Name: Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego obrazowania w jasnym polu, fluorescencji i tomografii koherentnej kurczących się beleczek serca szczura. Ta technika umożliwia pomiar funkcji mechanicznej, dynamiki jonowej i zmian geometrycznych tkanki sercowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane ze stypendiów doktoranckich Uniwersytetu w Auckland (przyznanych JD i MC), stypendiów Sir Charlesa Hercusa na badania nad zdrowiem (20/011 i 21/116) od Rady Badań nad Zdrowiem Nowej Zelandii (przyznanych odpowiednio J-CH do KT), stypendium doktoranckiego przyznanego przez National Heart Foundation (przyznanego AA), grantów Marsden Fast-Start (UOA1504 i UOA1703) od Royal Society of New Zealand (przyznanych J-CH i KT), oraz stypendium Jamesa Cooka z Royal Society of New Zealand (przyznane AT). Pierwotne opracowanie tego instrumentu zostało sfinansowane z grantu Marsdena (11-UOA-199) z Royal Society of New Zealand (przyznanego AT i PN).

<ol><li>Han, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+stress+production+in+isolated+cardiac+trabeculae+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat.</a> American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).</li>
<li>Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li>
<li>Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+SR+load+and+pH+regulatory+mechanisms+on+stretch-dependent+Ca2%2B+entry+during+the+slow+force+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).</li>
<li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+force+response+to+stretch%3A+Controversy+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The slow force response to stretch: Controversy and contradictions.</a> Acta Physiologica. 226 (1), 13250(2019).</li>
<li>Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diastolic+viscoelastic+properties+of+rat+cardiac+muscle%3B+involvement+of+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).</li>
<li>Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+displacement+in+isolated+heart+muscle+cells+using+markerless+subpixel+image+registration%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+Record+-+IEEE+International+Instrumentation+and+Measurement+Technology+Conference%22%5BJournal%5D)">Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration.</a> Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+markerless+tracking+of+the+strain+distribution+of+actively+contracting+cardiac+muscle+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations.</a> Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+compensation+in+Fourier+domain+optical+coherence+tomography+using+the+fractional+Fourier+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform.</a> Optics Express. 20 (21), 23398(2012).</li>
<li>Cheuk, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-Dimensional+imaging+of+cardiac+trabeculae+contracting+in+vitro+using+gated+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).</li>
<li>Ritland, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+refractive+index+and+density+of+a+glass+at+constant+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Ceramic+Society%22%5BJournal%5D)">Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature.</a> Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).</li>
<li>Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+glucose+and+glycerol+diffusion+in+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).</li>
<li>Taberner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamometer+for+nature%27s+engines%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Instrumentation+and+Measurement+Magazine%22%5BJournal%5D)">A dynamometer for nature's engines.</a> IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trainable+Weka+Segmentation%3A+A+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., Julian, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacing+rate%2C+halothane%2C+and+BDM+affect+fura+2+reporting+of+%5BCa2%2B%5D%28i%29+in+intact+rat+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).</li>
<li>Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+waves+during+triggered+propagated+contractions+in+intact+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).</li>
<li>Han, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radius-dependent+decline+of+performance+in+isolated+cardiac+muscle+does+not+reflect+inadequacy+of+diffusive+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu przedstawiamy konfigurację, która umożliwia montaż trzech układów optycznych łączących obrazowanie jasnego pola, fluorescencji i OCT w celu zebrania danych z aktywnie kurczącej się bełeczki serca ex vivo (ryc. 1 i ryc. 2). Tak zaaranżowana integracja jest możliwa dzięki konstrukcji komory pomiarowej (rysunek 3), która umożliwia ortogonalne ułożenie OCT do osi jasne pole-fluorescencja. System mocowania mięśni odgrywa równie ważną rolę w powodzeniu jednoczesnych kwantyfikacji kluczowych wskaźników w charakterystyce dynamiki pobudzenia i skurczu mięśnia sercowego. Jego nowość polega na tym, że umożliwia procedury skanowania mięśni bez widocznych zakłóceń mechanicznej wydajności mięśnia (ryc. 6). Dzięki połączonej konfiguracji obrazowania i zmotoryzowanemu systemowi hakowemu do pomiaru siły, system ten może oceniać regionalną niejednorodność w stanach przejściowych Ca2+ , przemieszczeniu i długości sarkomeru, wraz z makroskopowymi informacjami geometrycznymi kurczącej się beleczki w całym przebiegu drgań (ryc. 7 i ryc. 8).
Biorąc pod uwagę wszechobecność systemów obrazowania w jasnym polu i epifluorescencji w laboratoriach badań kardiologicznych, odtworzenie tych wyników można osiągnąć przy niewielkich względach sprzętowych. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu do łączenia epifluorescencji jasnego pola i OCT, który jest niezbędny do analizy leżącej u podstaw niejednorodności skurczowej. Integracja OCT wymaga niezakłóconej ścieżki optycznej, podczas gdy obrazowanie bramkowane wymaga zewnętrznej linii wyzwalania między bodźcem a zarówno OCT, jak i kamerą do obrazowania w jasnym polu oraz haków mocujących mięśnie, które są w stanie przesuwać próbkę w całej komorze pomiarowej. Wymagane oprogramowanie i metody przetwarzania końcowego są swobodnie dostępne. W szczególności zastosowane oprogramowanie do segmentacji, WEKA14, jest open-source. Technika bezznacznikowego śledzenia punktów materialnych8, długości sarkomeru, bramkowanego obrazowania wolumetrycznego10 i kodów generowania siatki jest również dostępna i może być udostępniona na żądanie u autora korespondencyjnego.
