostały dostarczone przez firmę ENVIGO z Włoch. Do tych eksperymentów wykorzystano 5 samców myszy C57BL/6J w wieku 6 miesięcy.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,6) w kapturze chemicznym. Przechowywać 4% porcje PFA w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj roztwór hydrożelu: Wymieszaj 4% akrylamidu, 0,05% bis-akrylamidu, 0,25% inicjatora AV-044 w 0,01 M PBS w kapturze chemicznym. Odczynniki i roztwór należy przechowywać na lodzie przez cały czas przygotowania. Porcje hydrożelu należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj roztwór czyszczący: Wymieszaj 200 mM kwasu borowego, 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej; pH 8,6 w kapturze chemicznym. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 21-37 °C, aby uniknąć wytrącania się SDS.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór Tyrode w dniu eksperymentu: Dodaj 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 i 4,7 mM KCl; miareczkować do pH 7,4 za pomocą 1 M NaOH.</li>
</ol>
2. Izolacja serca
<ol>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 0,1 ml heparyny 500 j.m. 30 minut przed zabiegiem izolacji serca.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml i trzy 6-centymetrowe szalki Petriego świeżym roztworem Tyrode. Wykonaj małą szczelinę (o głębokości 3-4 mm) na granicy jednej z szalek Petriego i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przymocuj kaniulę o średnicy 1 mm do strzykawki i włóż ją w szczelinę szalki Petriego. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml 4% PFA i trzymaj ją w kapturze chemicznym. Przygotuj pustą szalkę Petriego pod maską.</li>
	<li>Znieczulić mysz 3% izofluranem/tlenem przy natężeniu przepływu 1,0 l/min i poświęcić ją przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z obowiązującymi zasadami dobrostanu zwierząt.</li>
	<li>Po złożeniu ofiary zdejmij futro z klatki piersiowej i otwórz skrzynię, aby mieć pełny dostęp do serca.</li>
	<li>Wyizoluj serce, zanurz je na szalce Petriego uprzednio wypełnionej 50 ml roztworu tyrodu. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć aortę bezpośrednio w pobliżu łuku aorty, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Przenieś serce pod mikroskop stereoskopowy i ostrożnie wykonaj kaniulację. Nie wkładaj kaniuli zbyt głęboko do aorty (nie więcej niż 2 mm), aby uniknąć uszkodzenia tkanek.</li>
	<li>Użyj małego zacisku i szwu (rozmiar 5/0), aby przymocować serce do kaniuli.</li>
	<li>Wykonać perfuzję serca za pomocą 30 ml roztworu Tyrode pod stałym ciśnieniem 10 ml/min, aby usunąć krew z naczyń.</li>
	<li>Odłącz kaniulę od strzykawki i umieść serce na szalce Petriego wypełnionej roztworem Tyrode'a. Uważaj, aby w kaniuli nie dostały się pęcherzyki powietrza; W przeciwnym razie należy prawidłowo usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną zimnym 4% PFA do kaniuli i wykonaj perfuzję serca pod tym samym stałym ciśnieniem.</li>
	<li>Inkubować serce w 10 ml 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc (O/N). Aby uniknąć degradacji tkanek, wykonaj kroki 2.6-2.13 w jak najkrótszym czasie.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie serca
<ol>
	<li>Następnego dnia umyć serce w 0,01 M PBS 3 razy w temperaturze 4 °C przez 15 min. 
	UWAGA: Po tym etapie serce może być przechowywane w PBS + 0,01% azydku sodu (NaN3) w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Inkubować serce w 30 ml roztworu hydrożelu, wstrząsając (15 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 3 dni.</li>
	<li>Odgazowanie próbki w temperaturze pokojowej za pomocą osuszacza, pompy próżniowej i systemu rur, który łączy suszarkę zarówno z pompą, jak i rurociągiem azotu.
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę w suszarce i otworzyć fiolkę, trzymając na niej nakrętkę.</li>
		<li>Zamknij osuszacz i usuń tlen z rurki, otwierając rurociąg azotu.</li>
		<li>Włącz pompę próżniową, aby usunąć tlen z suszarki na 10 minut.</li>
		<li>Wyłącz pompę i za pomocą pokrętła osuszacza otwórz rurociąg azotu. Gdy ciśnienie zrówna się ciśnieniu atmosferycznemu, ostrożnie otwórz suszarkę i szybko zamknij fiolkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj serce w odgazowanym roztworze hydrożelu w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w spoczynku.</li>
