Name: Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Poznaj metodę obrazowania domen replikacyjnych w chromatynie przy użyciu mikroskopii elektronowej z zastosowaniem etykietowania EdU i cząstek Nanogold. Technika ta umożliwia zachowanie strukturalnej integralności próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez RSF (grant #17-15-01290) i RFBR (grant #19-015-00273). Autorzy dziękują programowi rozwojowemu Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego im. Łomonosowa (PNR 5.13) oraz Centrum Doskonałości w dziedzinie obrazowania korelacyjnego firmy Nikon w Instytucie Biologii Fizyko-Chemicznej im. Biełozierskiego za dostęp do oprzyrządowania do obrazowania.

Protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek przylegających i został przetestowany na liniach komórkowych HeLa, HT1080 i CHO.
1. Etykietowanie i utrwalanie komórek
<ol>
	<li>Płytki komórkowe na oczyszczonych kwasem szkiełkach nakrywkowych na 3 cm szalce Petriego. Hoduj komórki w pożywce zalecanej dla używanej linii komórkowej do 70% zbieżności.</li>
	<li>Dodać EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydynę) z 10 mM zapasu do 10 μM stężenia końcowego i umieścić komórki w inkubatorze na 10 minut lub dłużej (w zależności od celu eksperymentu). W przypadku krótszych impulsów (do 2 minut) należy przygotować szalkę Petriego ze wstępnie podgrzanymi świeżymi pożywkami hodowlanymi uzupełnionymi 10 μM EdU i przenieść do niej szkiełka nakrywkowe, zamiast dodawać EdU bezpośrednio do komórek. 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, jeśli nie wskazano inaczej.</li>
	<li>Utrwal oznakowane komórki 2,5% aldehydem glutarowym, świeżo przygotowanym przez rozcieńczenie 25% bulionu w 100 mM buforze kakodylowym, przez 1 godz. 
	UWAGA: Kolejne kroki wykrywania EdU są wrażliwe na czas fiksacji. Dłuższe czasy utrwalania mogą niekorzystnie wpływać na etykietowanie EdU, powodując niższy stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Usunąć aldehyd glutarowy, przemłukując próbki PBS uzupełnionym 5 mM MgCl2 (następnie PBS*). Umyć trzy razy w 10-minutowej inkubacji na każde pranie.</li>
	<li>Przepuszczalność błon plazmatycznych za pomocą 1% Triton X-100 w PBS* (następnie PBS*T). Umyć dwa razy w 5-minutowej inkubacji na każde pranie.</li>
	<li>Dokładnie umyć próbkę PBS*. Wykonaj pięć zmian i inkubuj przez 5 minut przy każdej zmianie.</li>
	<li>Ugasić wolne od pozostałości grupy aldehydowe za pomocą 20 mM glicyny w PBS*, dwa razy po 10 minut każda.</li>
	<li>Zablokuj próbki w 1% BSA w PBS* na 30 minut.</li>
</ol>
2. Reakcja na kliknięcie
UWAGA: Ta procedura jest zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanego protokołu19.
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotuj mieszankę reakcji Click-reaction do wykrywania EdU: w probówce mikrowirówki wymieszaj 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mM CuSO4, 1,2 μL azydku biotyny (10 mM w DMSO) i 50 μL 0,5 M kwasu askorbinowego. W celu kontroli jakości znakowania replikacyjnego i procedury Click-Button na poziomie mikroskopii fluorescencyjnej, azydek biotyny można zastąpić AlexaFluor 488-azide. 
	UWAGA: Kolejność dodawania składników w powyższej reakcji jest ważna.</li>
	<li>Wykonaj reakcję kliknięcia w wilgotnej komorze, aby zminimalizować parowanie i zmiany stężenia w koktajlu reakcyjnym. Przygotować wilgotną komorę, umieszczając mokry arkusz bibuły filtracyjnej na dnie szalki Petriego i przykrywając ją folią parafinową. Umieść szkiełka nakrywkowe na powierzchni folii komórkami skierowanymi do góry i nałóż 50-100 μl koktajlu reakcyjnego na szkiełko nakrywkowe. Reakcja trwa 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, przemłukując próbkę 0,1% Triton X-100 w PBS* (PBS*T), pięć razy przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Zablokuj 1% BSA w PBS*T przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować roztwór streptawidyny-nanozłota z PBS*T zawierającym 1% BSA. Inkubować próbkę ze streptawidyną, sprzężoną z cząstkami nanozłota o długości 1,4 nm (nanosondami) w 1% BSA + PBS*T przez noc w temperaturze +4 °C w nowo przygotowanej komorze wilgotnej.</li>
	<li>Przerwać reakcję i przemyć próbkę w PBS*T, pięć razy przez 10 minut każde.</li>
	<li>Stabilizuj kompleks streptawidyny biotyny poprzez postfixing w 1% aldehydzie glutarowym w PBS* przez 30 min.</li>
	<li>Usunąć aldehyd glutarowy przez intensywne przemycie wodą dejonizowaną i przemyć próbkę w PBS*, pięć razy przez 20 minut każdy.</li>
	<li>Wolne grupy aldehydowe należy stłumić świeżo przygotowanym 1 mg/ml NaBH4 w wodzie, dwa razy po 10 minut każda. Podczas inkubacji tworzą się pęcherzykiH2, które mogą podnieść szkiełka nakrywkowe. Ostrożnie dociśnij je pęsetą.</li>
	<li>Umyć wodą dejonizowaną pięć razy przez 5 minut każdy. 