Żywotność mięśni, optymalne obciążenie Fura-2 i skupienie obrazu to trzy filary, które tworzą fundamenty udanego eksperymentu. Stosowanie roztworu preparacyjnego zawierającego BDM w celu zapobiegania przykurczom, transport mięśnia w strzykawce, ciągłe natlenianie roztworu i przygotowywanie nowych roztworów eksperymentalnych w dniu eksperymentu przyczynia się do wysokiego wskaźnika żywotności mięśni. Przed załadowaniem beleczka Fura-2AM należy pobrać autofluorescencję dla każdego stanu, który jest zainteresowany badaniem, ponieważ może to mieć znaczący wpływ na zmierzony stan przejściowy Ca2 + 15. Natlenienie roztworu ładującego Fura-2AM jest skomplikowane ze względu na niezbędne włączenie środka powierzchniowo czynnego pluronic-F127 w celu ułatwienia ładowania barwnika. Aby zwalczyć powstające w ten sposób nadmierne tworzenie się pęcherzyków spowodowane przez ten środek powierzchniowo czynny, niewielka kropla środka przeciwpieniącego w roztworze ładującym pozwala użytkownikowi zwiększyć szybkość natleniania, zwiększając w ten sposób szansę na utrzymanie żywotności funkcjonalnej przez cały proces ładowania. Wreszcie, ostrość obrazowania musi być jednolita na całej długości mięśni, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu w jasnym polu i informacji fluorescencyjnej.
Istnieją dwa ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę w przypadku przedstawionych tutaj metod. Pierwszą z nich jest rozdzielczość przestrzenna mikroskopu fluorescencyjnego. Podczas gdy rozdzielczości przestrzenne obrazowania OCT i jasnego pola są wysokie, rozdzielczość mikroskopu fluorescencyjnego jest ograniczona do całki fluorescencji z objętości uchwyconej w oknie obrazowania 540 μm na 540 μm. Istnieje możliwość zwiększenia rozdzielczości przestrzennej mikroskopu fluorescencyjnego poprzez zastosowanie kamery ze sprzężeniem ładunkowym o wysokim wzmocnieniu, zamiast PMT, do przechwytywania sygnału fluorescencji kosztem stosunku sygnału do szumu16. Druga to średnica beleczka, którą można badać pod kątem mierzalnej długości sarkomeru i głębokości geometrycznej. Podejście FFT w oknie do obliczania długości sarkomeru wykorzystuje korzyści płynące z lepszej rozdzielczości przestrzennej, ale wiąże się ze zmniejszoną odpornością (rysunek 8D). W przypadkach, gdy mają być badane mętne lub duże średnice beleczki, rozdzielczość FFT będzie znacznie zmniejszona ze względu na zmniejszony kontrast związany z pasmami sarkomerycznymi w większych próbkach tkanek. Podobnie, w obrębie KTZ, odbicia wsteczne od głębokości obrazowania większej niż 300 μm będą zbyt słabe, aby można je było rozdzielić na etapie segmentacji. W związku z tym nasza technika ogranicza się do beleczek o średnicy mniejszej niż 300 μm. Nie zaleca się jednak badania próbek o dużej średnicy, ponieważ mogą wystąpić problemy z dyfuzyjnym natlenieniem rdzenia mięśniowego podczas wysokich wskaźników stymulacji17.
Nasza metoda umożliwia ocenę jonowych funkcji mechanicznych w połączeniu z geometrią mięśni w zdrowych i chorych mięśniach, zapewniając potężne podejście do zrozumienia fizjologii, patofizjologii i farmakologii mięśnia sercowego. Przedstawiony tutaj potok przetwarzania obrazu wyodrębnia dane, które będą miały kluczowe znaczenie dla głębszego zrozumienia niejednorodności skurczowej. Jedną ze sposobów na pełne wykorzystanie potencjału tak bogatego zbioru danych jest budowa modeli matematycznych, które integrują i interpretują te dane, a także dokonują przewidywań, które można przetestować eksperymentalnie za pomocą naszego urządzenia.

Superfuzja preparatów izolowanej tkanki mięśnia sercowego jest standardowym i szeroko stosowanym protokołem do badania aktywacji jonów i mechaniki serca1. W szczególności odizolowanie beleczków, pręcikowatych struktur od ścian komór, umożliwiło ocenę takich zjawisk, jak zależna od długości aktywacja skurczu2, zależna od rozciągania reakcja skurczu3,4, oraz rozkurczowa lepkosprężystość5 tkanki serca. Ter Keurs, inicjator tej techniki superfuzji izolowanych beleczków, początkowo używał kombinacji obrazowania fluorescencyjnego do pomiarów Ca2+ i dyfrakcji laserowej do określania długości sarkomeru 2,5. Od czasu tych wczesnych badań coraz powszechniejsze staje się wyodrębnianie informacji o długości sarkomeru z większą rozdzielczością przestrzenną przy użyciu technik opartych na szybkiej transformacji Fouriera 2D (FFT)6 na obrazach mikroskopowych w jasnym polu. Dwa systemy obrazowania pozwalają na częściową ocenę podstawowej zależności między uwalnianiem Ca2+ a wytwarzaniem siły zależnej od długości sarkomeru.
Mięsień sercowy jest prążkowany, z widocznym pasmem związanym z leżącą pod spodem serią jednostek kurczliwych składających się z grubych i grubych włókien. Interakcja tych włókien składowych, które tworzą sarkomery, leży u podstaw generowania siły, które rozpoczyna się w następujący sposób: depolaryzujący sygnał elektryczny lub potencjał czynnościowy powoduje otwarcie zależnych od napięcia kanałów Ca2+ typu L w błonie komórkowej; wynikający z tego napływ komórkowy Ca2 + indukuje uwalnianie Ca2 + z retikulum sarkoplazmatycznego (SR), wewnątrzkomórkowego magazynu Ca2 +, w procesie znanym jako uwolnienie Ca2 + indukowane przez Ca2 + 7; ten nagły wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ z zakresu nanomolowego do mikromolowego umożliwia wytwarzanie siły; Pompy Ca2 + w sposób ciągły wytłaczają Ca2 + z cytozolu z powrotem do SR i przedziału zewnątrzkomórkowego; gdy wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ powraca do zakresu nanomolowego, produkcja siły ustaje, a mięsień rozluźnia się. Podczas wytwarzania siły grube i cienkie włókna składowe przesuwają się po sobie. Długość sarkomeru dyktuje względny zakres nakładania się, a tym samym potencjał makroskopowego wytwarzania siły przez mięsień.