	<li>Gdy hydrożel jest prawidłowo spolimeryzowany i wydaje się całkowicie galaretowaty, ostrożnie wyjmij z niego serce i umieść je w uchwycie na próbkę.</li>
	<li>Włożyć uchwyt na próbkę z sercem do jednej z komór czyszczących i odpowiednio go zamknąć, aby uniknąć wycieków roztworu czyszczącego.</li>
	<li>Włączyć łaźnię wodną, w której umieszczony jest pojemnik z roztworem czyszczącym, oraz pompę perystaltyczną, aby rozpocząć recyrkulację roztworu czyszczącego.</li>
	<li>Raz w tygodniu należy zmienić roztwór czyszczący w pojemniku, aby przyspieszyć procedurę klarowania.</li>
</ol>
4. Barwienie błony komórkowej
<ol>
	<li>Gdy serce wydaje się całkowicie oczyszczone, wyjmij je z uchwytu na próbkę i myj w 50 ml rozgrzanego PBS przez 24 godziny. Płucz ponownie w 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) przez 24 godziny.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 0,01 mg/ml aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) - Alexa Fluor 633 w 3 ml PBS-T 1x w wstrząsaniu (50 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 7 dni.</li>
	<li>Po 7-dniowej inkubacji przemyć próbkę w 50 ml PBS-T 1x w temperaturze pokojowej w wytrząsaniu przez 24 godziny.</li>
	<li>Próbkę inkubować w 4% PFA przez 15 minut, a następnie myć ją 3 razy w PBS przez 5 minut każdy. 
	UWAGA: Po tym etapie serce może być przechowywane w PBS + 0,01% NaN3 w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Inkubować serce w rosnących stężeniach 2,2′-tiodieetanolu (TDE) w 0,01 M PBS (20% i 47% TDE/PBS) przez 8 godzin każdy, aż do końcowego stężenia 68% TDE w 0,01 M PBS, aby uzyskać wymagany współczynnik załamania światła (RI = 1,46). Jest to nośnik dopasowujący RI (RI-medium) do pobierania obrazów16.</li>
</ol>
5. Montaż i akwizycja serca
UWAGA: Wszystkie elementy systemu optycznego są szczegółowo wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Delikatnie napełnij około 80% zewnętrznej kuwety (kwarcowej, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) RI-medium. 
	UWAGA: W tym przypadku możliwe jest zastosowanie różnych rozwiązań nieulotnych, które gwarantują RI na poziomie 1,46.</li>
	<li>Delikatnie napełnij wewnętrzną kuwetę (kwarc, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) tym samym medium RI.</li>
	<li>Zanurz próbkę w wewnętrznej kuwecie. Opisana powyżej inkubacja próbki pozwala na utrzymanie stabilności próbki w pożywce RI bez konieczności jej przetrzymywania.</li>
	<li>Delikatnie przesuń próbkę na dno kuwety za pomocą cienkiej pęsety i ułóż serce tak, aby jego oś podłużna była równoległa do głównej osi kuwety, aby zminimalizować drogę światła wzbudzającego przez tkankę podczas skanowania.</li>
	<li>Delikatnie przymocuj dopasowaną zatyczkę nad wewnętrzną kuwetą za pomocą dwóch.</li>
	<li>Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu za pomocą magnesów.</li>
	<li>Przełóż pionowy stolik na próbkę ręcznie, aby zanurzyć wewnętrzną kuwetę w zewnętrznej.</li>
	<li>Włącz źródło światła wzbudzenia (długość fali 638 nm), ustawiając niską moc (rzędu 3 mW).</li>
	<li>Przesuń próbkę za pomocą zmotoryzowanego translatora, aby oświetlić wewnętrzną płaszczyznę tkanki.</li>
	<li>Włącz oprogramowanie do przetwarzania obrazu (HCImageLive) i ustaw wyzwalacz kamery w trybie zewnętrznym (arkusz świetlny), aby sterować wyzwalaczem akwizycji kamery przez niestandardowe oprogramowanie sterujące całą konfiguracją.</li>
	<li>Włącz opcję Autozapis w panelu Ustawienia skanowania i ustaw folder wyjściowy, w którym mają zostać zapisane obrazy.</li>
	<li>Ręcznie dostosuj pozycję próbki w płaszczyźnie XY za pomocą translatorów liniowych, aby przesunąć próbkę do środka pola widzenia czujnika kamery.</li>
	<li>Przesuń próbkę wzdłuż osi Z za pomocą liniowego translatora z napędem, aby zidentyfikować granice serca do rekonstrukcji tomograficznej.</li>
	<li>Zwiększ moc lasera do ~20 mW, gotowy do sesji obrazowania.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję tomograficzną, kliknij przycisk Start w panelu sekwencji oprogramowania do obrazowania, a jednocześnie przesuwaj próbkę wzdłuż osi Z ze stałą prędkością 6 μm/s za pomocą zmotoryzowanego translatora.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