	UWAGA: W celu kontroli jakości na etapie etykietowania zaleca się wykonanie etykietowania kontrolnego za pomocą znakowanej fluorescencyjnie streptawidyny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Zapewniłoby to oszacowanie intensywności etykietowania i poziomu tła przed przejściem do żmudnych i podatnych na artefakty kolejnych kroków.</li>
</ol>
3. Wzmocnienie Ag
UWAGA: Ta procedura jest zmodyfikowana z Gilerovitch et al., 1995 (zobacz 20,21).
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić 50 g proszku akacjowego w 100 ml wody dejonizowanej. Rozpuść przez 3 dni, odgazuj i przefiltruj przez cztery warstwy gazy. Przechowywać zamrożone w porcjach o pojemności 5 ml w probówkach o pojemności 50 ml. Rozmrozić bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) do 5 ml rozmrożonej porcji roztworu proszku akacjowego, aby uzyskać 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) w roztworze proszku akacjowego. Mieszaj, powoli kołysząc rurką przez 30 minut. Owiń tubę folią, aby chronić ją przed światłem.</li>
	<li>Równocześnie z krokiem 3.2 umyć szkiełka nakrywkowe buforem do płukania (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM sacharozy), trzy razy po 10 minut każde.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór galusanu N-propylu (NPG). W probówce o pojemności 15 ml rozpuść 10 mg NPG w 250 μl 96% etanolu i dostosuj do 5 ml wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Umieść 36 mg mleczanu srebra w owiniętej folią probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Po zakończeniu kroku 3.2 dodaj 1,5 ml roztworu NPG do mieszanki proszku akacjowego i miel przez kolejne 3 minuty. 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywane są w ciemni. Użyj nieaktynicznego światła bezpiecznego (żółtego lub czerwonego).</li>
	<li>Wyrównać próbkę z buforem myjącym i udać się do ciemnego pomieszczenia. Jednocześnie dodaj 5 ml wody dejonizowanej do mleczanu srebra i rozpuść przez energiczne wstrząsanie przez 1-2 minuty.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml roztworu mleczanu srebra do mieszanki proszku akacjowego, powoli kołysz przez 1 minutę. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, ponieważ tlen w mieszance spowolni reakcję.</li>
	<li>Odcedź roztwór z naczynia ze szkiełkami nakrywkowymi i wlej 3 ml mieszanki mleczanu srebra i akacji w proszku na komórki. Kołysz naczyniem kilka razy i inkubuj przez 2-5 minut. Czas inkubacji zależy od partii proszku akacjowego i temperatury. Powinno to być zdefiniowane eksperymentalnie. 
	UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może skutkować niespecyficznym wiązaniem srebra.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję, odcedź mieszaninę reakcyjną i dokładnie umyj naczynie trzema do pięciu wymianami wody dejonizowanej, a następnie trzema kolejnymi wymianami przez 5 minut każda.</li>
	<li>Sprawdź zabarwienie pod mikroskopem jasnego pola. Dobre zabarwienie powinno być od jasnobrązowego do ciemnobrązowego z bardzo słabym żółtawym tłem. 
	UWAGA: Jeśli barwienie się nie rozwija, można natychmiast powtórzyć z już przygotowaną mieszanką (mieszanka jest aktywna przez około 15 minut, jeśli jest przechowywana w ciemności). Jednak plamy w tym przypadku mogą rozwijać się zbyt szybko.</li>
</ol>
4. Złoty toning
UWAGA: W celu ochrony nanocząsteczek srebra przed rozpuszczeniem przez utlenianie OsO4 w kolejnych procedurach, na tym etapie stosuje się impregnację złotem (Sawada, Esaki, 1994)22.
<ol>
	<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.</li>
	<li>W celu ochrony nanocząstek srebra przed rozpuszczeniem przez utlenianieOsO 4 należy inkubować próbki w 0,05% kwasie tetrachloroaurowym przez 2 minuty w ciemności.</li>
	<li>Dokładnie myć wodą dejonizowaną przez 10 min. 
