Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie integracji trzech systemów obrazowania w jednym urządzeniu, które umożliwia jednoczesny pomiar funkcji mechanicznej, dynamiki jonowej i zmiany geometrycznej kurczącej się tkanki serca. W szczególności mierzymy wytwarzanie siły w tkance, stany przejściowe wapnia, lokalne przemieszczenia i zmianę kształtu. Połączenie tych metod obrazowania może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób serca, co ma poważne implikacje dla opracowania skutecznych strategii leczenia.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia nam badanie niejednorodności aktywności mięśni. Urządzenie użyte w tym protokole zawiera trzy systemy obrazowania zdolne do obrazowania tej samej próbki: mikroskop jasnego pola, mikroskop fluorescencyjny i optyczny tomograf koherentny. Seria zwierciadeł dichroicznych służy do oddzielenia emisji fluorescencji od obrazu transmisyjnego w jasnym polu.

Podstawowymi cechami tego urządzenia są dwa niezależnie uruchamiane haki montażowe, komora pomiarowa z trzema optycznie czystymi osiami oraz zewnętrzna linia wyzwalająca, która synchronizuje kamery brightfield i OCT ze stymulatorem. W tym filmie pokazujemy, jak izolować, przygotowywać i obrazować beleczki serca oraz przedstawiamy reprezentatywne wyniki. Po wycięciu serca od znieczulonego szczura przenieś je do komory rozbiorowej.

Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczyków przeciągnij aortę nad kaniulą perfuzyjną. Przytrzymaj aortę na miejscu za pomocą jednego kleszcza. W międzyczasie otwórz przewód rurkowy, aby umożliwić przepływ roztworu preparacyjnego przez kaniulę perfuzyjną.

Gdy naczynia wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a serce zostanie całkowicie wypełnione roztworem preparacyjnym, zabezpiecz aortę na miejscu za pomocą szwu. Ustaw serce, obracając kaniulę tak, aby lewa tętnica wieńcowa była widoczna na górnej powierzchni. Przypnij wierzchołek serca do dna komory rozbiorowej.

Odetnij oba przedsionki. Przeciąć wzdłuż prawej strony przegrody do wierzchołka serca. Przypnij otwartą lewą komorę do podstawy komory rozwarstwiającej.

Następnie, przecinając wzdłuż lewej strony przegrody, otwórz prawą komorę i przypnij ją również do podstawy komory rozwarstwienia. Zidentyfikuj swobodnie biegnącą bełeczkę w prawej komorze. Za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszcza przetnij tkankę ścienną otaczającą beleczkową.

Następnie przetnij tkankę ściany na pół, prostopadle do kierunku beleczki. Przytnij tkankę ścienną, aż jej wymiar będzie odpowiedni dla zastosowanej konfiguracji montażowej. Pozostaw wyciętą beleczkę w komorze prosektoryjnej.

Przepłukać gorącą wodę, wodę destylowaną, a następnie roztwór superfuzatu przez komorę pomiarową. Włącz źródło światła mikroskopu jasnego pola i naciśnij F1, aby włączyć przechwytywanie. Ręcznie wyreguluj hak za urządzeniem, aż zostanie wyśrodkowany na obrazie w jasnym polu.

Kliknij zerową oś dolną, a następnie wyłącz downstream, aby włączyć silnik. Przesuń suwak wartości zadanej w dół, aż koniec haka zrówna się z krawędzią domyślnego obszaru zainteresowania. Ponownie wyzeruj dolną oś, a następnie przesuń suwak dolnej wartości zadanej na 1 000.

Powtórz proces z hakiem upstream, ale nie przesuwaj suwaka wartości zadanej upstream po ponownym wyzerowaniu osi upstream. Kliknij przycisk Przenieś do montażu. Uruchom system oświetlenia fluorescencyjnego, przełączając przełącznik lampy, a następnie szybko włącz podsystemy sterownika, przełączając wyłącznik główny.