Nic do ujawnienia.

W tej pracy wprowadzono skuteczne podejście do czyszczenia, barwienia i obrazowania całego serca myszy w wysokiej rozdzielczości. W pierwszej kolejności zoptymalizowano i przeprowadzono protokół transformacji tkankowej (CLARITY), nieznacznie zmodyfikowany pod kątem jego zastosowania w tkance serca. Rzeczywiście, aby uzyskać skuteczną rekonstrukcję w 3D całego serca, konieczne jest zapobieganie zjawisku rozpraszania światła. Metodologia CLARITY pozwala nam uzyskać wysoce przezroczyste nienaruszone serce, ale wymaga długie...

Przebudowa strukturalna związana z chorobami serca może wpływać na przewodnictwo elektryczne i wprowadzać elektromechaniczne dysfunkcje narządu1,2. Obecne podejścia stosowane do przewidywania zmian funkcjonalnych często wykorzystują MRI i DT-MRI w celu uzyskania ogólnej rekonstrukcji odkładania się zwłóknienia, drzewa naczyniowego i rozmieszczenia włókien serca, a także są wykorzystywane do modelowania ścieżek propagacji preferencyjnego potencjału czynnościowego (APP) w całym narządzie3,4. Strategie te mogą zapewnić piękny przegląd organizacji serca. Jednak ich rozdzielczość przestrzenna jest niewystarczająca do zbadania wpływu przebudowy strukturalnej na funkcję serca na poziomie komórkowym.
Umieszczenie tego frameworka w innym rzędzie wielkości, gdzie pojedyncze komórki mogą odgrywać indywidualne role w propagacji potencjału czynnościowego, jest wyzwaniem. Głównym ograniczeniem jest nieskuteczność standardowych metod obrazowania w wykonywaniu obrazowania o wysokiej rozdzielczości (rozdzielczość mikrometryczna) w masywnych (centymetrowych) tkankach. W rzeczywistości obrazowanie tkanek biologicznych w 3D w wysokiej rozdzielczości jest bardzo skomplikowane ze względu na nieprzezroczystość tkanek. Najczęstszym podejściem do wykonywania rekonstrukcji 3D całych organów jest przygotowanie cienkich odcinków. Jednak precyzyjne cięcie, montaż i obrazowanie wymagają znacznego wysiłku i czasu. Alternatywnym podejściem, które nie wymaga cięcia próbki, jest wygenerowanie przezroczystej tkanki. W ciągu ostatnich lat zaproponowano kilka metodologii wyjaśniania tkanek5,6,7,8. Wyzwanie polegające na wyprodukowaniu masywnych, przezroczystych i znakowanych fluorescencyjnie tkanek zostało niedawno osiągnięte dzięki opracowaniu prawdziwych metod transformacji tkanek (CLARITY9, SHIELD10). W szczególności metoda CLARITY opiera się na przekształceniu nienaruszonej tkanki w nanoporowatą, hydrożelowo-hybrydyczną, wolną od lipidów formę, która umożliwia nadanie wysokiej przezroczystości poprzez selektywne usuwanie dwuwarstw lipidowych błony. Warto zauważyć, że metoda ta okazała się skuteczna również w preparatyce kardiologicznej11,12,13,14. Ponieważ jednak serce jest zbyt delikatne, aby nadawało się do aktywnego oczyszczenia, musi zostać oczyszczone przy użyciu podejścia pasywnego, co wymaga dużo czasu, aby zapewnić pełną przejrzystość.
W połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania, takimi jak mikroskopia arkuszowa, CLARITY ma potencjał do obrazowania 3D masywnych tkanek serca w rozdzielczości mikrometrycznej. W mikroskopii arkuszowej oświetlenie próbki odbywa się za pomocą cienkiego arkusza światła zamkniętego w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu detekcji. Emisja fluorescencji jest zbierana wzdłuż osi prostopadłej do płaszczyzny oświetlenia15. Architektura detekcji jest podobna do mikroskopii szerokokątnej, dzięki czemu akwizycja jest znacznie szybsza niż w przypadku laserowych mikroskopów skaningowych. Przesuwanie próbki przez arkusz świetlny pozwala na uzyskanie pełnej tomografii dużych próbek, do centymetrów. Jednak ze względu na wewnętrzne właściwości wiązki Gaussa możliwe jest uzyskanie bardzo cienkiej (rzędu kilku mikronów) warstwy światła tylko przy ograniczonej rozciągłości przestrzennej, co drastycznie ogranicza pole widzenia (FoV). Niedawno wprowadzono nowatorski schemat wzbudzenia, aby przezwyciężyć to ograniczenie i zastosowano go do obrazowania mózgu, umożliwiając rekonstrukcje 3D z rozdzielczością izotropową16.
W tym artykule przedstawiono pasywne podejście do czyszczenia, umożliwiające znaczne skrócenie czasu czyszczenia wymaganego przez protokół CLARITY. Opisane tu ramy metodologiczne pozwalają na rekonstrukcję całego serca myszy z rozdzielczością mikrometryczną w pojedynczym skanie tomograficznym z czasem akwizycji rzędu minut.

