Name: Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę izolacji mitochondriów z zamrożonej tkanki serca potomstwa lochy, umożliwiającą ocenę aktywności kompleksów ETC. Protokół ten zmniejsza potrzebę stosowania zwierząt żywych w badaniach bioenergetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez grant Uniwersytetu Kansas City dla Abdulbaki Agbasa i Letnie Stypendium Badawcze dla Daniela Barrery. Autorzy są wdzięczni za pracę redakcyjną dr. Jana Talleya.

<ol><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).</li>
<li>Osto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+respiration+in+previously+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples.</a> Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).</li>
<li>Agbas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+electron+transfer+cascade+enzyme+activity+assessment+in+cultured+neurons+and+select+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions.</a> Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).</li>
<li>Hathaway, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-engineered+nanomaterial+exposure+disrupts+progeny+cardiac+function+and+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).</li>
<li>May, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+maternal+aerobic+exercise+during+pregnancy+on+fetal+cardiac+function+and+outflow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology+MFM%22%5BJournal%5D)">Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).</li>
<li>Ehler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+malignant+hyperthermia+in+a+porcine+model+for+experimental+open+heart+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery.</a> Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).</li>
<li>Panov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bovine+serum+albumin+on+mitochondrial+respiration+in+the+brain+and+liver+of+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).</li>
<li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+using+blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Pressure Biosciences Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Isolation+of+Functional+Mitochondria+from+Whole+Rat+Heart+Using+a+PBI+Shredder+and+Pressure+Cycling+Technology+%28PCT%29%22">Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT)</a>. , South Easton, MA. (2010).</li>
<li>McLaughlin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+to+quantify+mitochondrial+content+and+intrinsic+bioenergetic+efficiency+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).</li>
<li>Hom, J., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+dynamics+of+mitochondria--a+special+emphasis+on+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+respiratory+chain+supercomplex+formation+in+response+to+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Kluczowe kroki dla tego protokołu są wskazane tutaj. Po pierwsze, homogenizacja tkanek powinna być traktowana ostrożnie, aby podczas procesu homogenizacji tkanek nie wystąpiły nadmierne efekty przezroczystości. Należy użyć rozdrabniacza tkanek, który jest częścią technologii cyklicznych zmian ciśnienia (PCT) do wstępnej homogenizacji tkanek9. Ten krok zmniejszy nadmierny cykl udaru homogenizatora szkło na szkle (ryc. 1B), który może dodatkowo zniszczyć i tak już kruch...

Celem tego protokołu było dostarczenie szczegółowych kroków do uzyskania wzbogaconego o mitochondria preparatu z wcześniej zamrożonej tkanki serca z nową technologią niskoenergetycznego mechanicznego rozbijania tkanki, która poprawia lizę tkanek i ekstrakcję mitochondriów. Dzięki tej metodzie możliwa jest poprawa wydajności ekstrakcji bez generowania dużego naprężenia ścinającego lub wysokiej temperatury oraz krótki czas homogenizacji (10-12 s)1.
Uzyskanie mitochondriów z archiwalnej zamrożonej tkanki jest cennym atutem do przeprowadzenia zarówno badań funkcjonalnych2, jak i biochemicznych3 w przeciwnym razie nie jest łatwo powtórzyć w dokładnych warunkach eksperymentalnych. Klasyczny homogenizator ze szkła teflonowego Potter-Elvehjem lub homogenizator Dounce był i nadal jest używany w laboratoriach badawczych do homogenizacji tkanek miękkich, takich jak wątroba, nerki i mózg. Jednak homogenizacja twardych tkanek, takich jak mięśnie i serce, wymaga dłuższego czasu homogenizacji, leczenia enzymatycznego, szybkiej homogenizacji i dużego doświadczenia użytkownika. Jest to niekorzystne dla ekstrakcji nienaruszonych organelli, takich jak mitochondria, z tkanek twardych, takich jak mięśnie i serce. Metoda opisana w tym protokole służy do uzyskania wysokowydajnego preparatu wzbogaconego w mitochondria do analizy kompleksów białkowych mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) i ich tworzenia nadkompleksów w tkankach serca pobranych od potomstwa urodzonego przez lochę uprawiającą wysiłek fizyczny i prowadzącą siedzący tryb życia, zamrożonego błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywanego w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Metoda ta pozwala na wyizolowanie preparatu wzbogaconego o mitochondria z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek.
Zewnętrzne narażenie ciężarnych gryzoni na nanomateriały może negatywnie wpływać na czynność serca i oddychanie mitochondrialne oraz bioenergetykę u potomstwa podczas ciąży4. Niemniej jednak, wywołane ćwiczeniami aerobowymi pozytywne zmiany w bioenergetyce miocytów płodu podczas ciąży nie zostały jeszcze udokumentowane. Jednak nowe badania dostarczają dowodów na to, że ćwiczenia aerobowe matki w czasie ciąży mają pozytywny wpływ na czynność serca płodu5. W celu uzyskania dalszych dowodów przeprowadzono analizę podłużnego wpływu ćwiczeń matki na sercowe kompleksy mitochondrialnego łańcucha oddechowego u potomstwa (tj. od kompleksu I do kompleksu V) w czasie ciąży.
To badanie ma istotne znaczenie dla zdrowia, ponieważ wyniki mogą sugerować, że ćwiczenia matki poprawiają efektywność produkcji energii w mitochondriach serca potomstwa. W tym badaniu lochy (samice świni) zostały wykorzystane jako model zwierzęcy z dwóch powodów: (i) fizjologia serca jest podobna do human6, oraz (ii) pobranie tkanki serca od potomstwa z różnych punktów czasowych jest możliwe pod instytucjonalnym zatwierdzeniem IACUC. Proponowane badanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na wiele podstawowych pytań łączących ćwiczenia matki z ich potencjalnym pozytywnym wpływem na skład komórkowy i biochemiczny tkanki serca potomstwa. Podejście to wymaga delikatnych, ale skutecznych technik izolacji mitochondriów z wcześniej zamrożonej tkanki serca, uzyskanej z długich i kosztownych badań podłużnych, które dotyczyły kwestii zmian bioenergetycznych w miocytach serca płodu podczas ciąży. Metoda opisana w tym badaniu pozwala na wykorzystanie dużych sum wcześniej zamrożonej zarchiwizowanej tkanki do przygotowania wzbogaconego w mitochondria zarówno do badań analitycznych, jak i funkcjonalnych. Badanie pomoże również wypełnić lukę w wiedzy w tej dziedzinie, dostarczając wstępnych danych, które mogą doprowadzić do przyszłych badań określających wpływ ćwiczeń fizycznych matki na zdrowie serca w macicy i poza nią.

