Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Metodologia ta łączy w sobie doskonalenie protokołu clearingu z możliwościami optycznego przekroju oka w technologii Mesos PIM, co pozwala na wykonanie rekonstrukcji mezoskopowych w rozdzielczości mikrometrycznej. Daje możliwość obrazowania masywnych tkanek serca lub całych serc myszy w całym roztworze podczas jednego skanowania bez utraty oryginalnej trójwymiarowej organizacji tkanek. Po kaniulacji serca za pomocą proksymalnej aorty, przemyciu w roztworze tyro i utrwaleniu w 4% aldehydzie Paraform w 0,01 molowym PBS, jest ono gotowe do rozpoczęcia protokołu oczyszczania.

Umyj serce trzy razy w 0,01 molowym PBS w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Po tym etapie serce może być przechowywane w PBS i 0,01% azydku sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka miesięcy. Inkubować serce w 20 mililitrach roztworu hydrożelu w stanie wstrząsania przy 15 obr./min przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odgazuj próbkę w temperaturze pokojowej za pomocą osuszacza, pompy próżniowej i systemu rur, który łączy suszarkę zarówno z pasmem pompy, jak i rurociągiem azotu. Umieścić próbkę w suszarce i otworzyć fiolkę, trzymając na niej nakrętkę. Zamknij osuszacz i usuń tlen z rurki, otwierając rurociąg azotu.

Włącz pompę próżniową, aby usunąć tlen z suszarki na 10 minut. Wyłącz pompę i otwórz pokrętło osuszacza do rurociągu azotu. Następnie otwórz kurek z azotem.

Gdy ciśnienie zrówna się ciśnieniu atmosferycznemu, ostrożnie otwórz suszarkę i szybko zamknij fiolkę. Trzymaj serce w odgazowanym roztworze hydrożelu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około trzy godziny w spoczynku. Gdy hydrożel jest prawidłowo spolimeryzowany i wydaje się całkowicie galaretowaty, ostrożnie wyjmij z niego serce i umieść je w roztworze czyszczącym w fiolce z roztworem czyszczącym.

Roztwór czyszczący w fiolce należy zmieniać raz na trzy dni, aby przyspieszyć procedurę klarowania. Gdy serce wydaje się całkowicie oczyszczone, wyjmij je z fiolki i umyj w 50 mililitrach podgrzanego PBS przez 24 godziny w stanie wstrząsania. Umyć ponownie w 50 mililitrach jednego X PBS T przez 24 godziny w stanie wstrząsania.

Inkubować próbkę w 0,01 miligrama na mililitr aglutyniny z kiełków pszenicy Alexa 633 w trzech mililitrach jednego X PBS T w stanie wstrząsania przy 50 obr./min w temperaturze pokojowej przez siedem dni. Po siedmiodniowej inkubacji przemyć próbkę w 50 mililitrach jednego X PBS T w temperaturze pokojowej w wstrząsaniu przez 24 godziny. Próbkę inkubować w 4% PFA przez 15 minut, a następnie przemywać ją trzykrotnie w 0,01 molowym PBS przez pięć minut każdy.

Inkubuj serce kolejno w 20 i 47% TDE w 0,01 molowym PBS przez osiem godzin każdy. A potem w końcu przy 68% TDE w 0,01 molowym PBS, aby zapewnić wymagany współczynnik załamania światła 1,46. Delikatnie wypełnij około 80% zewnętrznego kwitu kwarcowego ośrodkiem o współczynniku załamania światła.

Napełnij wewnętrzny kwit kwarcowy tym samym ośrodkiem o współczynniku załamania światła. Zanurz próbkę w wewnętrznym kołku. Delikatnie przesuń próbkę na dno kołka za pomocą cienkiej pęsety i ułóż serce tak, aby jego oś podłużna była równoległa do głównej osi kołka, aby zminimalizować drogę światła wzbudzającego przez tkankę podczas skanowania.

Ostrożnie przymocuj dopasowaną zaślepkę nad wewnętrznym kołdrem za pomocą dwóch. Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu za pomocą magnesów. Przełóż pionowy stolik na próbkę ręcznie, aby zanurzyć wewnętrzny stolik w zewnętrznym

Włącz wzbudzenie źródła światła o długości fali 638 nanometrów i ustaw je na niską moc rzędu trzech miliwatów. Przesuń próbkę za pomocą zmotoryzowanego translatora, aby oświetlić wewnętrzną płytkę tkanki. Włącz oprogramowanie kamery HC do transmisji na żywo z obrazem i ustaw wyzwalacz kamery w trybie arkusza świetlnego wyzwalacza krawędzi zewnętrznej, aby sterować wyzwalaczem akwizycji kamery przez niestandardowe oprogramowanie sterujące całą konfiguracją.

Włącz automatyczne zapisywanie w oprogramowaniu aparatu i ustaw folder wyjściowy, w którym mają zostać zapisane obrazy. Ręcznie dostosuj pozycję próbki w płaszczyźnie XY za pomocą translatorów liniowych, aby przesunąć próbkę do środka pola view czujnika kamery. Przesuń próbkę wzdłuż osi Z za pomocą liniowego translatora z napędem, aby zidentyfikować granice serca do rekonstrukcji tomograficznej.

Zwiększ moc lasera do około 20 miliwatów przed rozpoczęciem sesji obrazowania. Akwizycję tomograficzną należy rozpocząć od kliknięcia przycisku start w panelu przechwytywania oprogramowania do obrazowania, a jednocześnie rozpocząć przesuwanie próbki wzdłuż osi Z ze stałą prędkością sześciu mikrometrów na sekundę za pomocą zmotoryzowanego translatora. Połączenie metodologii klarowności z TDE jako ośrodkiem indeksu refrakcji nie zmienia znacząco końcowej objętości próbki ani nie prowadzi do izotropowej deformacji próbki.

Optyka wzbudzająca wytworzyła arkusz świetlny o minimalnym marnotrawstwie około sześciu mikrometrów, który rozchodził się do 175 mikrometrów na krawędzi pola widzenia. Synchronizacja migawki kamery z osiowym skanowaniem odpadu arkusza świetlnego zapewniła zebranie sygnału emisyjnego tylko w części próbki wzbudzonej odpadem arkusza świetlnego, co dało średnią F, W, H M wynoszącą około 6,7 mikrometra w całym polu widzenia. Funkcja rozproszenia punktu Z w mikroskopie została również oszacowana za pomocą tomograficznej rekonstrukcji nanosfery fluorescencyjnej, a F W H M wynosząca 6,4 mikrometra została oszacowana przez dopasowanie.

Potwierdzono również zdolność systemu do rozdzielania pojedynczych błon komórkowych w trzech wymiarach przy wystarczającym stosunku sygnału do szumu w całym narządzie. Procedura odgazowania jest najbardziej krytycznym etapem protokołu. Jeśli nie zostanie prawidłowo wykonana, tkanka może ulec uszkodzeniom wskazującym na inkubację w roztworze czyszczącym.

Prezentowany protokół może być łączony z protokołem wielokrotnego barwienia w celu uzyskania rekonstrukcji całego narządu integrującej różne struktury biologiczne i może być stosowany do badania modeli patologicznych.