W tym artykule rozszerzamy te techniki obrazowania fluorescencyjno-jasnego pola o optyczną tomografię koherentną (OCT). OCT wykorzystuje fizyczną zasadę interferencji i jest w stanie uchwycić geometryczną deformację tkanki, aby zrozumieć niejednorodność kurczliwości mięśni8. Nasze urządzenie (Rysunek 1) wykorzystuje system OCT (SD-OCT) w domenie spektralnej. W SD-OCT rozdzielacz wiązki rozdziela światło z szerokopasmowej diody superluminescencyjnej o krótkiej koherencji na ramiona referencyjne i pomiarowe. Ramię referencyjne zawiera stałe lustro, a ramię pomiarowe zawiera galwanometr 2D do sterowania światłem. Światło wstecznie rozproszone z próbki jest zbierane i interferuje ze światłem odbitym w ramieniu odniesienia, tworząc wzór interferencyjny. Informacja o głębokości jest zakodowana w częstotliwości prążka widmowego. Aby wydobyć informacje, sygnał jest przepuszczany przez spektrometr, a do wyniku stosuje się odwrotny FFT. Odpowiedni sygnał 1D reprezentuje struktury na różnych głębokościach, co odpowiada zmianom indeksu załamania światła9 (A-scan). Sterując laserem w jednej osi, można skonstruować przekrój poprzeczny interesującej nas próbki (B-scan) i podobnie, powtarzając proces w sposób krokowy w pozostałej osi, można wygenerować trójwymiarowy obraz (C-scan). Co za tym idzie, można zebrać serię skanów B w jednym wycinku dla powtarzającego się obiektu zmieniającego się w czasie na podstawie zewnętrznego wyzwalacza i powtórzyć, aby wygenerować skan trójwymiarowy, reprezentujący zmienny w czasie obraz płaski10.
Integrując trzy systemy obrazowania, wzięliśmy pod uwagę następujące dwie zasady. Po pierwsze, czujniki obrazowania nie powinny wykrywać światła z alternatywnej metody obrazowania, a po drugie, fizyczna konstrukcja powinna zawierać wolną przestrzeń dla co najmniej trzech jednoczesnych płaszczyzn obrazowania. Aby spełnić pierwsze wymaganie, mikroskop jasnego pola wykorzystuje diodę LED o długości fali 660 nm do oświetlania próbki w konfiguracji odwróconej. Mikroskop fluorescencyjny jest w konfiguracji epifluorescencyjnej, w której ta sama soczewka obiektywowa jest używana zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emitowanego światła. Światło wzbudzenia ma długość fali od 340 nm do 380 nm, a lampa fotopowielacza (PMT) mierzy emitowane światło o długości fali 510 nm. Para zwierciadeł dichroicznych umożliwia tym dwóm ścieżkom optycznym dzielenie tego samego śladu fizycznego bez zakłócania przeciwnego pomiaru (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Wreszcie, OCT wykorzystuje światło szerokopasmowe (szerokość widmowa 100 nm) o centralnej długości fali 840 nm, w odróżnieniu od pozostałych dwóch modalności. Ze względu na niską koherencję światła używanego w OCT, jakiekolwiek rozproszone światło ze źródeł fluorescencji w jasnym polu nie przyczyni się do wzorca interferencji, który koduje informacje o głębokości. W przypadku drugiego wymagania konstrukcja obudowy rurki kapilarnej ma dostępne ścieżki optyczne do przedniej, dolnej i górnej płaszczyzny próbki. Podczas eksperymentów dwa platynowe haczyki utrzymują beleczkę w kapilarnej rurki wypełnionej natlenionym roztworem Krebsa-Henseleita (KH). Głowica galwanometru OCT jest zorientowana prostopadle do ścieżki obrazowania fluorescencji w jasnym polu, aby wykorzystać trzecią ortogonalną płaszczyznę optyczną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).
Ten artykuł przedstawia założenia projektowe dotyczące budowy urządzenia zdolnego do jednoczesnego obrazowania wapnia, długości sarkomeru i geometrii mięśni. Aby zademonstrować te możliwości pomiarowe, opisujemy proces izolowania beleczki komorowej, przygotowanie niezbędnych roztworów buforowych, wraz z krytycznymi etapami związanymi z obsługą i ładowaniem fluorescencyjnym beleczki ex vivo. Na koniec w tym dokumencie przedstawiono procesy wymagane do przekształcenia zestawu danych w bardziej użyteczne wizualizacje.