<table><tbody><tr><td>2-2' Tiodiethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td> AV-044 <td></td></tr><tr><td>Inicjator</td><td>Wako Chemicals</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca Flash 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie kamery</td><td>Hamamatsu</td><td>HC Image</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka kolimacyjna</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Ramię detekcyjne</td><td>Zintegrowana optyka</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka wzbudzająca</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave; kuweta kwarcowa portmann</td><td>Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Lustra składane</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Lustro galwanometryczne</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzna kuweta kwarcowa</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Źródło laserowe</td><td>Zintegrowane optyki</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa magnetyczna</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany przekładnik</td><td>Instrument Physisk</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforu fosforanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka przekaźnikowa</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka tubusu</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Przestrajalna soczewka</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Woda wanna</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Zarówno genetyczne, jak i niegenetyczne choroby serca mogą powodować poważne procesy przebudowy serca. Przebudowa strukturalna, taka jak odkładanie się kolagenu (zwłóknienie) i niewspółosiowość komórek, może wpływać na przewodnictwo elektryczne, wprowadzać dysfunkcje elektromechaniczne i ostatecznie prowadzić do arytmii. Obecne modele predykcyjne tych zmian funkcjonalnych opierają się na niezintegrowanych informacjach strukturalnych o niskiej rozdzielczości. Umieszczenie tych ram w innym rzędzie wielkości jest trudne ze względu na nieskuteczność standardowych metod obrazowania w wykonywaniu obrazowania w wysokiej rozdzielczości w masywnych tkankach. W niniejszej pracy opisano ramy metodologiczne, które umożliwiają obrazowanie całych serc myszy z rozdzielczością mikrometryczną. Osiągnięcie tego celu wymagało wysiłku technologicznego, w ramach którego połączono postępy w metodach transformacji tkanek i obrazowania. Po pierwsze, opisujemy zoptymalizowany protokół CLARITY zdolny do przekształcenia nienaruszonego serca w nanoporowatą, hydrożelowo-hybrydyczną, wolną od lipidów formę, która umożliwia wysoką przezroczystość i głębokie barwienie. Następnie opisano fluorescencyjny mikroskop arkuszowy zdolny do szybkiego pozyskiwania obrazów mezoskopowego pola widzenia (w skali mm) z rozdzielczością w skali mikronowej. W ślad za projektem mesoSPIM, opracowany mikroskop pozwala na rekonstrukcję całego serca myszy z rozdzielczością mikrometryczną w jednym skanie tomograficznym. Wierzymy, że te ramy metodologiczne pozwolą wyjaśnić udział chaosu cytoarchitektury w dysfunkcjach elektrycznych i utorują drogę do kompleksowego modelu, który uwzględnia zarówno dane funkcjonalne, jak i strukturalne, umożliwiając w ten sposób ujednolicone badanie przyczyn strukturalnych, które prowadzą do zmian elektrycznych i mechanicznych po przebudowie tkanki.

Opracowany układ pasywnego klarowania umożliwia uzyskanie sklarowanego serca dorosłej myszy (o wymiarach rzędu 10 mm x 6 mm x 6 mm) w ciągu około 3 miesięcy. Wszystkie komponenty układu są zamontowane zgodnie z Rysunkiem 1. Pomijalny gradient temperatury między poszczególnymi komorami klarującymi (rzędu 3°C) pozwala na utrzymanie temperatury w odpowiednim zakresie we wszystkich komorach.
<img alt="Schemat utrwalania i przejrzystośc...

