Name: In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę oceny immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony. Protokół umożliwia badanie potencjału immunoterapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 oraz Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (dla H.P.), grant badawczy im. Mechtilda Harfa od Fundacji DKMS na rzecz Dawania Życia (dla H.P.) Nagroda dla Młodego Badacza przyznana przez Melanoma Research Alliance (dla S.H.), stypendium Fundacji Else-Kröner-Fresenius (dla F.S.), Fundusz Zalążkowy Uniwersytetu Technicznego w Monachium (do S.H.) oraz grant badawczy Fundacji Wilhelma Sandera (2021.041.1, do S.H.). H. P. jest wspierany przez EMBO Young Investigator Program.
WKŁAD AUTORA:
F.S., H.P. i S.H. zaprojektowali badania, przeanalizowali i zinterpretowali wyniki. F.S. i S.H. napisali rękopis. H.P. i S.H. prowadzili badanie.

Na początku eksperymentów, myszy miały co najmniej 6 tygodni i były utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Niniejszy protokół jest zgodny z instytucjonalnymi standardami etycznymi i obowiązującymi przepisami lokalnymi. Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną agencję regulacyjną (Regierung von Oberbayern, Monachium, Niemcy). Możliwe uprzedzenia związane z płcią nie były badane w tych badaniach.
1. Generowanie i izolacja EV pochodzących z komórek nowotworowych po ekspozycji na chemioterapię
<ol>
	<li>Hodowla mysich komórek czerniaka B16 wykazujących ekspresję albuminy jaja kurzego (B16-OVA) w DMEM (zawierającym 4 mM L-glutaminę i 4,5 g/L D-glukozy) uzupełnioną FCS (10% v/v), penicyliną (100 jednostek/mL) i streptomycyną (100 μg/ml) w temperaturze 37 °C, aż komórki będą stabilnie rosły i będą zlewać się w około 90%. 
	UWAGA: Wykonaj tę sekcję protokołu całkowicie w sterylnych warunkach przy użyciu kaptura do hodowli komórkowych. W przypadku analizy innych jednostek nowotworowych preferowane są linie komórkowe wykazujące ekspresję silnego antygenu w celu oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu, ponieważ pozwalają na specyficzną restymulację antygenu ex vivo.</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych wymaganą do wytworzenia EV, należy zubożyć EV bydła w FCS przez ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić osad. Alternatywnie, wybierz wcześniej komercyjny preparat o niskiej zawartości EV dla zwierząt.</li>
	<li>Zbierz komórki B16-OVA i umyj je dwukrotnie w PBS, a następnie wysiej w stężeniu 400 000 komórek/ml w pożywce zubożonej w EV. 
	UWAGA: Dostosuj stężenie komórek do dynamiki wzrostu badanej linii komórkowej, aby komórki nie przerosły.</li>
	<li>Traktować komórki B16-OVA, dodając 30 μg oksaliplatyny na ml i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Warunki kontrolne pozostawić nieleczone. Przy pierwszym użyciu substancji genotoksycznej miareczkować pożądaną skuteczność cytotoksyczną za pomocą testów żywotności komórek, takich jak wykluczenie błękitu trypanowego18. 
	UWAGA: Ten test może również oceniać EV generowane w hodowlach komórkowych traktowanych innymi substancjami immunomodulującymi lub promieniowaniem jonizującym oprócz chemioterapeutyków. 
	UWAGA: Oksaliplatyna powoduje silne podrażnienie skóry i oczu oraz może powodować reakcję alergiczną skóry i podrażnienie dróg oddechowych. Podejrzewa się, że oksaliplatyna powoduje raka. Jako środek ostrożności należy używać środków ochrony osobistej, w tym odpowiednich rękawiczek, okularów, masek i odzieży, wyczyszczonych przed ponownym użyciem. Unikać inhalacji i dokładnie umyć ręce po użyciu. Unikać uwolnienia do środowiska i utylizować oksaliplatynę zgodnie z obowiązującymi przepisami. Szczegółowe informacje należy uzyskać z karty charakterystyki.</li>
	<li>Zebrać supernatant do hodowli komórkowych. Wirować najpierw przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przy 2 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, za każdym razem odrzucając osad. Na koniec przefiltruj przez membranę PVDF o długości fali 220 nm. Do każdego kroku używaj świeżej tubki, aby usunąć wszelkie resztki komórek. 
