Name: Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę oceny skuteczności koktajli bakteriofagowych w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność. Technika wysokoprzepustowa umożliwia szybkie testowanie różnych warunków i optymalizację terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Kanadyjską Fundację Innowacji (Projekt # 38710) oraz Major Innovation Fund, Alberta. Dziękujemy dr. Johnowi Kastelicowi za redakcję manuskryptu.

1. Przygotowanie buforu i odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) (15 g proszku TSB i 500 ml ultraczystej wody) i autoklaw. 
	UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy lub w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 500 ml tryptycznego agaru sojowego (TSA) (20 g proszku TSA i 500 ml ultraczystej wody) i autoklaw. 
	UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 i 0,12 g KH2PO4, 500 ml ultraczystej wody), zmierzyć i dostosować pH do 7,2 ± 0,2 w temperaturze 25 °C i autoklawować 
	UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 200 ml 1 M MgSO4 (49,294 g i 200 ml ultraczystej wody) i wysterylizować przez filtr polieterosulfonowy 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 500 ml TSB z 10 mMMgSO4 (mTSB; 15 g proszku TSB, 500 ml wody ultraczystej i 5 ml 1 MMgSO4) i przelać w autoklawie; pozostawić autoklawowane podłoże do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Zastosuj technikę aseptyczną. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie przenieść 5,0 ml 1 MMgSO4; Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury bakteryjnej
<ol>
	<li>Aby przygotować laboratoryjną hodowlę bakterii (BRLC), wyjmij fiolkę (fiolki) z zamrażarki i przenieś do laboratorium.</li>
	<li>Użyj jednorazowej pętli do zaszczepiania lub jej odpowiednika, zanurz w fiolce, usuń resztki inokulum (zamrożone błoto pośniegowe) i rozprowadź na płytce TSA lub jej odpowiedniku w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu II. Inkubować płytkę w temperaturze 37 ± 2 °C przez 15−18 godzin.</li>
	<li>Przygotowane płytki BRLC należy zapakować w worki i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ogólny termin ważności dla BRLC: 14 dni w temperaturze 4 °C po wygenerowaniu.</li>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię każdego szczepu E. coli O157 z płytek BRLC, które mają być badane, w 10 ml TSB i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 18 godzin, aby osiągnąć 9 log10 CFU/ml.</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenie nocnych kultur (następnego ranka), każdy szczep E. coli O157 przy użyciu mTSB zawierającego 10 mM MgSO4 w celu osiągnięcia 4-5 log10 CFU/ml (lub innego pożądanego poziomu inokulum).</li>
	<li>Wymieszaj równą objętość nocnej kultury każdego szczepu, aby uzyskać łącznie 4-5 log10 CFU/ml (lub według uznania) w celu przygotowania mieszaniny bakteryjnej.</li>
	<li>Rozcieńczoną kulturę bakteryjną należy natychmiast umieścić w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę inokulum 10 lub 100 razy i rozlać 0,1 ml podwielokrotności tych rozcieńczeń na płytki TSA, aby otrzymać izolowane kolonie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów roboczych dla fagów
<ol>
	<li>Rozmnażaj zapasy robocze o wysokim mianie dla każdego faga, który ma być poddany badaniom przesiewowym (≥108 PFU/ml), postępując zgodnie ze standardowymi metodami4. 
	UWAGA: Ogólny okres ważności zapasów fagowych wynosi 3 miesiące w plastikowej butelce w temperaturze 4 °C po wygeneracjeniu.</li>
	<li>Aby osiągnąć pożądane miano, np. ~108 PFU/ml dla kinetyki lizy, należy rozcieńczyć poszczególne preparaty fagowe mTSB zawierającym 10 mMMgSO4. Przygotować koktajle fagowe, mieszając równe objętości każdego materiału roboczego o tym samym mianie we wszystkich możliwych kombinacjach.</li>
</ol>
4. Przygotowanie kinetyki lizy in vitro dla poszczególnych fagów i koktajli fagowych
<ol>
	<li>Przygotować seryjne 10-krotne rozcieńczenia każdego faga w kolumnach 1-8 w sterylnych 96-dołkowych mikropłytkach w celu przeprowadzenia testu mikropłytkowego. 