	UWAGA: Na tym etapie do materiału zawierającego DNA dodawany jest dodatkowy kontrast. Kolor próbki powinien zmienić się z brązowego na.</li>
</ol>
5. ChromEM
UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany z Ou et al., 201716.
<ol>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe i nasycać próbki w 10 μM DRAQ5 w PBS przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Przygotować 0,2% roztwór tetrachlorowodorku diaminoferydyny (DAB) w 50 mM Tris lub PBS: 
	rozpuścić DAB w 90% końcowej objętości, energicznie mieszając w ciemności, a następnie dostosować pH do 7,0-7,4 za pomocą NaOH. Dostosuj głośność do 100% i przefiltruj przez filtr 0,22 μM, przechowuj zawinięte w folię.</li>
	<li>Dodać roztwór DAB do komórek (2 ml na 3 cm szalki Petriego) i inkubować przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe na szklaną płytkę Petriego i umieść je na stoliku mikroskopu odwróconego. Naświetlić próbkę (kilka pól widzenia) na mikroskopie odwróconym ze źródłem światła metalohalogenkowym i zestawem filtrów Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 w płaszczyźnie ogniskowej) przez soczewkę Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) przez 10 min. 
	UWAGA: Oznaką udanej fotokonwersji DAB jest całkowite fotowybielanie DRAQ5 i tworzenie ciemnych osadów DAB w napromieniowanych jądrach. Jednak to ostatnie nie zawsze jest widoczne przy intensywnym sygnale EdU-srebrno-złotym (zwłaszcza gdy wykorzystywane są przedłużone impulsy EdU).</li>
	<li>Umyj wodą dejonizowaną trzy razy przez 5 minut każde.</li>
</ol>
6. Odwodnienie i zatapianie żywicy epoksydowej
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówek przygotować częściowo zredukowany roztwór tetratlenku osmu, mieszając 2% wodny roztwór K4Fe(CN)6 z równą ilością 2% wodnego roztworu OsO4, aby uzyskać 1% końcowe stężenie obu składników. Szkiełka nakrywkowe inkubować w zredukowanym OsO4 przez 1 godzinę i myć w wodzie dejonizowanej trzy razy przez 5 minut każde. 
	UWAGA: Na tym etapie zredukowany związek osmu reaguje z osadami DAB i zwiększa kontrast DNA. 
	UWAGA: Osm jest toksyczny, pracuj pod wyciągiem i uchodź się z odpadami zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.</li>
	<li>Odwodnić próbki w serii stopniowanych roztworów etanolu w rosnących procentach: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.</li>
	<li>Do infiltracji i zatapiania należy użyć formuły żywicy ze stosunkiem objętościowym składnika w następujący sposób: monomer żywicy epoksydowej: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0,23 (w/w). Ta formuła miesza się z etanolem.
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe w mieszance etanolu i żywicy (3 części 100% EtOH:1 część żywicy epoksydowej) przez 30 minut.</li>
		<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe w mieszance etanolu i żywicy (1 część 100% EtOH: 1 część żywicy epoksydowej) przez 2 godziny.</li>
		<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe w mieszance etanolu i żywicy (1 część 100% EtOH: 3 części żywicy epoksydowej) przez noc.</li>
		<li>Zastąp mieszankę etanolu i żywicy świeżo przygotowaną czystą żywicą. Inkubować w czystej mieszance żywic przez 8 godzin. Otwórz naczynie, aby resztki etanolu odparowały.</li>
		<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe do nowego naczynia z czystą żywicą i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37–42 °C.</li>
		<li>Napełnij silikonową formę świeżo przygotowaną żywicą. Umieść szkiełka nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół na odpowiedniej formie silikonowej wypełnionej żywicą epoksydową. Żywicę utwardzać przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 dni. 
		UWAGA: Składniki mieszanki żywic epoksydowych są potencjalnymi substancjami rakotwórczymi. Nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij płytę żywiczną z formy, oczyść powierzchnię szkiełka nakrywkowego skalpelem lub żyletką. Aby usunąć szkiełko nakrywkowe, wrzuć je do ciekłego azotu, a następnie przenieś płytę do wrzącej wody. W razie potrzeby czynność powtórzyć.</li>
	<li>Zlokalizuj napromieniowany obszar pod mikroskopem stereoskopowym i wytnij go z płyty za pomocą piły do metalu lub innego odpowiedniego instrumentu. W razie potrzeby podgrzej płytę w temperaturze 70 °C na płycie grzejnej.</li>
	<li>Zamocuj wycięcie w uchwycie na próbkę z ultramikrotomu, aby uzyskać końcowe przycinanie bloków. Za pomocą brzytwy przygotuj próbkę w kształcie piramidy. Zamontuj uchwyt z piramidką na ultramikrotomie i zainstaluj nóż.