<table><tbody><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu</td><td>Acros Organics</td><td>150375000</td><td></td></tr><tr><td>20 razy; soczewka mikroskopu</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20 razy;</td><td>NA 0.75</td></tr><tr><td>Galwanometr 2D</td><td>Thorlabs</td><td>GVSM002/M</td><td></td></tr><tr><td>50-50 rozdzielacz wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>FC850-40-50-APC</td><td></td></tr><tr><td>90-10 rozdzielacz wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R2A2</td><td></td></tr><tr><td>Moduł wejść analogowych</td><td>National Instruments</td><td>NI-9205</td><td>Rejestruje sygnał PMT przy 200 kHz</td></tr><tr><td>Źródło światła do obrazowania w jasnym polu</td><td>CoolLED</td><td>PE-2</td><td>660&nbsp; nm</td></tr><tr><td>LAM Szerokopasmowe źródło światła</td><td>Superlum</td><td>Broadlighter-840</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Karta Cameralink</td><td>National</td><td>Instruments NI-1429</td><td>Chwytak ramki do obrazowania w jasnym polu</td></tr><tr><td>Carbogen 5</td><td>BOC</td><td>Kod gazu: 181</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka kondensora</td><td>Nikon</td><td>LWD 0.52</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI-6259</td><td>Wyzwala ruch galwanometru</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 1</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 2</td><td>Semrock</td><td>FF552-Di02</td><td></td></tr><tr><td>Siatka dyfrakcyjna</td><td>Wasatch Photonics</td><td>1200 linii/mm @840 nm</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Q 3 UV System</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRQSVR3WW</td><td>Maszyna do wody destylowanej</td></tr><tr><td>Sucha kąpiel</td><td>Corning</td><td>6875-SB</td><td>LSE cyfrowa sucha kąpiel</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu o otwartym kodzie</td></tr><tr><td>źródłowym Fura-2AM sól pentapotasowa</td><td>Thermofisher</td><td>F14186</td><td></td></tr><tr><td>Sprzętowa karta FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-7813R</td><td>Kontroluje również wyzwalanie wychwytywania jasnego pola</td></tr><tr><td>Heparyna Pfizer</td><td></td><td>61024</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>TI-DH Słup</td><td></td>oświetleniowy</tr><tr><td>Izofluoran</td><td>MedSource</td><td>VAPDRUGISO250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Kamera liniowa</td><td>Basler</td><td>spL2048-70km</td><td>Kamera spektrometryczna</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td>RCT basic</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Kod przetwarzania danych</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Karta FPGA OCT</td><td>National Instruments</td><td>NI-1483R</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik tlenu</td><td>BOC</td><td>Kod gazu: pH-metr 100D</td><td></td></tr><tr>Lampa<td>fotopowielacza</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>H7422-20</td><td></td></tr><tr><td>Powerload</td><td>Thermofisher</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Dioda superluminescencyjna</td><td>Broadlighter</td><td>D-840</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz transimpedancyjny</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Wistar rat</td><td>Vernon Jansen Jednostka</td><td></td><td>8 &ndash; 10 tygodni</td></tr><tr><td>Lampa ksenonowa łukowa</td><td>Sutter Instrument</td><td>DG-4</td><td>Lambda DG-4</td></tr></tbody></table>

jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

W mięśniu sercowym, wewnątrzkomórkowe stany przejściowe Ca2+ aktywują kurczliwe miofilamenty, powodując skurcze, makroskopowe skrócenie i deformację geometryczną. Nasze zrozumienie wewnętrznych relacji między tymi zdarzeniami jest ograniczone, ponieważ nie możemy ani "zajrzeć" do wnętrza mięśnia, ani precyzyjnie śledzić czasoprzestrzennej natury dynamiki pobudzenia i skurczu. Aby rozwiązać te problemy, skonstruowaliśmy urządzenie, które łączy w sobie zestaw modalności obrazowania. W szczególności integruje mikroskop jasnego pola do pomiaru lokalnych zmian długości sarkomeru i odkształcenia tkanki, mikroskop fluorescencyjny do wizualizacji stanu przejściowego Ca2+ oraz optyczny tomograf koherentny do uchwycenia zmian geometrycznych tkanki w całym przebiegu cyklu sercowego. Przedstawiamy tutaj infrastrukturę obrazowania i związane z nią ramy gromadzenia danych. Dane są zbierane z izolowanych struktur tkankowych przypominających pręciki, znanych jako beleczki carneae. W naszym instrumencie para platynowych haczyków z kontrolowanym położeniem przytrzymuje każdy koniec próbki mięśniowej ex vivo, podczas gdy jest ona w sposób ciągły przepełniana bogatym w składniki odżywcze roztworem soli fizjologicznej. Haki są pod niezależną kontrolą, co pozwala na kontrolę długości i siły mięśni w czasie rzeczywistym. Translacja wzdłużna umożliwia fragmentaryczne skanowanie próbki, pokonując ograniczenia związane ze względną wielkością okienka obrazowania mikroskopu (540 μm na 540 μm) i długością typowej beleczki (>2000 μm). Platynowe elektrody na obu końcach komory mięśniowej stymulują beleczkę w tempie zdefiniowanym przez użytkownika. Wykorzystujemy sygnał stymulacji jako wyzwalacz do synchronizacji danych z każdego okna obrazowania, aby zrekonstruować drganie całej próbki w warunkach stanu ustalonego. Zastosowanie technik przetwarzania obrazu do tych danych obrazowania w jasnym polu zapewnia mapy przemieszczeń tkanek i długości sarkomerów. Taki zbiór danych, po włączeniu do procesu modelowania eksperymentu, zapewni głębsze zrozumienie jednorodności i heterogeniczności skurczów mięśni w fizjologii i patofizjologii.

Aby zarejestrować regionalne informacje o Ca2+ oraz obraz w świetle przechodzącym dla całej długości przedstawionej tutaj beleczki, wymaganych było siedem pozycji mięśnia. Rysunek 6 sugeruje, że siła skurczu pojedynczego nie została zaburzona przez ten ruch, co wykazuje brak zależności produkcji siły aktywnej od pozycji.
Skanowanie B wykonane za pomocą optycznej koherentnej tomografii z częstotliwością 100 Hz zostało poddane segmentacji przy użyciu wtyczki WEKA14 do programu ImageJ (Ryc. 7A). Każdy przekrój poprzeczny wydaje się zniekształcony ze względu na różnicę między rozdzielczością boczną (10 µm) a rozdzielczością w głąb (1,73 µm (w mięśniu sercowym)). Zniekształcenie to zostało skorygowane poprzez przeskalowanie osi głębokości obrazu zgodnie ze stosunkiem rozdzielczości bocznej do rozdzielczości w głąb. Ryc. 7B,C pokazują, że po przeskalowaniu surowy skan C beleczki ma geometrię w przybliżeniu cylindryczną. Odbicie ścianki komory pomiarowej może czasami nakładać się na dane dotyczące mięśnia (Ryc. 7A,B), jednak oprogramowanie do segmentacji można wytrenować tak, aby uwzględniało to zjawisko (Ryc. 7D,E). Po segmentacji można obliczyć pole powierzchni przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia w całym cyklu skurczu (Ryc. 7F). Należy zauważyć, że ta konkretna beleczka posiada mały odgałęzienie. Ruch odgałęzienia jest widoczny w odległości ok. 0,75 mm wzdłuż beleczki. Na koniec, segmentowane obrazy można przekształcić w siatki, aby ułatwić konstrukcję modeli geometrycznych (Ryc. 7G).