	UWAGA: Na tym etapie supernatant zawierający EV może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden dzień przed wznowieniem protokołu. Jednak zdecydowanie zaleca się przestrzeganie opisanego harmonogramu z natychmiastowym oczyszczaniem EV.</li>
	<li>Zmieszać 1 ml supernatantu z 0,5 ml specyficznego dostępnego w handlu odczynnika do izolacji egzosomów (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 1,5 ml w kształcie litery V. Dokładnie pipetuj w górę i w dół lub wiruj, aby uzyskać jednorodny roztwór. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad. Usuń pozostałe krople, stukając rurką o pojemności 1,5 ml do góry nogami w ręcznik papierowy i zasysając przez pipetę z cienką końcówką, nie dotykając granulki EV na dole.
	<ol>
		<li>Dokładnie usuń wszystkie płyny, aby zapobiec niekontrolowanemu rozcieńczeniu granulatu EV. Również wykonuj te zadania szybko, aby zapobiec wysychaniu pelletu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić EV w zimnym PBS, pipetując w górę iw dół, nie rysując końcówką granulatu ze ścianki tuby. Teraz przenieś zawieszenie krok po kroku od pierwszej do ostatniej rury, aby połączyć EVs. 
	UWAGA: Użyj objętości PBS równej 5 μl pomnożonej przez liczbę probówek. 5 μl końcowej zawiesiny zawiera wyizolowane EV uwolnione z 400 000 komórek poddanych chemioterapii lub w stanie stacjonarnym.</li>
	<li>Najlepiej używać pojazdów elektrycznych bezpośrednio. Jeśli nie jest to możliwe, zawiesiny EV należy przechowywać w temperaturze -80 °C w silikonowanych naczyniach do 28 dni do momentu aplikacji. 
	UWAGA: EV opisane tutaj i w kilku innych publikacjach nie tracą swojej funkcji biologicznej, gdy są przechowywane w temperaturze -80 °C przez ten okres czasu19.</li>
	<li>Określ ilościowo i scharakteryzuj izolaty EV zgodnie z wytycznymi MISEV201820. 
	UWAGA: Możliwe metody kwantyfikacji obejmują analizę śledzenia nanocząstek (NTA)21 oraz wykrywanie białek związanych z błoną EV 22. Możliwe podejścia do dalszej charakterystyki EV obejmują mikroskopię elektronową23 i western blot20.</li>
</ol>
2. Immunizacja myszy za pomocą EV
<ol>
	<li>Zaplanuj eksperyment in vivo na myszach C57BL/6 (lub innych myszach syngenicznych odpowiadających linii komórek nowotworowych), w tym grupach otrzymujących EV pochodzące odpowiednio z leczonych komórek, komórek nieleczonych i PBS (nośnika). 
	UWAGA: Najlepiej używać myszy w wieku 6-8 tygodni, aby zapobiec fizjologicznemu starzeniu się i zmniejszeniu odpowiedzi immunologicznej24.</li>
	<li>Zmieszać 5 μl zawiesiny EV z 55 μl zimnego PBS dla każdej myszy w odpowiedniej grupie leczonej, aby uodpornić ją EV wyizolowanymi z komórek B16-OVA o wymiarach 4,0 x 10. 
	UWAGA: Ta ilość EV odpowiada w przybliżeniu cząstkom 2 x 109 zmierzonym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (dane nie pokazane). Białko OVA zmieszane z adiuwantem (np. LPS) może być stosowane jako silna kontrola pozytywna szczepionki.
	<ol>
		<li>Napełnić strzykawki (rozmiar igły 26-30 G) odpowiednio 60 μl rozcieńczonych EV lub PBS i natychmiast umieścić na lodzie. 