	<ol>
		<li>Przyciąć blok tak, aby napromieniowane komórki oznaczone etykietą EdU były włączone. Przygotować półcienki przekrój (o grubości 250 nm) odpowiedni do tomografii elektronowej. 
		UWAGA: Grubość przekroju można dostosować do wymagań eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłącz sekcje od krawędzi noża i umieść je na siatkach z jednym rowkiem. W przypadku tomografii elektronowej odcinki o długości fali 250 nm są pobierane na siatki jednoszczelinowe o średnicy 1 mm, a po wysuszeniu sekcje te mogą być obustronnie pokryte węglem. Nie jest konieczne dodatkowe kontrastowanie. 
	UWAGA: Ponieważ sekcje zawierają już cząsteczki Au-Ag o wysokim kontraście, nie ma potrzeby dodawania fiducial gold particles do powierzchni przekroju.</li>
	<li>Zbadaj siatki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym przy małym powiększeniu (około 600x), aby zlokalizować komórki o odpowiednich wzorcach replikacji. 
	UWAGA: Ten protokół generuje gęstość etykietowania wystarczająco wysoką, aby można było łatwo wykryć ogniska replikacji nawet przy małym powiększeniu. Wskazane jest najpierw stworzenie mapy odcinka do późniejszej nawigacji i zebranie rzutów kątowych do tomografii. Przełącz się na większe powiększenie i rób zdjęcia w wysokiej rozdzielczości.</li>
</ol>
7. Tomografia elektronowa
<ol>
	<li>Włóż siatkę do transmisyjnego mikroskopu elektronowego z uchwytem o wysokim nachyleniu. Załaduj próbkę do mikroskopu elektronowego i zlokalizuj obszar zainteresowania.</li>
	<li>Ustaw mikroskop w trybie EFTEM w trybie oświetlenia prawie równoległego. Dostrój filtr energii za pomocą szczeliny wyboru energii 20 eV umieszczonej na szczycie o zerowej stracie.</li>
	<li>Wstępne napromienianie obszaru akwizycji tomografii z szybkością dawki 40 e/A2/s przez co najmniej 1,5-2 min, co odpowiada całkowitej dawce co najmniej 3000 e/A2.</li>
	<li>Dostosuj wysokość eucentryczną za pomocą automatycznego zadania w SerialEM. Sprawdź zadanie autofokusa, aby upewnić się, że działa poprawnie przy zerowym kącie nachylenia i wartości rozmycia celu -0.8 mkm.</li>
	<li>Przechyl uchwyt na próbkę do -60° za pomocą zadania Walk-Up.</li>
	<li>Ustaw akwizycję tomografii w zakresie od -60 do +60° za pomocą kroku 2.0°. Ekspozycja powinna być ustawiona w zależności od kąta nachylenia, aby utrzymać średnią intensywność w aparacie. Ogranicz przesunięcie obrazu w przypadku, gdy powoduje to przesunięcie energii, a tym samym niewspółosiowość szczeliny. Dane tomografii powinny być zapisane w postaci pliku .mrc.</li>
	<li>Zaimportuj plik .mrc do oprogramowania IMOD w celu rekonstrukcji tomografii. Usuń wartości pikseli odstających z powodu promieni rentgenowskich.</li>
	<li>Wyrównaj serię pochylenia. Wykonaj wstępną korelację krzyżową, a następnie ręcznie oznacz 10-12 cząstek złota jako fiducials. Śledź model odniesienia i sprawdź, czy każdy powiernik jest prawidłowo śledzony w serii przechyłu. Utwórz tomogramy próbek (plasterki) i ręcznie zaznacz cienkie krawędzie sekcji, aby zapobiec ewentualnemu przechyleniu zrekonstruowanej gęstości wewnątrz objętości. Średni błąd resztkowy dla precyzyjnego wyrównania wynosił mniej niż 1,2 pixa.</li>
	<li>Zrekonstruuj tomogram za pomocą algorytmu przefiltrowanej projekcji wstecznej, a następnie przytnij dane wyjściowe, aby dopasować obszar zainteresowania do ostatecznej objętości.</li>
</ol>

<ol><li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicating+large+genomes%3A+divide+and+conquer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li>
<li>Méchali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+origins%3A+Many+choices+for+appropriate+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li>
<li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737(2010).</li>
<li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li>
<li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li>
<li>Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li>
<li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li>
<li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li>
<li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase%2C+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li>
<li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-like+chromatin%3A+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li>
<li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+early+chromosome+condensation%3A+A+hierarchical+folding%2C+axial+glue+model+of+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li>
<li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposium+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromEMT%3A+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li>
<li>Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+factories+and+nuclear+bodies%3A+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li>
<li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li>
<li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li>
<li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed%2C+Epon-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Opisana tutaj metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami. Po pierwsze, zastosowanie chemii Click-chemistry do znakowania zreplikowanego DNA eliminuje konieczność denaturacji DNA do wykrywania BrdU za pomocą przeciwciał, co pozwala lepiej zachować ultrastrukturę chromatyny. 