Dane obrazowe zarejestrowane w każdej z różnych pozycji beleczki z częstotliwością 100 fps zostały połączone w celu utworzenia pojedynczego, kompletnego obrazu beleczki (Rycina 8A). Rozdzielczość tych obrazów wynosi 0,535 µm/pixel. Zastosowanie funkcji liniowego ważenia w obszarach nakładania się sąsiednich okien ułatwia wizualizację i minimalizuje wpływ winietowania występującego w obrazach w polu jasnym. Aby zmierzyć sygnał fluorescencyjny, okno beleczki o wymiarach 540 µm na 540 µm jest cyklicznie oświetlane światłem o długości fali 340 nm, 365 nm i 380 nm z częstotliwością 600 Hz. Stosunek emitowanej fluorescencji związanej z pobudzeniem światłem 340 nm i 380 nm koreluje z wewnątrzkomórkowym poziomem wapnia po załadowaniu beleczki barwnikiem Fura-2. Ponieważ pomiar ten jest stosunkiem, efektywna częstotliwość pomiaru wynosi 200 Hz. Uśrednione (n = 10) przejściowe zmiany wewnątrzkomórkowego Ca2+ z każdego okna są dopasowane do obszaru, z którego zostały obrazowane (Rycina 8B). Choć szczyty tych zmian wydają się dość spójne, rozkurczowe [Ca2+] jest niższe w obszarze między 900 µm a 1800 µm wzdłuż beleczki. Podobnie wyniki śledzenia przemieszczeń (Rycina 8C) i obliczeń długości sarkomerów (Rycina 8D) wskazują na obecność zmienności regionalnej. Zastosowana bezmarkerowa technika śledzenia jest w stanie przetworzyć przemieszczenie każdego piksela, pod warunkiem zapewnienia odpowiedniego kontrastu. Podczas mapowania rozkładu długości sarkomerów, do obliczenia regionalnej długości sarkomerów wykorzystano obszar korelacji wzajemnej o wymiarach 128 pikseli na 128 pikseli (~67 µm na 67 µm). Obszar ten obejmuje około 29 sarkomerów, gdy próbka znajduje się blisko optymalnej długości sarkomeru. Krok (zarówno w kierunku x-, jak i y-) między centroidem każdego okna korelacji wzajemnej został ustawiony na 50 pikseli (~26 µm) w celu przetworzenia tych danych. Odpowiedniość szacunków długości sarkomerów została przetestowana na podstawie szerokości i amplitudy dopasowania Gaussa do sygnału FFT. Warunki te nie zostały spełnione w obszarze mięśnia między 0 µm a 500 µm, w związku z czym nie można było tam obliczyć informacji o długości sarkomerów. Biorąc pod uwagę powiązane przemieszczenia, prawdopodobne jest, że sarkomery w tym obszarze wydłużyły się podczas fazy skurczowej. Zgodnie z tą hipotezą, średnie długości sarkomerów po prawej stronie beleczki ulegają skróceniu w tym okresie. Po połączeniu informacji zawartych na każdym z paneli wydaje się, że obszar o największej powierzchni przekroju poprzecznego nie generuje największej siły. Przy założeniu, że regionalna zmienność przejść Ca2+ ma w przybliżeniu gładki gradient, Rycina 8B wskazuje, że przejście Ca2+ o największej amplitudzie występuje gdzieś między 1300 µm a 1600 µm wzdłuż beleczki. Mapa przemieszczeń wskazuje, że obszar wykazujący najmniejszy ruch dobrze pokrywa się ze szczytem przejścia Ca2+. Jednakże obszar ten posiada najmniejsze powierzchnie przekroju poprzecznego w próbce. Mając na uwadze te dane, można wywnioskować, że region ten generował największe naprężenie.
<img alt="Schemat układu spektroskopii optycznej; lampa ksenonowa, soczewki, filtry do analizy emisji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Adnotowany obraz kardiomiometru. Zaznaczono każdy z głównych komponentów optycznych. Wstawka zawiera zbliżenie z widokiem od tyłu obiektywu mikroskopu in situ, poniżej komory pomiarowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu mikroskopii fluorescencyjnej z diodami LED, lustrami dichroicznymi i filtrami do wzbudzenia optycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Tor optyczny dla jednoczesnej mikroskopii w polu jasnym i fluorescencyjnej. Źródłem oświetlenia dla mikroskopu fluorescencyjnego jest lampa ksenonowa, której wyjście cyklicznie przełącza się między światłem o długościach fal 340 nm, 365 nm i 380 nm. Ścieżka wyjściowa lampy łukowej zawiera lustro dichroiczne z długością fali odcięcia 409 nm, które odbija światło UV na lustro kierujące światło do obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego. Soczewka skupia światło wzbudzenia na próbce i zbiera emitowane światło o dłuższej długości fali 510 nm. Emitowane światło to przechodzi przez pierwsze lustro dichroiczne, ale nie przez drugie, ponieważ ma ono długość fali odcięcia 552 nm. Następnie soczewka polowa skupia odbite światło na detektorze PMT. Tymczasem źródło oświetlenia (dioda LED 660 nm) dla mikroskopu w polu jasnym znajduje się nad próbką. Światło przechodzące jest skupiane na próbce przez soczewkę kondensatora, a obiektyw fluorescencyjny 20× rejestruje powstały obraz transmisyjny. Długość fali stosowana do oświetlenia w polu jasnym przekracza długość fali odcięcia każdego z luster dichroicznych, w związku z czym przechodzi przez oba, zanim obraz zostanie skupiony na matrycy kamery CMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ pola jasnego i fluorescencji z diagramem OCT, systemem obrazowania mikroskopowego i elektrodami stymulującymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Konstrukcja uchwytu komory pomiarowej. (A) Widok izometryczny uchwytu komory pomiarowej z naniesionymi drogami optycznymi. Oświetlenie w polu jasnym odbywa się z powierzchni górnej (oś z); oświetlenie fluorescencyjne odbywa się z powierzchni dolnej (oś z), a sygnał ramienia pomiarowego OCT jest ortogonalny do pozostałych osi