		UWAGA: W protokole ilość wstrzykniętych EV jest znormalizowana do liczby komórek nowotworowych uwalniających EV, aby eksperymentalnie rozważyć zarówno jakościowe, jak i ilościowe skutki oksaliplatyny na biogenezę EV komórek nowotworowych. Dla niektórych czytelników normalizacja do określonego stężenia produkowanych pojazdów elektrycznych może lepiej pasować do ich eksperymentalnej konfiguracji, w zależności od ich pytania naukowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepić EV lub PBS podskórnie w przyśrodkowej części uda myszy i powtórzyć szczepienie po 7 dniach. Czternaście dni po pierwszym leczeniu należy złożyć ofiary myszy, np. przez zwichnięcie szyjki macicy, aby przeanalizować odpowiedź immunologiczną. 
	UWAGA: Można zastosować alternatywne drogi wstrzyknięć podskórnych, zgodnie z lokalnymi normami.</li>
</ol>
3. Analiza cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony
<ol>
	<li>Przygotuj i schłodź kompletny RPMI (cRPMI), uzupełniając RPMI-1640 FCS (10% v/v), penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 μg/ml), L-glutaminę (2 mM) i β-merkaptoetanol (50 μM).</li>
	<li>Wyciąć śledzionę z otwartej jamy brzusznej. Rozgnieć śledzionę za pomocą zwilżonego sitka do komórek o wielkości 100 μm i plastikowego tłoka strzykawki, a następnie przepłukać komórki śledziony do probówki o pojemności 50 ml z 5-10 ml cRPMI. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Utrzymuj komórki na lodzie, gdy tylko jest to możliwe. Aby przeanalizować miejscową, a nie śledzionową odpowiedź immunologiczną, należy wyciąć drenujące węzły chłonne podkolanowe i pachwinowe, postępując zgodnie z tym samym protokołem. W takim przypadku pomiń następny krok dotyczący lizy erytrocytów.</li>
	<li>W celu usunięcia erytrocytów z zawiesiny komórkowej należy ponownie zawiesić osad z 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając cRPMI. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Do wysiewu ponownie zawieś osad komórkowy w cRPMI i policz komórki, aby umieścić potrójne 200 000 komórek z 200 μl cRPMI w każdym dołku, używając 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Aby rozwiązać problem swoistości antygenowej aktywowanych limfocytów T, dodaj 1 μg / ml rozpuszczalnej albuminy jaja kurzego (lub innego antygenu nowotworowego odpowiadającego badanej linii komórkowej) lub pozostaw bez dodatkowego bodźca. Dodanie epitopu peptydu SIINFEKL z dominacją immunologiczną zamiast albuminy jaja kurzego o pełnej długości pozwala na krótszy okres inkubacji. Oprócz cytometrii przepływowej, surowica myszy i supernatant kultury komórkowej po 48 godzinach inkubacji mogą być analizowane pod kątem różnych cytokin.</li>
	<li>Po 48 godzinach, w celu wzmocnienia wewnątrzkomórkowego barwienia IFN-γ poprzez, między innymi, blokowanie wydzielania białek za pośrednictwem Golgiego, dodaj do hodowli komórkowej Brefeldin A (5 ng/ml), PMA (20 ng/ml) i jonomycynę (1 μg/ml). Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przed barwieniem biomarkerów powierzchniowych przenieś splenocyty na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i przemyj dwukrotnie PBS. Następnie dodać przeciwciała fluorescencyjne, zgodne z lokalnie dostępnym cytometrem przepływowym, skierowane przeciwko biomarkerom powierzchniowym, CD3, CD8 i CD4 (patrz tabela materiałów), rozcieńczone w stosunku 1:400 oraz możliwy do utrwalenia barwnik żywotności, rozcieńczony w stosunku 1:1,000 w PBS. Zawiesić granulowane splenocyty w roztworze barwiącym i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>W celu utrwalenia i przepuszczalności splenocytów przemyć dwukrotnie w buforze FACS (PBS plus 3% v/v FCS), a następnie ponownie zawiesić w 100 μl buforu do utrwalania/przepuszczalności (patrz tabela materiałów) na studzienkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
	<li>W celu barwienia wewnątrzkomórkowego IFN-γ przemyć splenocyty w buforze utrwalającym/przepuszczalnym i ponownie zawiesić przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko IFN-γ, rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w buforze. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę (maksymalnie do 12 godzin) w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przed pomiarem próbek za pomocą cytometrii przepływowej należy dwukrotnie przemyć splenocyty w buforze utrwalającym/przepuszczalnym i ponownie zawiesić w buforze FACS. Przeanalizuj aktywację cytotoksycznych limfocytów T zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.