Po drugie, wykorzystanie biotyny jako drugorzędnego liganda, który powstaje po utrwaleniu aldehydu glutarowego i odpowiednim wygaszaniu niezwiązanych grup aldehydowych, minimalizuje modyfikac...

Replikacja DNA jest podstawowym procesem biologicznym wymaganym do wiernego kopiowania i przekazywania informacji genetycznej podczas podziału komórki. U wyższych eukariontów replikacja DNA podlega ścisłej regulacji czasoprzestrzennej, która przejawia się w sekwencyjnej aktywacji początków replikacji1. Sąsiednie źródła replikacji uruchamiane synchronicznie tworzą klastry replicons2. Na poziomie mikroskopii optycznej miejsca trwającej replikacji DNA są wykrywane jako ogniska replikacji o różnej liczbie i wielkości. Ogniska replikacji wykazują specyficzne wzorce rozmieszczenia przestrzennego w jądrze komórkowym w zależności od czasu replikacji znakowanego DNA3,4, który z kolei jest ściśle skorelowany z jego aktywnością genu. Dzięki dobrze zdefiniowanej sekwencji replikacji DNA, ściśle uporządkowanej w przestrzeni i czasie, znakowanie replikacyjne jest potężną metodą precyzyjnego znakowania DNA nie tylko do badania procesu replikacji jako takiego, ale także do rozróżniania określonej podfrakcji DNA o określonej aktywności transkrypcyjnej i poziomie zagęszczenia. Wizualizacja replikacji chromatyny jest zwykle wykonywana poprzez wykrywanie głównych składników białkowych maszynerii replikacji DNA (albo przez barwienie immunologiczne, albo przez ekspresję fluorescencyjnych znaczników białkowych5,6) lub poprzez włączenie zmodyfikowanych prekursorów syntezy DNA7,8,9,10. Spośród nich tylko metody oparte na włączaniu zmodyfikowanych nukleotydów do nowo zreplikowanego DNA pozwalają na wychwycenie zmian konformacyjnych w chromatynie podczas replikacji i śledzenie zachowania domen replikacyjnych po zakończeniu ich replikacji.
U wyższych eukariontów pakowanie DNA w chromatynę dodaje kolejny poziom złożoności do regulacji podstawowych funkcji genetycznych (transkrypcja, replikacja, naprawa, itp.). Fałdowanie chromatyny wpływa na dostępność DNA dla regulacyjnych transfaktorów i zmian konformacyjnych DNA (odwijanie podwójnej helisy) wymaganych do syntezy matrycy. Dlatego ogólnie przyjmuje się, że zależne od DNA procesy syntezy w jądrze komórkowym wymagają strukturalnego przejścia chromatyny ze stanu skondensowanego, represyjnego do bardziej dostępnej, otwartej konformacji. Cytologicznie te dwa stany chromatyny definiuje się jako heterochromatynę i euchromatynę. Jednak nadal nie ma zgody co do sposobu fałdowania DNA w jądrze. Hipotezy wahają się od modelu "stopionego polimeru"11, gdzie włókno nukleosomalne zachowuje się jak losowy polimer, dla którego gęstość upakowania jest kontrolowana przez mechanizmy separacji faz, do hierarchicznych modeli fałdowania postulujących sekwencyjne tworzenie struktur podobnych do włókien chromatyny o rosnącej grubości12,13. Hierarchiczne modele fałdowania zyskały ostatnio wsparcie w podejściach molekularnych opartych na analizie kontaktów DNA-DNA in situ (przechwytywanie konformacji chromosomów, 3C), wykazując istnienie hierarchii domen strukturalnych chromatyny14. Ważne jest, aby pamiętać, że jednostki replikacji bardzo dobrze korelują z tymi domenami chromatyny15. Główna krytyka tych modeli opiera się na potencjalnej sztucznej agregacji chromatyny spowodowanej procedurami przygotowania próbki, takimi jak przenikanie błon komórkowych i usuwanie składników niechromatynowych, w celu poprawy kontrastu chromatyny w badaniach ultrastrukturalnych, przy jednoczesnej poprawie dostępności chromatyny dla różnych sond (np. przeciwciał). Niedawny postęp techniczny w selektywnym barwieniu DNA do mikroskopii elektronowej poprzez fotoutlenianie diaminobenzydyny za pośrednictwem wiązania DNA za pośrednictwem fluoroforu (ChromEMT6) pozwolił na wyeliminowanie tej przeszkody. Jednak te same rozważania dotyczą wizualizacji replikacji DNA za pomocą mikroskopii elektronowej17,18. W tym miejscu opisujemy technikę, która pozwala na jednoczesne mapowanie ultrastrukturalne w wysokiej rozdzielczości nowo zsyntetyzowanego DNA i całkowitej chromatyny w nienaruszonych komórkach usieciowanych aldehydem. Technika ta łączy wykrywanie DNA znakowanego EdU za pomocą chemii Click-chemistry z biotynylowanymi sondami i streptawidyną-nanozłotem oraz ChromEMT.