Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Przedstawiamy protokół mikroskopowej wizualizacji domen replikacyjnych w komórce poprzez znakowanie EdU nowo zsyntetyzowanego DNA i detekcję znaczników ze wzmocnieniem srebrnym cząstek Nanozłota i barwieniem chromatyny ChromEM. Protokół ten zapewnia wstępne etykietowanie o wysokim kontraście z tradycyjnym utrwalaniem aldehydu glutarowego, co zapewnia najlepszą ochronę strukturalną chromatyny do przetwarzania próbki w temperaturze pokojowej. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem komórki adhezyjnej rosnącej na szkiełkach nakrywkowych na szalce Petriego.

Dodaj EdU do końcowego stężenia 10 mikromoli i umieść komórki w inkubatorze na żądany czas etykietowania. Utrwal znakowane komórki za pomocą 2,5% gluaradehydratu w 100 milimolowym roztworze kakodylanu sodu na jedną godzinę. Dłuższy czas utrwalania może niekorzystnie wpłynąć na oznakowanie EdU.

Usunąć aldehyd glutarowy poprzez przepłukanie próbek PBS uzupełnionym pięcioma milimolami chlorku magnezu, dalej uważanego za gwiazdę PBS. Umyj trzy razy przez 10 minut. Przeniknij błony plazmatyczne 1% roztworem Trione X-100 w gwieździe PBS, wykonaj dwie zmiany po pięć minut każda.

Roztwór ten jest dalej określany jako PBS star T. Dokładnie umyj próbkę gwiazdą PBS. Pięć zmian po pięć minut każda. Ugasić resztkowe grupy aldehydowe 20 milimolami glicyny w gwieździe PBS, dwa razy przez 10 minut.

Umieść próbkę w gwieździe PBS z 1% BSA na pół godziny. Podczas blokowania w BSA przygotuj koktajl reakcyjny do wykrycia EdU. Kolejność dodawania komponentów jest ważna.

Koniugacja biotyny i azydku EdU odbywa się w komorze wilgotnej w celu zminimalizowania parowania i zmian stężenia w koktajlu reakcyjnym. Przygotuj wilgotną komorę. Umieścić szkiełko nakrywkowe na parafolii z komórkami skierowanymi do góry i nałożyć od 50 do 100 mikrolitrów koktajlu reakcyjnego na szkiełko nakrywkowe.

Reakcja trwa 30 minut w temperaturze pokojowej. Zatrzymać reakcję, przemłukując próbkę w PBS star T, pięć razy przez pięć minut każde. Zablokuj ponownie za pomocą 1% BSA w PBS star T przez kolejne pół godziny.

Przygotować roztwór streptawidyny-nanozłota w PBS star T z 1% BSA. Inkubować próbkę ze streptawidyną przez noc w temperaturze plus cztery stopnie w nowo przygotowanej wilgotnej komorze. Procedura jest taka sama, jak w przypadku koniugacji biotyny i azydku EdU.

Zatrzymaj reakcję i przemyj próbkę, pięć razy po 10 minut, za pomocą PBS star T. Ustabilizuj kompleks streptawidyny biotyny przez dodatkowe utrwalenie będzie 1% aldehydu glutarowego PBS star przez pół godziny. Usuń aldehyd glutarowy przez intensywne mycie wodą dejonizowaną. Ugasić resztkowe grupy aldehydowe jednym miligramem na mililitr borowodorku sodu.

Ponownie dokładnie umyć. Kolejnym krokiem jest zwiększenie wielkości cząsteczek Nanozłota poprzez osadzanie srebra na złotym kursie. Przygotuj premiksy, aby zminimalizować aktywność ciemni.

Zrównoważyć próbki buforem myjącym i udać się do ciemni. W ciemni wymieszaj składniki, aby przygotować roztwór myjący i nałóż go na próbki. Roztwór proszku akacjowego jest bardzo lepki.

Dlatego podczas mieszania składników powoli kołysz rurką, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i piany. Reakcja trwa od dwóch do pięciu minut. Zalecamy wykonanie rozruchu próbnego w celu określenia optymalnego czasu reakcji.

Dłuższy czas inkubacji może skutkować niespecyficznym osadzaniem się srebra. Aby zatrzymać reakcję, szybko przepłucz próbkę trzema do pięciu podmianami wody dejonizowanej. Potem nastąpiły trzy kolejne zmiany po pięć minut każda.

Aby chronić nanocząstki srebra przed rozpuszczeniem przez tetratlenek osmu, próbki należy inkubować w 0,05% kwasie tetrachloroaurowym przez dwie minuty w ciemności. Dokładnie umyć wodą dejonizowaną. Na tym etapie do materiału zawierającego DNA dodawany jest dodatkowy kontrast.

Nasycić próbkę barwieniem DNA DRAQ5. Dodać roztwór diamionobenzydyny do próbki i inkubować przez jedną minutę. Przenieś szkiełko nakrywkowe na szalkę Petriego ze szklanym dnem i umieść je na stoliku odwróconego mikroskopu.

Naświetl kilka pól widzenia czerwonym światłem o długości fali 640 nanometrów. Lewy panel pokazuje pełne wybielanie fotograficzne DRAQ5. Na prawym panelu to samo pole widzenia jest obrazowane w świetle przechodzącym, pokazując osad DAB.

Umyj próbki wodą dejonizowaną. Kolejny etap należy wykonać pod wyciągiem. Przygotowany częściowo zredukowany roztwór tetratlenku osmu.

Ostrożnie. Substancja ta jest wysoce lotna i toksyczna. Przygotowany roztwór nanieść na próbkę.

Na tym etapie zredukowane związki osmu reagują z odkładaniem się diamionobenzydyny i zwiększają kontrast DNA. Wyrzuć roztwór zawierający osm zgodnie z lokalnymi przepisami i umyj próbki trzy razy przez pięć minut każda. Próbka jest dalej odwadniana w serii rosnących stężeń etanolu, a następnie infiltracja komórek mieszankami żywicy etanolowej.

Zastąp mieszankę żywicy alkoholowej świeżo przygotowaną czystą żywicą. Wypełnij odpowiednią wielkości formę do zatapiania świeżo przygotowaną żywicą. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi w dół nad wnęką wypełnioną żywicą.

Utwardzaj żywicę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni. Następnie w 60 stopniach przez co najmniej dwa dni. Usuń żywicę z dolnej powierzchni pokrowca.

Wrzuć płytę do ciekłego azotu, a następnie przenieś do wrzącej wody. Szkło powinno się odczepić. W razie potrzeby czynność powtórzyć.

Napromieniowane pola widzenia powinny być wyraźnie widoczne ze względu na depozycję diamionobenzydyny i barwienie DAB. Wytnij obszar zainteresowania z płyty za pomocą piły do metalu lub innego odpowiedniego narzędzia. Umieść wycięcie w prostym uchwycie ultramikrotomu.

Ustaw ultramikrotom do końcowego przycinania bloków. Za pomocą żyletki przygotuj pillet w kształcie piramidy. Rozmiar płaskiego obszaru na szczycie piramidy powinien wynosić około 400 na 200 mikronów.

Zamontuj przygotowaną piramidę w ramieniu ultramikrotomu i zainstaluj nóż. Przygotuj sekcje. Grubość przekroju można dostosować do wymagań eksperymentalnych.

Naszym celem jest tomografia EM. Przygotowaliśmy więc sekcje o grubości 250 nanometrów, zwane również przekrojami półcienkimi. Odłącz sekcje od krawędzi noża i zamontuj je na siatce szczelinowej.

Użyliśmy siatki szczelinowej, były okrągłe na jeden milimetr, aby były dookoła, jeden milimetr z boku. Mały rozmiar otworu zapewnia lepszą stabilność sekcji. Pozostawić próbki do wyschnięcia na siatce.

W tym momencie sekcje są gotowe do obserwacji. Umieść siatkę w uchwycie na próbkę mikroskopu elektronowego. Załaduj próbkę do mikroskopu elektronowego.

Zdobądź serię pochyleń. Ogniska replikacji w jądrach komórek ssaków wykazują wyraźne wzorce dystrybucji w zależności od progresji fazy S. Udane znakowanie EdU potwierdzone reakcją kliknięcia z fluorescencyjnie znakowanym azydkiem wykazuje typowy wzorzec replikacji w heterogenicznej populacji komórek po utrwaleniu aldehydu glutarowego na wierzchu.

Na znakowanie streptawidyny może mieć wpływ aldehyd glutarowy. Więc najpierw sprawdź fluorescencyjne barwienie streptawidyną w takim samym stanie, jak nanozłoto streptawidyny na dnie. Dobrym wynikiem zabiegu wzmacniania srebra jest ciemnobrązowe zabarwienie niektórych jąder i bardzo słabe żółte zabarwienie cytoplastami, widoczne na spodzie.

Zaletą etykietowania z możliwością wstępnego osadzania jest możliwość wyboru komórek do podziału. Na tym etapie jest to możliwe, ponieważ wzory etykietowania stają się widoczne pod mikroskopem jasnego pola. Odpowiednie etykietowanie skutkuje dobrze wyznaczonymi miejscami replikacji.

Grot strzałki pokazuje włókna chromatyny barwione DAB. Etykieta tła po prawej stronie jest ograniczona do kilku nanocząstek na mikron kwadratowy. Skrawki półcienkie są gotowe do tomografii i nie wymagają dodawania nanocząstek złota.

Opisane podejście zastosowano w badaniach organizacji chromatyny w miejscach z włączoną replikacją. Do analizy poreplikacyjnej rearanżacji chromatyny, w tym obrazowania segregacji chromatyny w wysokiej rozdzielczości. Zastosowano go również do replikowanego znakowania dużych domen chromosomowych oraz badań fałdowania chromatyny wyższego rzędu i heterochromatyny.

Ta technika obrazowania jest również ważna jako punkt odniesienia dla danych generowanych przez inne podejścia niemikroskopowe. Metodę tę można również zastosować w skorelowanych badaniach mikroskopowych, w tym w technikach super rozdzielczości. Otwiera to nowe horyzonty w badaniach nad strukturą chromatyny wyższego rzędu i jej dynamiką w różnych stanach fizjologicznych komórki.