<table><tbody><tr><td>Kwas aminokapronowy</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kompleksu Anti-Hu Total OxPhos</td><td>Invitrogen</td><td>458199</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-VDAC</td><td>abcam</td><td>ab15895</td><td>zastosowanie 1 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>ThermoSientific</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie GelCode Blue</td><td>ThermoScientific</td><td>24592</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Cabiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tłuczka szklano-szklanego</td><td>VWR</td><td>KT885451-0020</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-Dye sprzężony anty-Rabbit</td><td>Ab LICOR</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>Wielodołkowy czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Natywny marker masy cząsteczkowej</td><td>ThermoFisher</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>Monofilament z siatki nylonowej</td><td>Small Part Inc</td><td>CMN-74</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>ThermoScientfic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCT Shredder</td><td>Pressure Bioscience Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOK Bufor blokujący</td><td>ThermoScienctific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Niszczarka PULSE Tube</td><td>Pressure Bioscience Inc</td><td>FT500-PS</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Amresco</td><td>M150-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Amresco</td><td>M191-1G</td><td>Wymaga świeżego przygotowania</td></tr></tbody></table>

pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Profil mitochondrialnego kompleksu transferu elektronów (ETC) jest modyfikowany w tkance serca potomstwa urodzonego przez ćwiczoną lochę. Zaproponowana i przetestowana hipoteza była taka, że regularne ćwiczenia lochy przez matkę w czasie ciąży zwiększyłyby wydajność mitochondrialną bioenergetyki serca potomstwa. Hipoteza ta została przetestowana poprzez wyizolowanie mitochondriów przy użyciu procedury łagodnej izolacji w celu oceny mitochondrialnych ETC i profili superkompleksów. Opisana tu procedura pozwoliła na przetworzenie wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek serca i wyeliminowała konieczność świeżego przygotowania mitochondriów do oceny mitochondrialnych kompleksów ETC, superkompleksów i profili aktywności kompleksów ETC. Protokół ten opisuje optymalny pomiar kompleksu białkowego ETC w multipleksowanym immunoblottingu opartym na przeciwciałach i ocenie super złożonej przy użyciu elektroforezy w żelu natywnym dla koloru niebieskiego.

Zgodnie z protokołem przygotowano wydajną mieszaninę białek wzbogaconą w mitochondria z tkanki serca. Z przeciętnie 1,2 g zamrożonej tkanki serca pobranej od potomstwa lochy uzyskano około 15 mg/mL mieszaniny białek wzbogaconej w mitochondria. Obserwacje wykazały, że masa zamrożonej tkanki serca mniejsza niż 0,5 g nie pozwala na uzyskanie ilości mieszaniny białek wzbogaconej w mitochondria wystarczającej do przeprowadzenia analizy BN-PAGE. Ilość preparatu mitochondrialnego była wystarczająca do wykonania (i) standardowej...

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala użytkownikom na przygotowanie próbek mitochondriów z zamrożonych tkanek pobranych z poprzednich badań i zarchiwizowanych. Protokół ten ogranicza również wykorzystanie żywych zwierząt do pobierania tkanek. Technika ta pozwala użytkownikom na wykorzystanie wcześniej zamrożonych tkanek archiwalnych do przygotowania próbek wzbogaconych o mitochondria przy użyciu delikatnej metody rozdrabniania tkanek.Ta metoda przygotowania maksymalizuje wydajność przygotowania mitochondriów. Zaleca się zapoznanie się z protokołem, aby upewnić się, że wszystkie komponenty i narzędzia są dostępne, zwłaszcza w pełni naładowany napęd niszczarki, a także ćwiczenia z niechcianymi tkankami, aby zapoznać się z krokami. Procedurę zademonstruje Edina Kosa, pracownik naukowy z mojego laboratorium.Na początek zapisz masę rurki zawierającej tkankę serca. Teraz zważ pustą probówkę i odejmij ją od wcześniej zarejestrowanej masy, aby uzyskać masę netto tkanki serca. Umieść zamrożoną tkankę serca bezpośrednio w zlewce z lodowatym roztworem.Mieszaj przez pięć minut. Jednocześnie za pomocą pęsety należy lekko docisnąć tkankę, aby wydobyć jak najwięcej krwi. Wyjmij tkankę kleszczami i ściśnij serce czystym ręcznikiem z bibuły filtracyjnej, aby usunąć krew.Następnie umieść tkankę w innej zlewce z lodowatym roztworem. Po mieszaniu chusteczki przez pięć minut, delikatnie osusz chusteczkę na ręczniku papierowym i usuń tłuszcz, zakrzepłą krew, małżowiny uszne i powięzi. Połącz tkankę komorową.Aby rozdrobnić próbki tkanek, umieść od 50 do 300 miligramów tkanki serca w komorze rozdrabniacza tkanek od strony suwaka i zamknij stronę suwaka. Następnie dodaj około 0,2 do 0,8 mililitra buforu myjącego po stronie nakrętki tuby. Użyj narzędzia do rurek, aby szczelnie przykryć komorę niszczarki nasadką niszczarki, nie dokręcając jej zbyt mocno.Umieść komorę niszczarki w uchwycie niszczarki stroną suwaka do dołu, aby zamocować. Włóż i włącz bit w pełni naładowanego sterownika niszczarki za pomocą nasadki niszczarki, upewniając się, że wiertło jest dobrze zablokowane na swoim miejscu, a następnie dociśnij sterownik niszczarki w komorze niszczarki, aż wskaźnik ciśnienia na uchwycie niszczarki osiągnie ustawienie około dwóch. Naciśnij spust i uruchom sterownik niszczarki na około 10 do 12 sekund, utrzymując ustawienie na dwóch.Obserwuj rurkę, aby zapewnić rozdrobnienie i przejście całości lub większości masy tkankowej przez krążek lizy do górnej komory rozdrabniacza i, jeśli to konieczne, wróć rurkę do uchwytu niszczarki, aby kontynuować rozdrabnianie. Po rozdrobnieniu próbki wyjmij komorę rozdrabniacza z uchwytu i użyj narzędzia do rurek, aby zdjąć nasadkę niszczarki i umieścić ją na czystej powierzchni do późniejszego użycia, zalecane tylko w tej samej próbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego z innych próbek tkanek. Przenieś rozdrobnioną tkankę serca do trzeciej zlewki z 40 mililitrami buforu do przemywania za pomocą mieszadła i mieszaj tkankę przez pięć minut ze średnią prędkością, znajdując się na płytce mieszającej.Przefiltruj zawiesinę przez wstępnie zwilżoną żyłkę z siatki nylonowej. Po wyrzuceniu filtratu rozdrobnioną tkankę na filtrze należy trzykrotnie przemyć 10 mililitrami buforu płuczącego. Przenieś umytą tkankę do 50-mililitrowej zlewki z 20 mililitrami buforu do płukania umieszczonego w łaźni lodowej na mieszadle magnetycznym.Dodaj 0,5 mililitra roztworu trypsyny, ciągle mieszając przez 15 minut. Mniej więcej w połowie mieszania przenieś zawiesinę tkankową do luźno dopasowanego ręcznego homogenizatora szkło na szkle, który może pomieścić 15 mililitrów objętości. Homogenizować zawiesinę czterema do pięciu delikatnych ruchów, nie wytwarzając piany.Następnie umieść homogenat w 50-mililitrowej zlewce i wymieszaj na mieszadle. Następnie dodać 10 mililitrów buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny do homogenatu i inkubować, delikatnie mieszając. Po ponownym przefiltrowaniu zawiesiny przez nylonowy filtr należy zachować filtr w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i przenieść frakcję cząstek stałych pozostałą na filtrze do homogenizatora szkło po szkle.Przy 15 do 20 mililitrach buforu do mycia i delikatnie homogenizować ręką przez 25 do 30 sekund. Po połączeniu homogenatu z filtratem i zrównoważeniu probówek, odwirować, a następnie za pomocą plastikowej pipety usunąć supernatant pozostawiając 0,2 mililitra z wierzchu puszystego granulatu. Przefiltrować powstały supernatant do nowej stożkowej probówki za pomocą nylonowego filtra, aby uniknąć zanieczyszczenia i ponownie odwirować.Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad dwa do trzech razy, dodając bufor izolacyjny z boku probówki, aby zapobiec pęknięciu lub zanieczyszczeniu osadu. Za każdym razem wyrzuć puszystą białą warstwę zewnętrznej krawędzi. Dodać pięć mililitrów buforu izolacyjnego do każdej probówki i rozbić osad za pomocą pipety z końcówką o pojemności jednego mililitra lub nowej pipety transferowej Następnie rozcieńczyć zawiesinę 20 mililitrami dodatkowego buforu izolacyjnego i odwirować zawiesinę o stężeniu 8,500 X g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad najpierw w pięciu mililitrach, a następnie w dodatkowych 15 mililitrach buforu do ponownego zawieszania i odwirować w temperaturze 8,500 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz wyrzuć supernatant i zachowaj brązową osadkę zawierającą umyte nienaruszone mitochondria. Zawiesić osad wzbogacony w mitochondria w 250 mikrolitrach buforu zawieszającego, w tym inhibitorów proteazy.Porcję zawiesiny w objętości 25 mikrolitrów, szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez kilka lat. Zgodnie z protokołem białko wzbogacone w mitochondria przygotowano z serca potomstwa urodzonego przez dwie grupy loch. Jeden był ćwiczony w czasie ciąży, a drugi prowadził siedzący tryb życia.Analiza profilu białkowego ETC wykazała, że potomstwo loch ćwiczących wykazywało stosunkowo obniżone poziomy w niektórych kompleksach ETC. Białka mitochondrialne rozdzielono w BN-PAGE o gradiale od 3 do 8% i poddano badaniu immunologicznemu za pomocą koktajli przeciwciał. Zarówno grupy ćwiczące, jak i siedzące wykazują wiele superkompleksów.Wyraźny wzrost superkompleksu zaobserwowano po dziewięciu miesiącach w grupie ćwiczącej w porównaniu z grupą prowadzącą siedzący tryb życia. Białka wzbogacone w mitochondria uzyskane z różnych grup wiekowych 48 godzin w wieku trzech miesięcy, sześciu miesięcy i dziewięciu miesięcy analizowano pod kątem aktywności kompleksu I-II za pomocą testu kinetycznego. Grupa ćwicząca wykazywała aktywność kompleksu I-II w porównaniu z grupą prowadzącą siedzący tryb życia.Wykonalność badań funkcjonalnych mitochondriów uzyskanych z zamrożonych tkanek i komórek jest wykazywana przez innych badaczy. Preparat mitochondriów uzyskanych z zamrożonej tkanki może być stosowany do wielu różnych tkanek przy minimalnych uszkodzeniach.

measuring-mitochondrial-electron-transfer-complexes-previously-frozen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj dzielimy się metodami pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach, definiującym pojęciem energetyki odżywczej oraz wyciekiem protonów, główną przyczyną nieefektywności w mitochondrialnym wytwarzaniu ATP. Wyniki te mogą odpowiadać za 30% energii utraconej podczas wykorzystania składników odżywczych, aby pomóc w ocenie funkcji mitochondriów.

Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej

Celem tego protokołu jest zilustrowanie, jak używać mysich noworodków kardiomiocytów jako systemu modelowego do badania, jak różne czynniki mogą wpływać na zużycie tlenu w sercu.

Analiza wskaźnika zużycia tlenu w pierwotnych kardiomiocytach noworodków myszy z hodowlą pierwotną przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy mobilne laboratorium do pomiaru tempa oddychania w izolowanych mitochondriach dzikich zwierząt schwytanych w terenie. W tym miejscu opisujemy projekt i wyposażenie mobilnego laboratorium mitochondrialnego oraz związane z nim protokoły laboratoryjne.

Opracowanie mobilnego laboratorium fizjologii mitochondriów do pomiaru energetyki mitochondriów w terenie

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Poznaj metodę izolacji mitochondriów z zamrożonej tkanki serca potomstwa lochy, umożliwiającą ocenę aktywności kompleksów ETC. Protokół ten zmniejsza potrzebę stosowania zwierząt żywych w badaniach bioenergetycznych.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Przeglądaj więcej filmów