oświetlenia (oś y). Podczas eksperymentu dwa platynowe haczyki utrzymują beleczkę w szklanej rurce kapilarnej, która pełni funkcję komory pomiarowej. Silniki cewkowe sterują każdym haczykiem, a ich pozycje są mierzone za pomocą interferometrii laserowej. Aktualna pozycja jest porównywana z zadaną przez użytkownika wartością referencyjną, a błąd jest minimalizowany za pomocą kontrolera PID zakodowanego w układzie FPGA. (B) Komora pomiarowa in situ przy włączonym oświetleniu w polu jasnym. Widok z tyłu przedstawiono na wstawce w Rycini 1. (C) Schemat przepływu perfuzatu przez uchwyt komory pomiarowej. Perfuzat wpływa do tylnej części bloku i płynie w kierunku wskazanym przez strzałki. Elektrody powyżej i poniżej nurtu generują stymulację polową w celu wywołania skurczu zamocowanej beleczki w komorze pomiarowej. Niebieskie zacienienie wskazuje obszary, przez które przepływa perfuzat podczas eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza równowagi statycznej; ΣFx=0; interfejs sterowania mikroskopem z danymi widmowymi; układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Panel przedni oprogramowania do akwizycji obrazu i sterowania. (A) Interfejs użytkownika obrazowania w polu jasnym. (B) Interfejs użytkownika obrazowania OCT. (C) Interfejs użytkownika sterowania sprzętem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Etapy sekcji organu, zestaw do mikromanipulacji; ekstrakcja tkanki serca, przebieg pracy z mikroczipem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Protokół sekcji i montażu trabekuli. (A) Serce szczura poddane perfuzji w układzie Langendorffa w komorze sekcyjnej. (B) To samo serce po usunięciu przedsionków. Linie przerywane wskazują trajektorię wycięcia w celu otwarcia komór. (C) Otwarte serce z odsłoniętym wnętrzem obu komór. Przerywana ramka wskazuje obszar, w którym zazwyczaj znajdują się trabekule. (D) Wycięty fragment ściany prawej komory (ten sam, który wskazano przerywaną ramką w C). Linie przerywane wyróżniają trzy trabekule. (E) Trabekula wybrana spośród trzech wskazanych w D. (F) Trabekula z panelu E po usunięciu tkanki ściany. (G) Izolowana trabekula w końcówce strzykawki 1 mL. (H) Trabekula w komorze montażowej. (I) Trabekula zamontowana pomiędzy dwoma platynowymi haczykami. (J) Trabekula zamontowana między haczykami w komorze pomiarowej (Rycina 3B). Zielona plama jest artefaktem pochodzącym z pierwszego filtra dichroicznego. (K) Dodatkowy kąt widzenia zamontowanej trabekuli w komorze pomiarowej. Odległość między trabekulą a obiektywem mikroskopu wynosi około 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres siła-czas, analiza odpowiedzi przejściowej z wykorzystaniem danych o elastyczności, reprezentacja graficzna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zależność pomiaru siły od położenia. Nałożone na siebie przebiegi siły generowanej przez mięsień dla każdej z pozycji obrazowania (n = 7). Średnia aktywna siła wyniosła 0.527 mN ± 0.003 mN, czas do 50 % skurczu 77.1 ms ± 0.3 ms, a czas do 50 % rozkurczu 328.1 ms ± 0.9 ms (wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza równowagi statycznej. Diagramy pokazują wariancję przekroju poprzecznego; mapa kolorystyczna pokazuje czasowe zmiany powierzchni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Analiza obrazowania OCT. (A) Przykład segmentacji WEKA. Zsegmentowany przekrój poprzeczny mięśnia zaznaczono na czerwono, a tło na zielono. (B) Widok z góry surowych danych C-scan beleczki. Jasna ukośna linia w górnej części obrazu to odbicie ścianki komory pomiarowej. (C) Widok z boku surowych danych C-scan beleczki. (D) Widok z góry zsegmentowanych danych OCT. (E) Widok z boku zsegmentowanych danych OCT. (F) Powierzchnia przekroju poprzecznego wzdłuż długości beleczki (oś x) w czasie (oś y). Średnia powierzchnia przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia wynosiła 0.0326 mm2 ± 0.0005 mm2 (średnia ± S.E.). (G) Siatka beleczki. Siatka została w przybliżeniu dopasowana do wykresu powierzchni przekroju poprzecznego z panelu F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza włókien mięśniowych z wykresami sarkomerów; wykres położenia w czasie dla stosunków F i przemieszczenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Analiza obrazowania w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym. (A) Złożony obraz (siedem okien obrazowania) beleczki. (B) Przejściowe zmiany stężenia Ca2+ wzdłuż długości beleczki. (C) Średnie przemieszczenie w osi x z każdego okna obrazowania. Dodatnie przemieszczenie oznacza ruch w prawo, a ujemne w lewo. (D) Średnie długości sarkomerów z każdego okna obrazowania, które posiadało odpowiedni kontrast obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Tabela roztworów <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie integracji trzech systemów obrazowania w jednym urządzeniu, które umożliwia jednoczesny pomiar funkcji mechanicznej, dynamiki jonowej i zmiany geometrycznej kurczącej się tkanki serca. W szczególności mierzymy wytwarzanie siły w tkance, stany przejściowe wapnia, lokalne przemieszczenia i zmianę kształtu. Połączenie tych metod obrazowania może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób serca, co ma poważne implikacje dla opracowania skutecznych strategii leczenia.