Przełącz tryb pracy na wygaszanie turbo, naciskając przycisk trybu na panelu przednim, a następnie dwa, a następnie jeden. Naciśnij przycisk online, aby włączyć sterowanie zewnętrzne. Wstrzymać przepływ superfusatu przez komorę pomiarową.

Napełnij komorę montażową roztworem preparacyjnym. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki przetransportuj belekcję z komory preparacyjnej do komory montażowej. Pozwól, aby bełeczka opadła do komory montażowej za pomocą grawitacji.

Obniż poziom płynu w komorze montażowej tak, aby znajdował się na poziomie środkowej części haków. Dostosuj odległość między hakami, aby odzwierciedlić długość luzu beleksy, przesuwając suwak wartości zadanej za urządzeniem. Używając mikroskopu do wizualizacji, delikatnie chwyć jeden z kawałków tkanki końcowej kleszczami i zamontuj go na haku przed nim.

Zamontuj drugi kawałek tkanki końcowej na haku poniżej. Po bezpiecznym zamontowaniu przenieś beleczkę z powrotem do komory pomiarowej, naciskając przycisk przenoszenia do komory i wznów przepływ superbezpiecznika. Ustaw częstotliwość bodźca na jeden, czas trwania bodźca na 10, a napięcie bodźca na 10.

Rozpocznij stymulację, naciskając bodziec. Włącz system oświetlenia w jasnym polu. Naciśnij F1 i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje prążkowany obszar interfejsu użytkownika.

Kliknij opcję Oblicz długość sarkomeru, aby obliczyć średnią długość sarkomeru w wyróżnionym obszarze. Zwiększ długość mięśnia, aż średnia długość sarkomeru wyniesie około 2,32 mikrona. Przesuń mięsień, regulując środkowy suwak wartości zadanej na środkowej karcie kontroli separacji tak, aby krawędź dolnego haka była widoczna tylko w jasnym polu.

Zbierz informacje o fluorescencji dla 10 drgań. Zwiększ wartość zadaną środka o 200 i zbierz informacje o fluorescencji o wartości kolejnych 10 drgań. Powtarzaj ten proces, aż obraz w jasnym polu będzie zawierał punkt zaczepienia.

Zbierz informacje o fluorescencji z ostatniego okna. Przywróć trabecula do pozycji środkowej, ustawiając środkową wartość zadaną na zero. Zmniejsz częstotliwość bodźca do 0,2 Hz i przełącz się z superfusatu K-H na roztwór ładujący Fura-2.

Mierz sygnał fluorescencji co 10 minut. Wizualizacja sygnału na karcie Sygnał PMT. Po 10-krotnym wzroście sygnału 360 n-metrowego przywróć częstotliwość bodźca do jednego herca i przełącz się z powrotem na roztwór superbezpiecznika K-H.

Sprawdzaj pomiar proporcji co 10 minut, aż sygnał się ustabilizuje, w którym to momencie można rozpocząć zbieranie danych. Przywróć mięsień do pozycji, w której krawędź dolnego haka jest po prostu obecna na obrazie w jasnym polu. Przechwyć informacje o fluorescencji, klikając włącz źródło fluorescencji.

Rozpocznij strumieniowe przesyłanie danych sprzętowych. W interfejsie użytkownika obrazowania w jasnym polu ustaw tryb przechwytywania na wyzwalacz zewnętrzny, zwiększ liczbę klatek na sekundę do 100 Hz i ustaw liczbę przechwytywanych obrazów na 100. Naciśnij control-shift-S, a następnie F1, aby zarejestrować dane obrazowania w jasnym polu dla tego okna.

Zwiększ środkową wartość zadaną o 200 i powtórz proces przechwytywania jasnego pola. Kontynuuj korzystanie z protokołu skanowania, aż dane obrazowania zostaną zebrane dla ostatniego okna. Przywróć trabecula do pozycji środkowej, ustawiając środkową wartość zadaną na zero.

