Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala użytkownikom na przygotowanie próbek mitochondriów z zamrożonych tkanek pobranych z poprzednich badań i zarchiwizowanych. Protokół ten ogranicza również wykorzystanie żywych zwierząt do pobierania tkanek. Technika ta pozwala użytkownikom na wykorzystanie wcześniej zamrożonych tkanek archiwalnych do przygotowania próbek wzbogaconych o mitochondria przy użyciu delikatnej metody rozdrabniania tkanek.

Ta metoda przygotowania maksymalizuje wydajność przygotowania mitochondriów. Zaleca się zapoznanie się z protokołem, aby upewnić się, że wszystkie komponenty i narzędzia są dostępne, zwłaszcza w pełni naładowany napęd niszczarki, a także ćwiczenia z niechcianymi tkankami, aby zapoznać się z krokami. Procedurę zademonstruje Edina Kosa, pracownik naukowy z mojego laboratorium.

Na początek zapisz masę rurki zawierającej tkankę serca. Teraz zważ pustą probówkę i odejmij ją od wcześniej zarejestrowanej masy, aby uzyskać masę netto tkanki serca. Umieść zamrożoną tkankę serca bezpośrednio w zlewce z lodowatym roztworem.

Mieszaj przez pięć minut. Jednocześnie za pomocą pęsety należy lekko docisnąć tkankę, aby wydobyć jak najwięcej krwi. Wyjmij tkankę kleszczami i ściśnij serce czystym ręcznikiem z bibuły filtracyjnej, aby usunąć krew.

Następnie umieść tkankę w innej zlewce z lodowatym roztworem. Po mieszaniu chusteczki przez pięć minut, delikatnie osusz chusteczkę na ręczniku papierowym i usuń tłuszcz, zakrzepłą krew, małżowiny uszne i powięzi. Połącz tkankę komorową.

Aby rozdrobnić próbki tkanek, umieść od 50 do 300 miligramów tkanki serca w komorze rozdrabniacza tkanek od strony suwaka i zamknij stronę suwaka. Następnie dodaj około 0,2 do 0,8 mililitra buforu myjącego po stronie nakrętki tuby. Użyj narzędzia do rurek, aby szczelnie przykryć komorę niszczarki nasadką niszczarki, nie dokręcając jej zbyt mocno.

Umieść komorę niszczarki w uchwycie niszczarki stroną suwaka do dołu, aby zamocować. Włóż i włącz bit w pełni naładowanego sterownika niszczarki za pomocą nasadki niszczarki, upewniając się, że wiertło jest dobrze zablokowane na swoim miejscu, a następnie dociśnij sterownik niszczarki w komorze niszczarki, aż wskaźnik ciśnienia na uchwycie niszczarki osiągnie ustawienie około dwóch. Naciśnij spust i uruchom sterownik niszczarki na około 10 do 12 sekund, utrzymując ustawienie na dwóch.

Obserwuj rurkę, aby zapewnić rozdrobnienie i przejście całości lub większości masy tkankowej przez krążek lizy do górnej komory rozdrabniacza i, jeśli to konieczne, wróć rurkę do uchwytu niszczarki, aby kontynuować rozdrabnianie. Po rozdrobnieniu próbki wyjmij komorę rozdrabniacza z uchwytu i użyj narzędzia do rurek, aby zdjąć nasadkę niszczarki i umieścić ją na czystej powierzchni do późniejszego użycia, zalecane tylko w tej samej próbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego z innych próbek tkanek. Przenieś rozdrobnioną tkankę serca do trzeciej zlewki z 40 mililitrami buforu do przemywania za pomocą mieszadła i mieszaj tkankę przez pięć minut ze średnią prędkością, znajdując się na płytce mieszającej.

Przefiltruj zawiesinę przez wstępnie zwilżoną żyłkę z siatki nylonowej. Po wyrzuceniu filtratu rozdrobnioną tkankę na filtrze należy trzykrotnie przemyć 10 mililitrami buforu płuczącego. Przenieś umytą tkankę do 50-mililitrowej zlewki z 20 mililitrami buforu do płukania umieszczonego w łaźni lodowej na mieszadle magnetycznym.

Dodaj 0,5 mililitra roztworu trypsyny, ciągle mieszając przez 15 minut. Mniej więcej w połowie mieszania przenieś zawiesinę tkankową do luźno dopasowanego ręcznego homogenizatora szkło na szkle, który może pomieścić 15 mililitrów objętości. Homogenizować zawiesinę czterema do pięciu delikatnych ruchów, nie wytwarzając piany.

Następnie umieść homogenat w 50-mililitrowej zlewce i wymieszaj na mieszadle. Następnie dodać 10 mililitrów buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny do homogenatu i inkubować, delikatnie mieszając. Po ponownym przefiltrowaniu zawiesiny przez nylonowy filtr należy zachować filtr w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i przenieść frakcję cząstek stałych pozostałą na filtrze do homogenizatora szkło po szkle.

Przy 15 do 20 mililitrach buforu do mycia i delikatnie homogenizować ręką przez 25 do 30 sekund. Po połączeniu homogenatu z filtratem i zrównoważeniu probówek, odwirować, a następnie za pomocą plastikowej pipety usunąć supernatant pozostawiając 0,2 mililitra z wierzchu puszystego granulatu. Przefiltrować powstały supernatant do nowej stożkowej probówki za pomocą nylonowego filtra, aby uniknąć zanieczyszczenia i ponownie odwirować.

Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad dwa do trzech razy, dodając bufor izolacyjny z boku probówki, aby zapobiec pęknięciu lub zanieczyszczeniu osadu. Za każdym razem wyrzuć puszystą białą warstwę zewnętrznej krawędzi. Dodać pięć mililitrów buforu izolacyjnego do każdej probówki i rozbić osad za pomocą pipety z końcówką o pojemności jednego mililitra lub nowej pipety transferowej Następnie rozcieńczyć zawiesinę 20 mililitrami dodatkowego buforu izolacyjnego i odwirować zawiesinę o stężeniu 8,500 X g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad najpierw w pięciu mililitrach, a następnie w dodatkowych 15 mililitrach buforu do ponownego zawieszania i odwirować w temperaturze 8,500 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz wyrzuć supernatant i zachowaj brązową osadkę zawierającą umyte nienaruszone mitochondria. Zawiesić osad wzbogacony w mitochondria w 250 mikrolitrach buforu zawieszającego, w tym inhibitorów proteazy.

Porcję zawiesiny w objętości 25 mikrolitrów, szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez kilka lat. Zgodnie z protokołem białko wzbogacone w mitochondria przygotowano z serca potomstwa urodzonego przez dwie grupy loch. Jeden był ćwiczony w czasie ciąży, a drugi prowadził siedzący tryb życia.

Analiza profilu białkowego ETC wykazała, że potomstwo loch ćwiczących wykazywało stosunkowo obniżone poziomy w niektórych kompleksach ETC. Białka mitochondrialne rozdzielono w BN-PAGE o gradiale od 3 do 8% i poddano badaniu immunologicznemu za pomocą koktajli przeciwciał. Zarówno grupy ćwiczące, jak i siedzące wykazują wiele superkompleksów.

Wyraźny wzrost superkompleksu zaobserwowano po dziewięciu miesiącach w grupie ćwiczącej w porównaniu z grupą prowadzącą siedzący tryb życia. Białka wzbogacone w mitochondria uzyskane z różnych grup wiekowych 48 godzin w wieku trzech miesięcy, sześciu miesięcy i dziewięciu miesięcy analizowano pod kątem aktywności kompleksu I-II za pomocą testu kinetycznego. Grupa ćwicząca wykazywała aktywność kompleksu I-II w porównaniu z grupą prowadzącą siedzący tryb życia.

Wykonalność badań funkcjonalnych mitochondriów uzyskanych z zamrożonych tkanek i komórek jest wykazywana przez innych badaczy. Preparat mitochondriów uzyskanych z zamrożonej tkanki może być stosowany do wielu różnych tkanek przy minimalnych uszkodzeniach.