	UWAGA: Cztery fagi przeciwko jednemu szczepowi bakteryjnemu można testować dwukrotnie, w sąsiednich kolumnach, na każdej płytce. Pozostałe cztery kolumny są przeznaczone dla kontroli, które są bez faga, a także dla mTSB puste (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Umieścić 180 μl mTSB w studzienkach z kolumn od 1 do 12 96-dołkowej mikropłytki.</li>
	<li>Dodać 20 μl rozcieńczonych pojedynczych fagów lub koktajli fagowych (~108 PFU/ml) do studzienek 1-8 górnego rzędu mikropłytki (rząd A).</li>
	<li>W przypadku kontroli bez fagów i ślepej próby dodać 20 μl mTSB do górnej studzienki kolumn 9, 10 i 11.</li>
	<li>Za pomocą pipety 12-kanałowej rozcieńczyć płytkę. Przenieś 20 μl z rzędu do rzędu. Wymieszaj zawartość studzienki przez delikatne, wielokrotne zasysanie, wyrzucanie (co najmniej pięć razy) i zmienianie końcówek między rozcieńczeniami. Usunąć 20 μl z ostatniego rzędu (rząd H). 
	UWAGA: Zaleca się używanie końcówek z filtrami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
	<li>Ustaw zbiornik dla każdego szczepu, użyj pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść 2-3 ml rozcieńczonej kultury do zbiornika. W przypadku kolumn 1-10 użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 20 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej do każdego dołka. Zmieniaj wskazówki między każdym dodawaniem.</li>
	<li>Przykryć i inkubować mikropłytkę w żądanych warunkach (np. 37 °C przez 10 godzin lub 22 °C przez 22 godziny).</li>
	<li>W odstępach 2 godzin lub w innych zalecanych odstępach czasu wyjąć mikropłytki z inkubatora.</li>
</ol>
5. Wyznaczanie gęstości optycznej
<ol>
	<li>Zbadaj gęstość optyczną przy 600 nm (OD600nm) za pomocą czytnika mikropłytek. 
	UWAGA: Zaleca się skonfigurowanie i zapisanie protokołu testu w programie przed przygotowaniem płytki testowej.</li>
	<li>Włącz czytnik mikropłytek i otwórz program.</li>
	<li>Wybierz tryb prosty w oknie Opcje uruchamiania i wybierz Utwórz nowy protokół w Menedżerze zadań (rysunek uzupełniający 1a,b).</li>
	<li>W oknie Select Plate Type (Wybierz typ płytki) wybierz z listy rozwijanej opcję 96 Well Plate (Rysunek uzupełniający 2).</li>
	<li>Wybierz Absorbancję dla metody wykrywania, opcję Punkt końcowy/Kinetyczny dla typu odczytu i Monochromatory dla typu optyki. Kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 3).</li>
	<li>W polu Read Step (Krok odczytu) wprowadź wartość 600 nm dla długości fal i wybierz opcję Normal (Normalna) dla prędkości odczytu. Kliknij OK (Rysunek uzupełniający 4).</li>
	<li>Aby ustawić temperaturę dla testu, kliknij pole wyboru Inkubacja i wybierz Inkubator włączony. Wprowadź żądaną temperaturę w polu Temperatura. Kliknij OK. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej na pokrywie płytki podczas inkubacji, ustaw gradient temperatury, wprowadzając wartość (1-3) w polu Gradient. Kliknij OK (rysunek uzupełniający 5a). 
	UWAGA: Kliknij pole wyboru Podgrzej przed przejściem do następnego kroku dla temperatury inkubacji 37 °C. Ten etap nie jest wymagany w warunkach badania w temperaturze 22 °C (RT).</li>
	<li>Następnie kliknij pole wyboru Kinetic, aby otworzyć Kinetic Setup. Ustaw czas pracy na 10 godzin dla inkubacji w 37 °C lub 22 godziny dla RT. Wprowadź 2 godziny jako interwał odczytu. Kliknij OK (Rysunek uzupełniający 5b).</li>
	<li>Kliknij pole wyboru Potrząśnij w oknie Procedura, aby w razie potrzeby ustawić warunek potrząśnięcia dla każdego odczytu kinetycznego (Rysunek uzupełniający 6a).</li>
	<li>Wybierz Liniowy dla trybów potrząsania i zmień czas trwania na 30 s. Ustaw wartość częstotliwości liniowej na 731 cpm (2 mm), a następnie kliknij OK (Rysunek uzupełniający 6b).</li>
	<li>W oknie dialogowym Podsumowanie protokołu kliknij Układ płytki i wybierz Ślepe próby, Kontrole testu i Próbki. Kliknij Dalej (Rysunek Uzupełniający 7). 