	<ol>
		<li>Po pierwsze, aby wykryć pojedyncze komórki, należy osuszyć FSC-H w stosunku do FSC-A. Następnie, aby wykryć komórki limfoidalne, osusz SSC przeciwko FSC-A. Następnie wybierz żywe komórki CD3 +, CD4, CD8 + i określ ich podzbiór wytwarzający IFN-γ, aby określić ilościowo aktywację cytotoksycznych limfocytów T w śledzionie. 
		UWAGA: Dołącz barwnik fluorescencji minus-jeden (FMO) ze wszystkimi fluorochromami z wyjątkiem fluorochromu skierowanego przeciwko IFN-γ jako negatywną kontrolę techniczną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li>
<li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691(2014).</li>
<li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8%2B+T+cell+responses+through+CD8%7Balpha%7D%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li>
<li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li>
<li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer%3A+What+are+the+potential+clinical+ramifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li>
<li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li>
<li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li>
<li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li>
<li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li>
<li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943(2019).</li>
<li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li>
<li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis%3A+a+variation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).</li>
<li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271(2017).</li>
<li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li>
<li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li>
<li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield%2C+purity+and+downstream+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335(2019).</li>
<li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li>
<li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shedding+of+CD62L+%28L-selectin%29+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530(2011).</li>
<li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779(2019).</li>
<li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li>
<li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Protokół ten zapewnia immunologiczną ocenę in vivo EV pochodzących z komórek czerniaka pod wpływem stresu wywołanego chemioterapią, jednocześnie dostosowując się do EV emitowanych z różnych nowotworów w ramach różnych terapii. Na przykład immunizacja myszy EV pochodzącymi z komórek B16-OVA traktowanych oksaliplatyną rozszerza limfocyty T CD8 + wytwarzające IFN-γ w śledzionie, które są dodatkowo stymulowane przez inkubację ex vivo z albuminą jaja kurzego, co wskazuje na odpowiedź immunologiczn...

Układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w walce z rakiem, zarówno gdy jest pobudzany przez hamowanie immunologicznego punktu kontrolnego, jak i dla skuteczności konwencjonalnych terapii przeciwnowotworowych. Komórki nowotworowe poddawane terapiom genotoksycznym, takim jak chemioterapeutyki oksaliplatyna i doksorubicyna lub radioterapia jonizująca, mogą uwalniać antygeny i wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP), które potencjalnie inicjują adaptacyjną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną1. Najbardziej widoczne DAMP, w kontekście immunogennej śmierci komórki, obejmują sygnały typu find-me, takie jak chemotaktyczne ATP, sygnały eat-me, takie jak ekspozycja na kalretykulinę, która promuje wychwyt komórek nowotworowych przez komórki prezentujące antygen, oraz uwalnianie HMGB1, który aktywuje receptory rozpoznawania wzorców, zwiększając w ten sposób krzyżową prezentację antygenów nowotworowych2. Ponadto interferony typu I (IFN-I), indukowane przez immunogenne kwasy nukleinowe pochodzące z nowotworu lub inne bodźce, są wyczuwane przez komórki dendrytyczne, umożliwiając im skuteczne przygotowanie cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla nowotworu3,4. Klinicznie aktywowane i proliferujące limfocyty T CD8 + naciekające guz stanowią niezależny czynnik prognostyczny dla przedłużonego przeżycia u wielu pacjentów z rakiem. Uwolniony z tak aktywowanych limfocytów T, IFN-γ pośredniczy w bezpośrednim działaniu antyproliferacyjnym na komórki nowotworowe i napędza polaryzację Th1 i cytotoksyczne różnicowanie limfocytów T, przyczyniając się w ten sposób do skutecznego nadzoru immunologicznego przeciwko rakowi5,6. Oksaliplatyna jest w dobrej wierze immunogennym induktorem śmierci komórki, pośredniczącym w takiej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko rakowi7. Jednak mnogość początkowych sygnałów immunogennych uwalnianych przez komórki nowotworowe pod wpływem stresu wywołanego terapią nie została w pełni odkryta. Pomimo znacznych postępów w immunoterapii nowotworów, rozszerzenie jej korzyści na większą część pacjentów pozostaje wyzwaniem. Bardziej szczegółowe zrozumienie sygnałów immunogennych, które inicjują aktywację limfocytów T, może pomóc w opracowaniu nowych terapii.