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-azydek</td><td>Termo Fisher</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>biotyno-azydek</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>Monomer żywicy epoksydowej</td><td>SPI-CHEM</td><td>90529-77-4</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (25%, klasa EM)</td><td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td>Guma arabska</td><td>ACROS Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Galusan N-propylu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan srebra</td><td>ALDRICH</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-AlexaFluor 488 koniugat</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat streptawidyny-nanozłota</td><td>Nanosondy</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>kwas tetrachloroaurowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)</td><td>CHEM-IMPEX INT'L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miedziane siatki jednoszczelinowe</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 zestaw filtrów fluorescencyjnych (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>Alternatywy: Nóż diamentowy Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>Alternatywy: Ted Pella</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Alternatywy: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki o wysokim nachyleniu</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy pracujący pod napięciem 200 kV w trybie EFTEM, z goniometrem o wysokim nachyleniu</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>Alternatywy: FEI, Pęseta Hitachi</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>UltraCut-E</td><td>Alternatywy: RMC</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image</td><td>Acquisition Open Source</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>Przetwarzanie obrazu</td><td>Open Source</td><td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Zasady fałdowania DNA w jądrze komórkowym i jego dynamicznych przemian, które zachodzą podczas wypełniania podstawowych funkcji genetycznych (transkrypcja, replikacja, segregacja, itp.) pozostają słabo poznane, częściowo z powodu braku eksperymentalnych podejść do wizualizacji specyficznych loci chromatyny w strukturalnie zachowanych jądrach. W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji domen replikacyjnych w monowarstwowej hodowli komórkowej in situ, poprzez połączenie znakowania EdU nowo zsyntetyzowanego DNA z późniejszym wykrywaniem znaczników z amplifikacją Ag cząstek nanozłota i barwieniem chromatyny ChromEM. Protokół ten pozwala na wstępne etykietowanie o wysokim kontraście i wysokiej wydajności, kompatybilne z tradycyjnym utrwalaniem aldehydu glutarowego, które zapewnia najlepszą ochronę strukturalną chromatyny do przetwarzania próbek w temperaturze pokojowej. Kolejną zaletą wstępnego osadzania etykietowania jest możliwość wstępnego wyboru interesujących komórek do sekcji. Jest to szczególnie ważne dla analizy heterogenicznych populacji komórek, a także kompatybilności z podejściami tomografii elektronowej do wysokorozdzielczej analizy 3D organizacji chromatyny w miejscach replikacji oraz analizy poreplikacyjnej rearanżacji chromatyny i segregacji chromatyd siostrzanych w interfazie.

Ogniska replikacji w jądrach komórek ssaków wykazują odmienne wzorce rozmieszczenia w obrębie jądra, zależnie od postępu fazy S. Wzorce te korelują z aktywnością transkrypcyjną replikowanych loci. Ponieważ zaprezentowana tutaj metoda wykorzystuje dość silną procedurę fiksacji, możliwe jest w prosty sposób zastosowanie replikacyjnego znakowania impulsowego do specyficznego wykrywania loci chromatyny w różnych stanach transkrypcyjnych, nawet w warunkach zapewniających najlepszą konserwację strukturalną chromatyny, uzyskiwa...