Włącz źródło oświetlenia OCT, obracając główny, naciskając przycisk zasilania, a następnie przycisk SLDs. Zakryj głowicę galwanometru i kliknij pobierz tło, aby zmierzyć wzór zakłóceń tła i odjąć go od pomiaru. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na podgląd na żywo.

Wyśrodkuj bełeczkę w osiach X i Y, dostosowując wartości przesunięcia X i Y. Gdy bebeczka jest wyśrodkowana, skanuj wzdłuż osi y, dostosowując pozycję Y, aby znaleźć pozycje odpowiadające hakom w górę i w dół. Zanotuj te pozycje w dół.

Ustaw zakres Y na bezwzględną różnicę między tymi wartościami podzieloną przez 10. Ustaw tryb przechwytywania obrazu na wyzwolony bodziec, zakres X do 100 i kliknij przycisk ustaw aktywne parametry. Kliknij Dane strumienia, a następnie pobierz.

Aby uchwycić regionalne informacje o wapniu i jasnym polu na całej długości prezentowanej tutaj beczekuli, potrzebnych było siedem pozycji mięśni. Ta liczba średniej siły z każdej z nałożonych pozycji sugeruje, że siła drgań nie została zakłócona przez ten ruch, ujawniając, że nie było zależności od położenia aktu wytwarzania siły. Skany te zebrane za pomocą optycznej tomografii koherentnej z częstotliwością 100 Hz zostały podzielone na segmenty za pomocą wtyczki ImageJ, Weka.

Każdy przekrój wydaje się zniekształcony ze względu na różnicę między rozdzielczością poprzeczną a rozdzielczością głębokości. Zostało to poprawione przez skalowanie każdej osi niezależnie z odpowiednią rozdzielczością. Po przeskalowaniu surowego C-skanu beleczki, mięsień jest w przybliżeniu cylindryczny.

Odbicie ścianki komory pomiarowej może czasami pokrywać się z danymi dotyczącymi mięśni, ale oprogramowanie do segmentacji można wytrenować, aby to uwzględnić. Po segmentacji pole przekroju poprzecznego wzdłuż długości mięśnia można obliczyć w całym skurczu. Zauważ, że ta konkretna trabecula ma małą gałąź.

Ruch gałęzi jest widoczny mniej więcej w połowie długości beleczka. Na koniec podzielone na segmenty obrazy można przekształcić w siatki, aby ułatwić budowę modeli geometrycznych. Dane obrazowe przechwycone w każdej z siedmiu pozycji z szybkością 100 klatek na sekundę zostały połączone w celu stworzenia jednego, kompletnego obrazu beleczki.

Stosunek pominiętej fluorescencji związanej ze światłem wzbudzenia o długości 340 i 380 nanometrów koreluje z wewnątrzkomórkowym wapniem po załadowaniu beleczki Fura-2. Średnio 10 wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia z każdego okna jest wyrównanych z regionem, w którym zostały zobrazowane. Podczas gdy szczyt stanów nieustalonych dla tej beczek wydaje się dość spójny, rozkurczowy wapń zmniejszył się na całej jego długości.

Podobnie, wyniki śledzenia przemieszczeń i obliczeń długości sarkomeru również wskazują na obecność zmienności regionalnej. Zastosowana technika śledzenia bez znaczników jest w stanie obliczyć przemieszczenie każdego piksela. Przydatność oszacowań długości sarkomeru została przetestowana w oparciu o szerokość i amplitudę dopasowania Gaussa do sygnału FFT.

Warunki te nie zostały spełnione w obszarze mięśniowym od zera do 500 mikronów, więc nie można było tam obliczyć informacji o długości sarkomeru. Biorąc pod uwagę związane z tym przemieszczenia, jest prawdopodobne, że sarkomery w tym regionie wydłużyły się podczas fazy skurczu skurczu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować beleczki serca i niezawodnie przygotowywać je do obrazowania multimodalnego.

Proces ten ustanawia ścieżkę do gromadzenia zestawu danych niezbędnego do budowy fizjologicznie poinformowanych modeli elementów skończonych skurczu tkanki serca.