Heterogeniczna grupa struktur zamkniętych w błonie, znanych jako pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), wydaje się służyć jako urządzenia do komunikacji międzykomórkowej. Emitowane przez praktycznie wszystkie typy komórek, EV przenoszą funkcjonalne białka, RNA, DNA i inne cząsteczki do komórki biorcy lub mogą zmieniać stan funkcjonalny komórki tylko poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni komórki. Ich biologicznie aktywny ładunek różni się znacznie w zależności od typu i stanu funkcjonalnego komórki generującej8. W immunologii nowotworów EV uwalniane z komórek nowotworowych są głównie uważane za przeciwstawne wobec immunoterapii, ponieważ ostatecznie sprzyjają inwazyjnemu wzrostowi, tworzą nisze przerzutowe9 i hamują odpowiedź immunologiczną10. W przeciwieństwie do tego, niektóre badania wykazały, że EV mogą przenosić antygeny nowotworowe do komórek dendrytycznych w celu skutecznej prezentacji krzyżowej11,12. EV mogą dostarczać immunostymulujących kwasów nukleinowych, jeśli pojawią się pod wpływem stresu wywołanego terapią, ułatwiając przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną13,14. Ostatnio wykazano, że wykrywanie takich wrodzonych ligandów immunologicznych RNA i DNA w mikrośrodowisku guza znacząco moduluje reakcję na blokadę punktu kontrolnego15,16,17. W związku z tym należy dokładniej wyjaśnić immunogenną rolę EV uwalnianych przez komórki nowotworowe pod wpływem różnego stresu wywołanego terapią. Ponieważ pojazdy elektryczne stanowią młodą, ale rozwijającą się dziedzinę badań, standaryzacja metod jest nadal w toku. W związku z tym dzielenie się wiedzą jest niezbędne do poprawy powtarzalności badań nad interakcjami między EV a immunologią nowotworów. Mając to na uwadze, w niniejszym manuskrypcie opisano prosty protokół oceny immunogennego efektu EV pochodzących z guza in vivo.
Ta ocena jest przeprowadzana poprzez generowanie EV pochodzących z guza, immunizowanie myszy biorców tymi EV i analizowanie limfocytów T śledziony za pomocą cytometrii przepływowej. Wytwarzanie EV idealnie odbywa się poprzez wysiew mysich komórek nowotworowych w pożywce do hodowli komórkowych bez EV w celu uzyskania wysokiego stopnia czystości. Komórki są traktowane specyficznym bodźcem stresowym komórkowym, takim jak chemioterapia, w celu porównania wpływu EV wywołanych terapią z wyjściową immunogennością odpowiednich EV pochodzących z guza. Izolację pojazdów elektrycznych można z powodzeniem przeprowadzić za pomocą różnych technik, które należy wybrać zgodnie z możliwością zastosowania in vivo i lokalną dostępnością. Poniższy protokół opisuje test oparty na strącaniu z komercyjnym zestawem do oczyszczania EV. Myszy są dwukrotnie uodparniane tymi EV. Czternaście dni po pierwszym wstrzyknięciu limfocyty T są ekstrahowane ze śledziony i analizowane pod kątem produkcji IFN-γ za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej. Dzięki temu potencjał EV pochodzących z nowotworu, pojawiających się w różnych schematach terapeutycznych, do indukowania odpowiedzi przeciwnowotworowych limfocytów T jest oceniany stosunkowo łatwo, szybko i z wysoką trafnością13. Dlatego metoda ta nadaje się do immunologicznych badań przesiewowych EV pochodzących z komórek nowotworowych w różnych warunkach.