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Metodologia ta łączy w sobie doskonalenie protokołu clearingu z możliwościami optycznego przekroju oka w technologii Mesos PIM, co pozwala na wykonanie rekonstrukcji mezoskopowych w rozdzielczości mikrometrycznej. Daje możliwość obrazowania masywnych tkanek serca lub całych serc myszy w całym roztworze podczas jednego skanowania bez utraty oryginalnej trójwymiarowej organizacji tkanek. Po kaniulacji serca za pomocą proksymalnej aorty, przemyciu w roztworze tyro i utrwaleniu w 4% aldehydzie Paraform w 0,01 molowym PBS, jest ono gotowe do rozpoczęcia protokołu oczyszczania.Umyj serce trzy razy w 0,01 molowym PBS w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Po tym etapie serce może być przechowywane w PBS i 0,01% azydku sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Inkubować serce w 20 mililitrach roztworu hydrożelu w stanie wstrząsania przy 15 obr./min przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odgazuj próbkę w temperaturze pokojowej za pomocą osuszacza, pompy próżniowej i systemu rur, który łączy suszarkę zarówno z pasmem pompy, jak i rurociągiem azotu. Umieścić próbkę w suszarce i otworzyć fiolkę, trzymając na niej nakrętkę. Zamknij osuszacz i usuń tlen z rurki, otwierając rurociąg azotu.Włącz pompę próżniową, aby usunąć tlen z suszarki na 10 minut. Wyłącz pompę i otwórz pokrętło osuszacza do rurociągu azotu. Następnie otwórz kurek z azotem.Gdy ciśnienie zrówna się ciśnieniu atmosferycznemu, ostrożnie otwórz suszarkę i szybko zamknij fiolkę. Trzymaj serce w odgazowanym roztworze hydrożelu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około trzy godziny w spoczynku. Gdy hydrożel jest prawidłowo spolimeryzowany i wydaje się całkowicie galaretowaty, ostrożnie wyjmij z niego serce i umieść je w roztworze czyszczącym w fiolce z roztworem czyszczącym.Roztwór czyszczący w fiolce należy zmieniać raz na trzy dni, aby przyspieszyć procedurę klarowania. Gdy serce wydaje się całkowicie oczyszczone, wyjmij je z fiolki i umyj w 50 mililitrach podgrzanego PBS przez 24 godziny w stanie wstrząsania. Umyć ponownie w 50 mililitrach jednego X PBS T przez 24 godziny w stanie wstrząsania.Inkubować próbkę w 0,01 miligrama na mililitr aglutyniny z kiełków pszenicy Alexa 633 w trzech mililitrach jednego X PBS T w stanie wstrząsania przy 50 obr./min w temperaturze pokojowej przez siedem dni. Po siedmiodniowej inkubacji przemyć próbkę w 50 mililitrach jednego X PBS T w temperaturze pokojowej w wstrząsaniu przez 24 godziny. Próbkę inkubować w 4% PFA przez 15 minut, a następnie przemywać ją trzykrotnie w 0,01 molowym PBS przez pięć minut każdy.Inkubuj serce kolejno w 20 i 47% TDE w 0,01 molowym PBS przez osiem godzin każdy. A potem w końcu przy 68% TDE w 0,01 molowym PBS, aby zapewnić wymagany współczynnik załamania światła 1,46. Delikatnie wypełnij około 80% zewnętrznego kwitu kwarcowego ośrodkiem o współczynniku załamania światła.Napełnij wewnętrzny kwit kwarcowy tym samym ośrodkiem o współczynniku załamania światła. Zanurz próbkę w wewnętrznym kołku. Delikatnie przesuń próbkę na dno kołka za pomocą cienkiej pęsety i ułóż serce tak, aby jego oś podłużna była równoległa do głównej osi kołka, aby zminimalizować drogę światła wzbudzającego przez tkankę podczas skanowania.Ostrożnie przymocuj dopasowaną zaślepkę nad wewnętrznym kołdrem za pomocą dwóch. Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu za pomocą magnesów. Przełóż pionowy stolik na próbkę ręcznie, aby zanurzyć wewnętrzny stolik w zewnętrznym.Włącz wzbudzenie źródła światła o długości fali 638 nanometrów i ustaw je na niską moc rzędu trzech miliwatów. Przesuń próbkę za pomocą zmotoryzowanego translatora, aby oświetlić wewnętrzną płytkę tkanki. Włącz oprogramowanie kamery HC do transmisji na żywo z obrazem i ustaw wyzwalacz kamery w trybie arkusza świetlnego wyzwalacza krawędzi zewnętrznej, aby sterować wyzwalaczem akwizycji kamery przez niestandardowe oprogramowanie sterujące całą konfiguracją.Włącz automatyczne zapisywanie w oprogramowaniu aparatu i ustaw folder wyjściowy, w którym mają zostać zapisane obrazy. Ręcznie dostosuj pozycję próbki w płaszczyźnie XY za pomocą translatorów liniowych, aby przesunąć próbkę do środka pola view czujnika kamery. Przesuń próbkę wzdłuż osi Z za pomocą liniowego translatora z napędem, aby zidentyfikować granice serca do rekonstrukcji tomograficznej.Zwiększ moc lasera do około 20 miliwatów przed rozpoczęciem sesji obrazowania. Akwizycję tomograficzną należy rozpocząć od kliknięcia przycisku start w panelu przechwytywania oprogramowania do obrazowania, a jednocześnie rozpocząć przesuwanie próbki wzdłuż osi Z ze stałą prędkością sześciu mikrometrów na sekundę za pomocą zmotoryzowanego translatora. Połączenie metodologii klarowności z TDE jako ośrodkiem indeksu refrakcji nie zmienia znacząco końcowej objętości próbki ani nie prowadzi do izotropowej deformacji próbki.Optyka wzbudzająca wytworzyła arkusz świetlny o minimalnym marnotrawstwie około sześciu mikrometrów, który rozchodził się do 175 mikrometrów na krawędzi pola widzenia. Synchronizacja migawki kamery z osiowym skanowaniem odpadu arkusza świetlnego zapewniła zebranie sygnału emisyjnego tylko w części próbki wzbudzonej odpadem arkusza świetlnego, co dało średnią F, W, H M wynoszącą około 6,7 mikrometra w całym polu widzenia. Funkcja rozproszenia punktu Z w mikroskopie została również oszacowana za pomocą tomograficznej rekonstrukcji nanosfery fluorescencyjnej, a F W H M wynosząca 6,4 mikrometra została oszacowana przez dopasowanie.Potwierdzono również zdolność systemu do rozdzielania pojedynczych błon komórkowych w trzech wymiarach przy wystarczającym stosunku sygnału do szumu w całym narządzie. Procedura odgazowania jest najbardziej krytycznym etapem protokołu. Jeśli nie zostanie prawidłowo wykonana, tkanka może ulec uszkodzeniom wskazującym na inkubację w roztworze czyszczącym.Prezentowany protokół może być łączony z protokołem wielokrotnego barwienia w celu uzyskania rekonstrukcji całego narządu integrującej różne struktury biologiczne i może być stosowany do badania modeli patologicznych.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokoczęstotliwościowe ultradźwięki Dopplera to nowatorska technologia służąca do oceny regionalnej funkcji mięśnia sercowego. Niniejsza praca przedstawia pierwsze dowody wykazujące przydatność tej wszechstronnej platformy obrazowania do wielokrotnego pomiaru odkształcenia mięśnia sercowego, dp/dt oraz niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji (IR) serca mysiego.