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Przedstawiamy protokół mikroskopowej wizualizacji domen replikacyjnych w komórce poprzez znakowanie EdU nowo zsyntetyzowanego DNA i detekcję znaczników ze wzmocnieniem srebrnym cząstek Nanozłota i barwieniem chromatyny ChromEM. Protokół ten zapewnia wstępne etykietowanie o wysokim kontraście z tradycyjnym utrwalaniem aldehydu glutarowego, co zapewnia najlepszą ochronę strukturalną chromatyny do przetwarzania próbki w temperaturze pokojowej. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem komórki adhezyjnej rosnącej na szkiełkach nakrywkowych na szalce Petriego.Dodaj EdU do końcowego stężenia 10 mikromoli i umieść komórki w inkubatorze na żądany czas etykietowania. Utrwal znakowane komórki za pomocą 2,5% gluaradehydratu w 100 milimolowym roztworze kakodylanu sodu na jedną godzinę. Dłuższy czas utrwalania może niekorzystnie wpłynąć na oznakowanie EdU.Usunąć aldehyd glutarowy poprzez przepłukanie próbek PBS uzupełnionym pięcioma milimolami chlorku magnezu, dalej uważanego za gwiazdę PBS. Umyj trzy razy przez 10 minut. Przeniknij błony plazmatyczne 1% roztworem Trione X-100 w gwieździe PBS, wykonaj dwie zmiany po pięć minut każda.Roztwór ten jest dalej określany jako PBS star T. Dokładnie umyj próbkę gwiazdą PBS. Pięć zmian po pięć minut każda. Ugasić resztkowe grupy aldehydowe 20 milimolami glicyny w gwieździe PBS, dwa razy przez 10 minut.Umieść próbkę w gwieździe PBS z 1% BSA na pół godziny. Podczas blokowania w BSA przygotuj koktajl reakcyjny do wykrycia EdU. Kolejność dodawania komponentów jest ważna.Koniugacja biotyny i azydku EdU odbywa się w komorze wilgotnej w celu zminimalizowania parowania i zmian stężenia w koktajlu reakcyjnym. Przygotuj wilgotną komorę. Umieścić szkiełko nakrywkowe na parafolii z komórkami skierowanymi do góry i nałożyć od 50 do 100 mikrolitrów koktajlu reakcyjnego na szkiełko nakrywkowe.Reakcja trwa 30 minut w temperaturze pokojowej. Zatrzymać reakcję, przemłukując próbkę w PBS star T, pięć razy przez pięć minut każde. Zablokuj ponownie za pomocą 1% BSA w PBS star T przez kolejne pół godziny.Przygotować roztwór streptawidyny-nanozłota w PBS star T z 1% BSA. Inkubować próbkę ze streptawidyną przez noc w temperaturze plus cztery stopnie w nowo przygotowanej wilgotnej komorze. Procedura jest taka sama, jak w przypadku koniugacji biotyny i azydku EdU.Zatrzymaj reakcję i przemyj próbkę, pięć razy po 10 minut, za pomocą PBS star T. Ustabilizuj kompleks streptawidyny biotyny przez dodatkowe utrwalenie będzie 1% aldehydu glutarowego PBS star przez pół godziny. Usuń aldehyd glutarowy przez intensywne mycie wodą dejonizowaną. Ugasić resztkowe grupy aldehydowe jednym miligramem na mililitr borowodorku sodu.Ponownie dokładnie umyć. Kolejnym krokiem jest zwiększenie wielkości cząsteczek Nanozłota poprzez osadzanie srebra na złotym kursie. Przygotuj premiksy, aby zminimalizować aktywność ciemni.Zrównoważyć próbki buforem myjącym i udać się do ciemni. W ciemni wymieszaj składniki, aby przygotować roztwór myjący i nałóż go na próbki. Roztwór proszku akacjowego jest bardzo lepki.Dlatego podczas mieszania składników powoli kołysz rurką, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i piany. Reakcja trwa od dwóch do pięciu minut. Zalecamy wykonanie rozruchu próbnego w celu określenia optymalnego czasu reakcji.Dłuższy czas inkubacji może skutkować niespecyficznym osadzaniem się srebra. Aby zatrzymać reakcję, szybko przepłucz próbkę trzema do pięciu podmianami wody dejonizowanej. Potem nastąpiły trzy kolejne zmiany po pięć minut każda.Aby chronić nanocząstki srebra przed rozpuszczeniem przez tetratlenek osmu, próbki należy inkubować w 0,05% kwasie tetrachloroaurowym przez dwie minuty w ciemności. Dokładnie umyć wodą dejonizowaną. Na tym etapie do materiału zawierającego DNA dodawany jest dodatkowy kontrast.Nasycić próbkę barwieniem DNA DRAQ5. Dodać roztwór diamionobenzydyny do próbki i inkubować przez jedną minutę. Przenieś szkiełko nakrywkowe na szalkę Petriego ze szklanym dnem i umieść je na stoliku odwróconego mikroskopu.Naświetl kilka pól widzenia czerwonym światłem o długości fali 640 nanometrów. Lewy panel pokazuje pełne wybielanie fotograficzne DRAQ5. Na prawym panelu to samo pole widzenia jest obrazowane w świetle przechodzącym, pokazując osad DAB.Umyj próbki wodą dejonizowaną. Kolejny etap należy wykonać pod wyciągiem. Przygotowany częściowo zredukowany roztwór tetratlenku osmu.Ostrożnie. Substancja ta jest wysoce lotna i toksyczna. Przygotowany roztwór nanieść na próbkę.Na tym etapie zredukowane związki osmu reagują z odkładaniem się diamionobenzydyny i zwiększają kontrast DNA. Wyrzuć roztwór zawierający osm zgodnie z lokalnymi przepisami i umyj próbki trzy razy przez pięć minut każda. Próbka jest dalej odwadniana w serii rosnących stężeń etanolu, a następnie infiltracja komórek mieszankami żywicy etanolowej.Zastąp mieszankę żywicy alkoholowej świeżo przygotowaną czystą żywicą. Wypełnij odpowiednią wielkości formę do zatapiania świeżo przygotowaną żywicą. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi w dół nad wnęką wypełnioną żywicą.Utwardzaj żywicę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni. Następnie w 60 stopniach przez co najmniej dwa dni. Usuń żywicę z dolnej powierzchni pokrowca.Wrzuć płytę do ciekłego azotu, a następnie przenieś do wrzącej wody. Szkło powinno się odczepić. W razie potrzeby czynność powtórzyć.Napromieniowane pola widzenia powinny być wyraźnie widoczne ze względu na depozycję diamionobenzydyny i barwienie DAB. Wytnij obszar zainteresowania z płyty za pomocą piły do metalu lub innego odpowiedniego narzędzia. Umieść wycięcie w prostym uchwycie ultramikrotomu.Ustaw ultramikrotom do końcowego przycinania bloków. Za pomocą żyletki przygotuj pillet w kształcie piramidy. Rozmiar płaskiego obszaru na szczycie piramidy powinien wynosić około 400 na 200 mikronów.Zamontuj przygotowaną piramidę w ramieniu ultramikrotomu i zainstaluj nóż. Przygotuj sekcje. Grubość przekroju można dostosować do wymagań eksperymentalnych.Naszym celem jest tomografia EM. Przygotowaliśmy więc sekcje o grubości 250 nanometrów, zwane również przekrojami półcienkimi. Odłącz sekcje od krawędzi noża i zamontuj je na siatce szczelinowej.Użyliśmy siatki szczelinowej, były okrągłe na jeden milimetr, aby były dookoła, jeden milimetr z boku. Mały rozmiar otworu zapewnia lepszą stabilność sekcji. Pozostawić próbki do wyschnięcia na siatce.W tym momencie sekcje są gotowe do obserwacji. Umieść siatkę w uchwycie na próbkę mikroskopu elektronowego. Załaduj próbkę do mikroskopu elektronowego.Zdobądź serię pochyleń. Ogniska replikacji w jądrach komórek ssaków wykazują wyraźne wzorce dystrybucji w zależności od progresji fazy S. Udane znakowanie EdU potwierdzone reakcją kliknięcia z fluorescencyjnie znakowanym azydkiem wykazuje typowy wzorzec replikacji w heterogenicznej populacji komórek po utrwaleniu aldehydu glutarowego na wierzchu.Na znakowanie streptawidyny może mieć wpływ aldehyd glutarowy. Więc najpierw sprawdź fluorescencyjne barwienie streptawidyną w takim samym stanie, jak nanozłoto streptawidyny na dnie. Dobrym wynikiem zabiegu wzmacniania srebra jest ciemnobrązowe zabarwienie niektórych jąder i bardzo słabe żółte zabarwienie cytoplastami, widoczne na spodzie.Zaletą etykietowania z możliwością wstępnego osadzania jest możliwość wyboru komórek do podziału. Na tym etapie jest to możliwe, ponieważ wzory etykietowania stają się widoczne pod mikroskopem jasnego pola. Odpowiednie etykietowanie skutkuje dobrze wyznaczonymi miejscami replikacji.Grot strzałki pokazuje włókna chromatyny barwione DAB. Etykieta tła po prawej stronie jest ograniczona do kilku nanocząstek na mikron kwadratowy. Skrawki półcienkie są gotowe do tomografii i nie wymagają dodawania nanocząstek złota.Opisane podejście zastosowano w badaniach organizacji chromatyny w miejscach z włączoną replikacją. Do analizy poreplikacyjnej rearanżacji chromatyny, w tym obrazowania segregacji chromatyny w wysokiej rozdzielczości. Zastosowano go również do replikowanego znakowania dużych domen chromosomowych oraz badań fałdowania chromatyny wyższego rzędu i heterochromatyny.Ta technika obrazowania jest również ważna jako punkt odniesienia dla danych generowanych przez inne podejścia niemikroskopowe. Metodę tę można również zastosować w skorelowanych badaniach mikroskopowych, w tym w technikach super rozdzielczości. Otwiera to nowe horyzonty w badaniach nad strukturą chromatyny wyższego rzędu i jej dynamiką w różnych stanach fizjologicznych komórki.

imaging-replicative-domains-ultrastructurally-preserved-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Poznaj metodę obrazowania domen replikacyjnych w chromatynie przy użyciu mikroskopii elektronowej z zastosowaniem etykietowania EdU i cząstek Nanogold. Technika ta umożliwia zachowanie strukturalnej integralności próbek.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów