In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Ten film pokazuje, jak ocenić immunogenność in vivo pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza lub EV za pomocą cytometrii przepływowej. Opisana w niniejszym dokumencie metoda przesiewowa jest stosunkowo łatwa do wykonania i można ją dostosować do różnych ustawień. W przypadku nowotworów identyfikacja stanów immunogennego uwalniania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o szczególnym znaczeniu translacyjnym.

W związku z tym autologiczne EV mogą być stosowane jako spersonalizowane leczenie przeciwnowotworowe. Pierwszą część procedury zademonstruje Tatiana Nedelko, asystentka techniczna z mojego laboratorium. Aby rozpocząć przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych wymaganych do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV, należy zubożyć bydlęce EV w pożywce FCS przez ultrawirowanie w temperaturze 100 000 g przez 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Wyrzuć osad po odwirowaniu. Zbierz mysie komórki czerniaka B16 z ekspresją albuminy jaja kurzego lub komórki B16-OVA z hodowli i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Następnie wysiewaj komórki w stężeniu 400 000 komórek na mililitr w pożywce zubożonej w EV.

Następnie potraktuj komórki B16-OVA 30 mikrogramami oksaliplatyny na mililitr i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z nietraktowanymi próbkami kontrolnymi. Po 24 godzinach zebrać supernatant do odwirowania w temperaturze 400 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzucić osad przed ponownym odwirowaniem w temperaturze 2 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po wyrzuceniu osadu przefiltrować supernatant przez filtr membranowy PVDF o długości 220 nanometrów do świeżej probówki. Następnie wymieszaj 1 mililitr supernatantu z 0,5 mililitra określonego dostępnego w handlu odczynnika do izolacji egzosomów. Zwiruj i przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowych probówek, a następnie przez noc inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odwirować mieszaninę 10 000 razy g przez 60 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po ostrożnym wyrzuceniu supernatantu, usuń pozostałe krople, stukając 1,5 mililitrową rurką do góry nogami w ręcznik papierowy i zasysając przez cienką końcówkę pipety, nie dotykając granulki EV na dnie. Ponownie zawiesić granulat w zimnym PBS, pipetując w górę iw dół, nie rysując granulki końcówką.

Następnie zbierz pojazdy elektryczne ze wszystkich rur. Jeśli nie zużyć natychmiast, przechowuj zawiesiny EV w temperaturze 80 stopni Celsjusza w silikonowanych naczyniach do 28 dni do aplikacji. Aby uodpornić każdą mysz w grupie leczonej EV wyizolowanymi od 4,0 x 10 do piątych komórek B16-OVA, wymieszaj 5 mikrolitrów zawiesiny EV z 55 mikrolitrami zimnego PBS.

Następnie napełnij strzykawki wyposażone w igły o rozmiarze od 26 do 30 60 mikrolitrami rozcieńczonych EV lub PBS, a następnie natychmiast umieść strzykawkę na lodzie. Zaszczepij EV lub PBS podskórnie w przyśrodkowej części uda myszy. Szczepienie należy powtórzyć po siedmiu dniach.

14 dni po pierwszym zabiegu należy złożyć myszy w ofierze w celu wycięcia śledziony. Następnie rozgnieć wyciętą śledzionę za pomocą zwilżonego sitka do komórek o średnicy 100 mikrometrów i plastikowego tłoka strzykawki. Przepłucz komórki śledziony do 50-mililitrowej rurki z 5 do 10 mililitrami chłodnego kompletnego RPMI.

Następnie odwirować komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza przed wyrzuceniem supernatantu. Aby usunąć erytrocyty z zawiesiny komórkowej, należy ponownie zawiesić i inkubować osad komórkowy z 2 mililitrami buforu do lizy czerwonych krwinek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając od pięciu do 10 mililitrów całkowitego RPMI, a następnie odwiruj, jak opisano wcześniej.

Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w pełnym RPMI, policz komórki od każdej myszy i umieść potrójne 200 000 splenocytów z 200 mikrolitrami cRPMI w każdym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Następnie inkubuj płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach potraktuj hodowlę komórkową 5 nanogramami na mililitr Brefeldin A, 20 nanogramami na mililitr PMA i 1 mikrogram na mililitr jonomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 4 godziny.

Po inkubacji przenieś splenocyty na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Zawiesić granulowane splenocyty w świeżo przygotowanym roztworze barwiącym i inkubować zawiesinę komórkową przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. W celu utrwalenia i przepuszczalności należy dwukrotnie przemyć splenocyty w buforze FACS, a następnie ponownie zawiesić splenocyty w 100 mikrolitrach na studzienkę roztworu do utrwalania i przepuszczalności, a następnie inkubować w ciemności, jak wyjaśniono wcześniej.

W celu barwienia wewnątrzkomórkowego interferonu gamma, należy przemyć splenocyty w buforze utrwalającym lub przepuszczalnym przed ponownym wysłaniem komórek z fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko interferonowi gamma rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w buforze. Inkubuj splenocyty przez 1 do 12 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności. Po dokładnym umyciu i ponownym zawieszeniu w buforze FACS, przeanalizuj aktywację cytotoksycznych limfocytów T zgodnie ze strategią bramkowania opisaną w manuskrypcie.

Na reprezentatywnym obrazie przedstawiono strategię bramkowania w celu analizy aktywacji cytotoksycznych limfocytów T. Komórki bramkowano jako pojedyncze komórki, podzbiór limfocytów, żywotne limfocyty T CD3-dodatnie i CD4-ujemne CD8-dodatnie cytotoksyczne limfocyty T. Wewnątrzkomórkową akumulację interferonu gamma oceniano jako zastępczy marker aktywacji.

Po immunizacji EV pochodzącymi z komórek nowotworowych badano indukcję odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u myszy biorców. EV pochodzące z nowotworu hodowane w warunkach stresu genotoksycznego, takiego jak leczenie oksaliplatyną, indukowały silną aktywację cytotoksycznych limfocytów T śledziony w przeciwieństwie do nieleczonych EV. Grupa zwierząt, której podano podłoże, wykazała najniższą odpowiedź.

Aktywację limfocytów T śledziony określono po restymulacji ex vivo w obecności lub braku albuminy jaja kurzego. Produkcja interferonu gamma została zwiększona, gdy splenocyty zwierząt leczonych guzem EV zostały ponownie pomieszane z modelową albuminą jaja kurzego antygenu nowotworowego przed analizą. Należy pamiętać, że powtarzalne wyniki zależą od stałej skuteczności izolacji pojazdów elektrycznych.

Dlatego upewnij się, że pelety EV są całkowicie i szybko zawieszone, aby uniknąć wysuszenia. Dzięki temu protokołowi byliśmy w stanie przeanalizować określone szlaki w komórkach nowotworowych, które określają immunogenność EV pochodzących z komórek nowotworowych. Może to utorować drogę do wykorzystania takich immunogennych pojazdów elektrycznych w leczeniu raka.