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia nam badanie niejednorodności aktywności mięśni. Urządzenie użyte w tym protokole zawiera trzy systemy obrazowania zdolne do obrazowania tej samej próbki: mikroskop jasnego pola, mikroskop fluorescencyjny i optyczny tomograf koherentny. Seria zwierciadeł dichroicznych służy do oddzielenia emisji fluorescencji od obrazu transmisyjnego w jasnym polu.Podstawowymi cechami tego urządzenia są dwa niezależnie uruchamiane haki montażowe, komora pomiarowa z trzema optycznie czystymi osiami oraz zewnętrzna linia wyzwalająca, która synchronizuje kamery brightfield i OCT ze stymulatorem. W tym filmie pokazujemy, jak izolować, przygotowywać i obrazować beleczki serca oraz przedstawiamy reprezentatywne wyniki. Po wycięciu serca od znieczulonego szczura przenieś je do komory rozbiorowej.Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczyków przeciągnij aortę nad kaniulą perfuzyjną. Przytrzymaj aortę na miejscu za pomocą jednego kleszcza. W międzyczasie otwórz przewód rurkowy, aby umożliwić przepływ roztworu preparacyjnego przez kaniulę perfuzyjną.Gdy naczynia wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a serce zostanie całkowicie wypełnione roztworem preparacyjnym, zabezpiecz aortę na miejscu za pomocą szwu. Ustaw serce, obracając kaniulę tak, aby lewa tętnica wieńcowa była widoczna na górnej powierzchni. Przypnij wierzchołek serca do dna komory rozbiorowej.Odetnij oba przedsionki. Przeciąć wzdłuż prawej strony przegrody do wierzchołka serca. Przypnij otwartą lewą komorę do podstawy komory rozwarstwiającej.Następnie, przecinając wzdłuż lewej strony przegrody, otwórz prawą komorę i przypnij ją również do podstawy komory rozwarstwienia. Zidentyfikuj swobodnie biegnącą bełeczkę w prawej komorze. Za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszcza przetnij tkankę ścienną otaczającą beleczkową.Następnie przetnij tkankę ściany na pół, prostopadle do kierunku beleczki. Przytnij tkankę ścienną, aż jej wymiar będzie odpowiedni dla zastosowanej konfiguracji montażowej. Pozostaw wyciętą beleczkę w komorze prosektoryjnej.Przepłukać gorącą wodę, wodę destylowaną, a następnie roztwór superfuzatu przez komorę pomiarową. Włącz źródło światła mikroskopu jasnego pola i naciśnij F1, aby włączyć przechwytywanie. Ręcznie wyreguluj hak za urządzeniem, aż zostanie wyśrodkowany na obrazie w jasnym polu.Kliknij zerową oś dolną, a następnie wyłącz downstream, aby włączyć silnik. Przesuń suwak wartości zadanej w dół, aż koniec haka zrówna się z krawędzią domyślnego obszaru zainteresowania. Ponownie wyzeruj dolną oś, a następnie przesuń suwak dolnej wartości zadanej na 1 000.Powtórz proces z hakiem upstream, ale nie przesuwaj suwaka wartości zadanej upstream po ponownym wyzerowaniu osi upstream. Kliknij przycisk Przenieś do montażu. Uruchom system oświetlenia fluorescencyjnego, przełączając przełącznik lampy, a następnie szybko włącz podsystemy sterownika, przełączając wyłącznik główny.Przełącz tryb pracy na wygaszanie turbo, naciskając przycisk trybu na panelu przednim, a następnie dwa, a następnie jeden. Naciśnij przycisk online, aby włączyć sterowanie zewnętrzne. Wstrzymać przepływ superfusatu przez komorę pomiarową.Napełnij komorę montażową roztworem preparacyjnym. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki przetransportuj belekcję z komory preparacyjnej do komory montażowej. Pozwól, aby bełeczka opadła do komory montażowej za pomocą grawitacji.Obniż poziom płynu w komorze montażowej tak, aby znajdował się na poziomie środkowej części haków. Dostosuj odległość między hakami, aby odzwierciedlić długość luzu beleksy, przesuwając suwak wartości zadanej za urządzeniem. Używając mikroskopu do wizualizacji, delikatnie chwyć jeden z kawałków tkanki końcowej kleszczami i zamontuj go na haku przed nim.Zamontuj drugi kawałek tkanki końcowej na haku poniżej. Po bezpiecznym zamontowaniu przenieś beleczkę z powrotem do komory pomiarowej, naciskając przycisk przenoszenia do komory i wznów przepływ superbezpiecznika. Ustaw częstotliwość bodźca na jeden, czas trwania bodźca na 10, a napięcie bodźca na 10.Rozpocznij stymulację, naciskając bodziec. Włącz system oświetlenia w jasnym polu. Naciśnij F1 i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje prążkowany obszar interfejsu użytkownika.Kliknij opcję Oblicz długość sarkomeru, aby obliczyć średnią długość sarkomeru w wyróżnionym obszarze. Zwiększ długość mięśnia, aż średnia długość sarkomeru wyniesie około 2,32 mikrona. Przesuń mięsień, regulując środkowy suwak wartości zadanej na środkowej karcie kontroli separacji tak, aby krawędź dolnego haka była widoczna tylko w jasnym polu.Zbierz informacje o fluorescencji dla 10 drgań. Zwiększ wartość zadaną środka o 200 i zbierz informacje o fluorescencji o wartości kolejnych 10 drgań. Powtarzaj ten proces, aż obraz w jasnym polu będzie zawierał punkt zaczepienia.Zbierz informacje o fluorescencji z ostatniego okna. Przywróć trabecula do pozycji środkowej, ustawiając środkową wartość zadaną na zero. Zmniejsz częstotliwość bodźca do 0,2 Hz i przełącz się z superfusatu K-H na roztwór ładujący Fura-2.Mierz sygnał fluorescencji co 10 minut. Wizualizacja sygnału na karcie Sygnał PMT. Po 10-krotnym wzroście sygnału 360 n-metrowego przywróć częstotliwość bodźca do jednego herca i przełącz się z powrotem na roztwór superbezpiecznika K-H.Sprawdzaj pomiar proporcji co 10 minut, aż sygnał się ustabilizuje, w którym to momencie można rozpocząć zbieranie danych. Przywróć mięsień do pozycji, w której krawędź dolnego haka jest po prostu obecna na obrazie w jasnym polu. Przechwyć informacje o fluorescencji, klikając włącz źródło fluorescencji.Rozpocznij strumieniowe przesyłanie danych sprzętowych. W interfejsie użytkownika obrazowania w jasnym polu ustaw tryb przechwytywania na wyzwalacz zewnętrzny, zwiększ liczbę klatek na sekundę do 100 Hz i ustaw liczbę przechwytywanych obrazów na 100. Naciśnij control-shift-S, a następnie F1, aby zarejestrować dane obrazowania w jasnym polu dla tego okna.Zwiększ środkową wartość zadaną o 200 i powtórz proces przechwytywania jasnego pola. Kontynuuj korzystanie z protokołu skanowania, aż dane obrazowania zostaną zebrane dla ostatniego okna. Przywróć trabecula do pozycji środkowej, ustawiając środkową wartość zadaną na zero.Włącz źródło oświetlenia OCT, obracając główny, naciskając przycisk zasilania, a następnie przycisk SLDs. Zakryj głowicę galwanometru i kliknij pobierz tło, aby zmierzyć wzór zakłóceń tła i odjąć go od pomiaru. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na podgląd na żywo.Wyśrodkuj bełeczkę w osiach X i Y, dostosowując wartości przesunięcia X i Y. Gdy bebeczka jest wyśrodkowana, skanuj wzdłuż osi y, dostosowując pozycję Y, aby znaleźć pozycje odpowiadające hakom w górę i w dół. Zanotuj te pozycje w dół.Ustaw zakres Y na bezwzględną różnicę między tymi wartościami podzieloną przez 10. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na wyzwolony bodziec, zakres X do 100 i kliknij przycisk ustaw aktywne parametry. Kliknij Dane strumienia, a następnie pobierz.Aby uchwycić regionalne informacje o wapniu i jasnym polu na całej długości prezentowanej tutaj beczekuli, potrzebnych było siedem pozycji mięśni. Ta liczba średniej siły z każdej z nałożonych pozycji sugeruje, że siła drgań nie została zakłócona przez ten ruch, ujawniając, że nie było zależności od położenia aktu wytwarzania siły. Skany te zebrane za pomocą optycznej tomografii koherentnej z częstotliwością 100 Hz zostały podzielone na segmenty za pomocą wtyczki ImageJ, Weka.Każdy przekrój wydaje się zniekształcony ze względu na różnicę między rozdzielczością poprzeczną a rozdzielczością głębokości. Zostało to poprawione przez skalowanie każdej osi niezależnie z odpowiednią rozdzielczością. Po przeskalowaniu surowego C-skanu beleczki, mięsień jest w przybliżeniu cylindryczny.Odbicie ścianki komory pomiarowej może czasami pokrywać się z danymi dotyczącymi mięśni, ale oprogramowanie do segmentacji można wytrenować, aby to uwzględnić. Po segmentacji pole przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia można obliczyć w całym skurczu. Zauważ, że ta konkretna trabecula ma małą gałąź.Ruch gałęzi jest widoczny mniej więcej w połowie długości beleczka. Na koniec podzielone na segmenty obrazy można przekształcić w siatki, aby ułatwić budowę modeli geometrycznych. Dane obrazowe przechwycone w każdej z siedmiu pozycji z szybkością 100 klatek na sekundę zostały połączone w celu stworzenia jednego, kompletnego obrazu beleczki.Stosunek pominiętej fluorescencji związanej ze światłem wzbudzenia o długości 340 i 380 nanometrów koreluje z wewnątrzkomórkowym wapniem po załadowaniu beleczki Fura-2. Średnio 10 wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia z każdego okna jest wyrównanych z regionem, w którym zostały zobrazowane. Podczas gdy szczyt stanów nieustalonych dla tej beczek wydaje się dość spójny, rozkurczowy wapń zmniejszył się na całej jego długości.Podobnie, wyniki śledzenia przemieszczeń i obliczeń długości sarkomeru również wskazują na obecność zmienności regionalnej. Zastosowana technika śledzenia bez znaczników jest w stanie obliczyć przemieszczenie każdego piksela. Przydatność oszacowań długości sarkomeru została przetestowana w oparciu o szerokość i amplitudę dopasowania Gaussa do sygnału FFT.Warunki te nie zostały spełnione w obszarze mięśniowym od zera do 500 mikronów, więc nie można było tam obliczyć informacji o długości sarkomeru. Biorąc pod uwagę związane z tym przemieszczenia, jest prawdopodobne, że sarkomery w tym regionie wydłużyły się podczas fazy skurczu skurczu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować beleczki serca i niezawodnie przygotowywać je do obrazowania multimodalnego.Proces ten ustanawia ścieżkę do gromadzenia zestawu danych niezbędnego do budowy fizjologicznie poinformowanych modeli elementów skończonych skurczu tkanki serca.

simultaneous-brightfield-fluorescence-optical-coherence-tomographic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis metodologii i wyników jednoczesnego endokardialnego i epikardialnego mapowania optycznego wzbudzenia elektrycznego w nienaruszonym lewym przedsionku serca owczego perfundowanego metodą Langendorffa podczas indukowanego rozciąganiem migotania przedsionków.

Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej rozdzielczości obrazów mikrotomografii komputerowej zdrowych i patologicznych całych serc dużych ssaków z selektywnym wzmocnieniem kontrastu.

Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj metodę jednoczesnego obrazowania w jasnym polu, fluorescencji i tomografii koherentnej kurczących się beleczek serca szczura. Ta technika umożliwia pomiar funkcji mechanicznej, dynamiki jonowej i zmian geometrycznych tkanki sercowej.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Przeglądaj więcej filmów