<table><tbody><tr><td>Anty-CD3 FITC</td><td>Biolegend</td><td>100204</td><td>Clone 17A2</td></tr><tr><td>Anty-CD4 PacBlue</td><td>Biolegend</td><td>100428</td><td>Clone GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td>Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Anti-IFN&gamma; PE</td><td>eBioscience</td><td>RM90022</td><td>Clone XMG1.2</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Biolegend</td><td>420601</td><td>Brefeldin A Solution (1,000x)</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 100 &mikro; m</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>EASYstrainer 100 & mikro; m</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium z D-glukozą (4,5 g/L) i L-glutaminą (4 mM)</td></tr><tr><td>FBS Good Forte</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P40-47500</td><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td><td>eBioscience, oddział Thermo Fischer Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat utrwalający/przepuszczalny</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td>Koncentrat utrwalający/przepuszczalny (10x)</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik utrwalający/przepuszczalny</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>407952</td><td>ze Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &ge; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td>L-Glutamina (200 mM)</td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego</td><td>InvivoGen</td><td>vac-pova</td><td>Albumina jaja kurzego z endotoksyną < 1 EU/mg - CAS 9006-59-1</td></tr><tr><td>Oxaliplatin</td><td>Apteka szpitala</td><td></td><td></td>MRI</tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>1514-122</td><td>Mieszanina penicyliny (10 000 U/ml) i streptomycyny (10 000 ug/mL)</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu, &ge; 99% (HPLC)</td></tr><tr><td>Filtr PVDF, 0,22 &mikro; m, do strzykawek</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV Filter Unit 0,22 i mikro; m Durapore PVDF Membrane</td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11875</td><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Pożywka z D-glukozą (2,00 g/L) i L-glutaminą (300 mg/L), bez</td></tr><tr><td>strzykawki HEPES, 26 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305501</td><td>1 ml Sub-Q Strzykawki z igłą (0,45 mm x 12,7 mm)</td></tr><tr><td>Odczynnik do całkowitej izolacji egzosomów</td><td>Invitrogen</td><td>4478359</td><td>Do izolacji z pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>&beta; -merkaptoetanol</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31350</td><td>&beta; -merkaptoetanol (50 mM)</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów t śledziony

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Immunogenna śmierć komórek nowotworów, spowodowana chemioterapią lub napromienianiem, może wywołać specyficzne dla nowotworu odpowiedzi limfocytów T, uwalniając niebezpieczne wzorce molekularne i indukując produkcję interferonu typu I. Immunoterapie, w tym hamowanie punktów kontrolnych, opierają się przede wszystkim na istniejących wcześniej limfocytach T specyficznych dla nowotworu, aby uzyskać efekt terapeutyczny. W związku z tym synergiczne podejścia terapeutyczne, które wykorzystują immunogenną śmierć komórek jako wewnętrzną szczepionkę przeciwnowotworową, mogą poprawić ich reakcję. Jednak spektrum czynników immunogennych uwalnianych przez komórki pod wpływem stresu wywołanego terapią pozostaje niew pełni scharakteryzowane, zwłaszcza w odniesieniu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Uważa się, że EV, nanocząsteczki błoniaste emitowane z praktycznie wszystkich komórek, ułatwiają komunikację międzykomórkową, a w przypadku raka wykazano, że pośredniczą w krzyżowym primingu przeciwko antygenom nowotworowym. Aby ocenić immunogenny efekt EV pochodzących z nowotworów w różnych warunkach, poszukuje się elastycznych, skalowalnych i ważnych metod. W związku z tym przedstawiono stosunkowo łatwe i solidne podejście do oceny immunogenności pojazdów elektrycznych in vivo. Protokół opiera się na analizie cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony po immunizacji in vivo myszy EVs, wyizolowanych za pomocą testów opartych na strącaniu z kultur komórek nowotworowych w warunkach terapii lub w stanie stacjonarnym. Na przykład praca ta pokazuje, że ekspozycja na oksaliplatynę mysich komórek czerniaka B16-OVA powodowała uwalnianie immunogennych EV, które mogą pośredniczyć w aktywacji cytotoksycznych komórek T reagujących na nowotwór. W związku z tym badania przesiewowe EV za pomocą immunizacji in vivo i cytometrii przepływowej identyfikują warunki, w których mogą pojawić się immunogenne EV. Identyfikacja warunków uwalniania immunogennych EV stanowi niezbędny warunek wstępny do testowania skuteczności terapeutycznej EV przeciwko nowotworom i badania leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych, aby ostatecznie odkryć nowe informacje na temat roli EV w immunologii nowotworów.