Wysokoczęstotliwościowa echokardiografia o wysokiej rozdzielczości: pierwsze dowody na nieinwazyjny, powtarzalny pomiar odkształcenia mięśnia sercowego, kurczliwości i niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji serca myszy

W niniejszym filmie zaprezentowano zastosowanie zamontowanej na szynie głowicy ultradźwiękowej o wysokiej częstotliwości do wykonywania echokardiografii u znieczulonej myszy. Metody obejmują zarówno konwencjonalne pomiary funkcji serca w trybie dwuwymiarowym i M-mode, jak i nowsze, bardziej zaawansowane narzędzia, takie jak kolorowy Doppler, analiza odkształceń (strain) oraz ogólne i ukierunkowane obrazowanie kontrastowe.

Echokardiografia i obrazowanie ultrasonograficzne u myszy

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

To badanie pokazuje udane wprowadzenie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego jako nieinwazyjnego narzędzia do oceny nieprawidłowości serca u myszy dotkniętych autoimmunologicznym zapaleniem mięśnia sercowego.  Dane wskazują, że technika ta może być stosowana do monitorowania postępu choroby u żywych zwierząt.

Nieinwazyjna ocena nieprawidłowości serca w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mięśnia sercowego za pomocą obrazowania za pomocą rezonansu magnetycznego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania w czterowymiarowym obrazowaniu ultrasonograficznym in vivo i obrazowaniu spektrometrii mas ex vivo do oceny biomechanicznych i biomolekularnych zmian w mysim układzie sercowo-naczyniowym. Technika ta jest stosowana do analizy przebudowy serca w chirurgicznie wywołanym zawale mięśnia sercowego i zmianach naczyniowych u starzejących się zwierząt.

Multimodalne badanie przebudowy układu sercowo-naczyniowego u myszy: czterowymiarowe obrazowanie ultrasonograficzne i spektrometria mas

Poznaj metodę mezoskopowego obrazowania całego serca myszy z zachowaniem trójwymiarowej organizacji tkanek. Technika łączy protokół przezroczystości z mikroskopią light-sheet, umożliwiając rekonstrukcję z rozdzielczością mikrometryczną.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Przeglądaj więcej filmów