Niniejszy protokół ma na celu ułatwienie prostego i łatwo powtarzalnego badania immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzących z guzów. Myszy są inokulowane EVs pochodzącymi z kultur in vitro komórek nowotworowych wykazujących ekspresję modelowego antygenu – owalbuminy kurzej (OVA). Następnie odpowiedź immunologiczną analizuje się w limfocytach T śledziony poprzez cytometrię przepływową.
Rycina 1 przedstawia przegląd praktyczny...

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Ten film pokazuje, jak ocenić immunogenność in vivo pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza lub EV za pomocą cytometrii przepływowej. Opisana w niniejszym dokumencie metoda przesiewowa jest stosunkowo łatwa do wykonania i można ją dostosować do różnych ustawień. W przypadku nowotworów identyfikacja stanów immunogennego uwalniania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o szczególnym znaczeniu translacyjnym.W związku z tym autologiczne EV mogą być stosowane jako spersonalizowane leczenie przeciwnowotworowe. Pierwszą część procedury zademonstruje Tatiana Nedelko, asystentka techniczna z mojego laboratorium. Aby rozpocząć przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych wymaganych do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV, należy zubożyć bydlęce EV w pożywce FCS przez ultrawirowanie w temperaturze 100 000 g przez 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Wyrzuć osad po odwirowaniu. Zbierz mysie komórki czerniaka B16 z ekspresją albuminy jaja kurzego lub komórki B16-OVA z hodowli i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Następnie wysiewaj komórki w stężeniu 400 000 komórek na mililitr w pożywce zubożonej w EV.Następnie potraktuj komórki B16-OVA 30 mikrogramami oksaliplatyny na mililitr i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z nietraktowanymi próbkami kontrolnymi. Po 24 godzinach zebrać supernatant do odwirowania w temperaturze 400 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzucić osad przed ponownym odwirowaniem w temperaturze 2 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Po wyrzuceniu osadu przefiltrować supernatant przez filtr membranowy PVDF o długości 220 nanometrów do świeżej probówki. Następnie wymieszaj 1 mililitr supernatantu z 0,5 mililitra określonego dostępnego w handlu odczynnika do izolacji egzosomów. Zwiruj i przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowych probówek, a następnie przez noc inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Następnego dnia odwirować mieszaninę 10 000 razy g przez 60 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po ostrożnym wyrzuceniu supernatantu, usuń pozostałe krople, stukając 1,5 mililitrową rurką do góry nogami w ręcznik papierowy i zasysając przez cienką końcówkę pipety, nie dotykając granulki EV na dnie. Ponownie zawiesić granulat w zimnym PBS, pipetując w górę iw dół, nie rysując granulki końcówką.Następnie zbierz pojazdy elektryczne ze wszystkich rur. Jeśli nie zużyć natychmiast, przechowuj zawiesiny EV w temperaturze 80 stopni Celsjusza w silikonowanych naczyniach do 28 dni do aplikacji. Aby uodpornić każdą mysz w grupie leczonej EV wyizolowanymi od 4,0 x 10 do piątych komórek B16-OVA, wymieszaj 5 mikrolitrów zawiesiny EV z 55 mikrolitrami zimnego PBS.Następnie napełnij strzykawki wyposażone w igły o rozmiarze od 26 do 30 60 mikrolitrami rozcieńczonych EV lub PBS, a następnie natychmiast umieść strzykawkę na lodzie. Zaszczepij EV lub PBS podskórnie w przyśrodkowej części uda myszy. Szczepienie należy powtórzyć po siedmiu dniach.14 dni po pierwszym zabiegu należy złożyć myszy w ofierze w celu wycięcia śledziony. Następnie rozgnieć wyciętą śledzionę za pomocą zwilżonego sitka do komórek o średnicy 100 mikrometrów i plastikowego tłoka strzykawki. Przepłucz komórki śledziony do 50-mililitrowej rurki z 5 do 10 mililitrami chłodnego kompletnego RPMI.Następnie odwirować komórki w temperaturze 400 razy g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza przed wyrzuceniem supernatantu. Aby usunąć erytrocyty z zawiesiny komórkowej, należy ponownie zawiesić i inkubować osad komórkowy z 2 mililitrami buforu do lizy czerwonych krwinek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając od pięciu do 10 mililitrów całkowitego RPMI, a następnie odwiruj, jak opisano wcześniej.Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w pełnym RPMI, policz komórki od każdej myszy i umieść potrójne 200 000 splenocytów z 200 mikrolitrami cRPMI w każdym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Następnie inkubuj płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach potraktuj hodowlę komórkową 5 nanogramami na mililitr Brefeldin A, 20 nanogramami na mililitr PMA i 1 mikrogram na mililitr jonomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 4 godziny.Po inkubacji przenieś splenocyty na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Zawiesić granulowane splenocyty w świeżo przygotowanym roztworze barwiącym i inkubować zawiesinę komórkową przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. W celu utrwalenia i przepuszczalności należy dwukrotnie przemyć splenocyty w buforze FACS, a następnie ponownie zawiesić splenocyty w 100 mikrolitrach na studzienkę roztworu do utrwalania i przepuszczalności, a następnie inkubować w ciemności, jak wyjaśniono wcześniej.W celu barwienia wewnątrzkomórkowego interferonu gamma, należy przemyć splenocyty w buforze utrwalającym lub przepuszczalnym przed ponownym wysłaniem komórek z fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko interferonowi gamma rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w buforze. Inkubuj splenocyty przez 1 do 12 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności. Po dokładnym umyciu i ponownym zawieszeniu w buforze FACS, przeanalizuj aktywację cytotoksycznych limfocytów T zgodnie ze strategią bramkowania opisaną w manuskrypcie.Na reprezentatywnym obrazie przedstawiono strategię bramkowania w celu analizy aktywacji cytotoksycznych limfocytów T. Komórki bramkowano jako pojedyncze komórki, podzbiór limfocytów, żywotne limfocyty T CD3-dodatnie i CD4-ujemne CD8-dodatnie cytotoksyczne limfocyty T. Wewnątrzkomórkową akumulację interferonu gamma oceniano jako zastępczy marker aktywacji.Po immunizacji EV pochodzącymi z komórek nowotworowych badano indukcję odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u myszy biorców. EV pochodzące z nowotworu hodowane w warunkach stresu genotoksycznego, takiego jak leczenie oksaliplatyną, indukowały silną aktywację cytotoksycznych limfocytów T śledziony w przeciwieństwie do nieleczonych EV. Grupa zwierząt, której podano podłoże, wykazała najniższą odpowiedź.Aktywację limfocytów T śledziony określono po restymulacji ex vivo w obecności lub braku albuminy jaja kurzego. Produkcja interferonu gamma została zwiększona, gdy splenocyty zwierząt leczonych guzem EV zostały ponownie pomieszane z modelową albuminą jaja kurzego antygenu nowotworowego przed analizą. Należy pamiętać, że powtarzalne wyniki zależą od stałej skuteczności izolacji pojazdów elektrycznych.Dlatego upewnij się, że pelety EV są całkowicie i szybko zawieszone, aby uniknąć wysuszenia. Dzięki temu protokołowi byliśmy w stanie przeanalizować określone szlaki w komórkach nowotworowych, które określają immunogenność EV pochodzących z komórek nowotworowych. Może to utorować drogę do wykorzystania takich immunogennych pojazdów elektrycznych w leczeniu raka.

in-vivo-immunogenicity-screening-tumor-derived-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ten film demonstruje immunologiczne wychwytywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą znakowanych fluorescencyjnie koniugatów przeciwciało-magnetyczne nanocząstki wychwytywane. Proces obejmuje tworzenie kompleksów, barwienie fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wykrywającymi, separację magnetyczną i analizę cytometryczną przepływową w celu charakterystyki antygenowej.

Wychwytywanie immunologiczne i cytometria przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu charakterystyki antygenowej

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Protokół przedstawia szczegółowe metody oceny, czy adiuwant nanoemulsji ofiopogoniny D wspomaga skuteczne komórkowe odpowiedzi immunologiczne.

In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Poznaj metodę oceny immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony. Protokół umożliwia badanie potencjału immunoterapii przeciwnowotworowej.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Przeglądaj więcej filmów