	UWAGA: Wprowadź 1 w liczbie różnych typów kontroli dla kontroli ujemnej.</li>
	<li>Po zdefiniowaniu ustawień dla każdego typu studni kliknij przycisk Zakończ.</li>
	<li>Wybierz identyfikator studni w interfejsie po lewej stronie, a następnie przypisz go do macierzy pokazanej w układzie płyty. Kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 8).</li>
	<li>Kliknij przycisk Read Plate i zapisz protokół jako plik .prt, a następnie kliknij Zapisz (Rysunek uzupełniający 9).</li>
	<li>Włóż tabliczkę i kliknij OK.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu zapisz eksperyment jako plik .xpt i kliknij przycisk Zapisz (Rysunek uzupełniający 10).</li>
	<li>Wyeksportuj dane do programu Excel, klikając przycisk Tak w oknie komunikatu w celu dalszej analizy (Rysunek uzupełniający 11).</li>
	<li>Kliknij opcję Zapisz Tak/Nie i pole wyboru Nie pytaj ponownie, aby zapisać preferencje.</li>
</ol>
6. Analizy danych
<ol>
	<li>Powtórz co najmniej dwa niezależne eksperymenty, jak opisano powyżej. Zbierz wyniki ze wszystkich niezależnych badań. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe OD600 z każdej kultury poddanej działaniu fagów i wolnej od niej.</li>
	<li>Wykonaj pierwiastek kwadratowy z wartości OD przy 600 nm i przeanalizuj je przy użyciu odpowiedniego modelu statystycznego dla każdego szczepu bakterii i temperatury. 
	UWAGA: W przypadku oprogramowania SAS wybierany jest model MIESZANY i metoda najmniejszych kwadratów do różnicowania średnich (P < 0,05). Dla każdego szczepu przypisz panele A−G do każdego leczenia fagowego, którego ogólna skuteczność anty-O157 w czasie i MOI różniła się (P < 0,05).</li>
	<li>Określ doskonałą skuteczność fagów na podstawie wartości OD600 nm ≤ 0,01 odpowiadającej niewykrywalnemu wzrostowi bakterii (granica wykrywalności: 300 CFU / ml).
	<ol>
		<li>Przeanalizuj wpływ czasu, temperatury inkubacji, szczepów E. coli O157, MOI i typów fagów na skuteczność fagów przy użyciu odpowiedniego modelu statystycznego. 
		UWAGA: W przypadku oprogramowania SAS należy użyć GLIMMIX z miarami losowymi.</li>
		<li>Oblicz iloraz szans, aby porównać doskonałą skuteczność dla różnych czynników środowiskowych i biologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li>
<li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li>
<li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+in+bacterial+infections+treatment%3A+one+hundred+years+after+the+discovery+of+bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Escherichia+coli+O157+on+beef+at+37%2C+22+and+4%C2%B0C+by+T5-%2C+T1-%2C+T4-and+O1-like+bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages.</a> Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li>
<li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiololgy%22%5BJournal%5D)">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51(2014).</li>
<li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-based+biocontrol+strategies+and+their+application+in+agriculture+and+aquaculture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).</li>
<li>Bourdin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coverage+of+diarrhoea-associated+Escherichia+coli+isolates+from+different+origins+with+two+types+of+phage+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails.</a> Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).</li>
<li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiololgy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712(2021).</li>
<li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3(2020).</li>
<li>Brüssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li>
<li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li>
<li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+therapy%3A+developments+and+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135(2020).</li>
<li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

W protokole tym opisano solidne podejście do systemowej oceny skuteczności fagów przeciwko patogenom przenoszonym przez żywność, w tym STEC9 i Salmonelli10. Jednym z krytycznych kroków jest rozcieńczanie nocnej hodowli bakterii, użycie wstępnie schłodzonej pożywki i manipulowanie rozcieńczeniem za pomocą wiadra z lodem, aby zminimalizować potencjalny rozwój bakterii. Ponadto przygotowano rozcieńczenie fagów przed rozcieńczeniem kultury bakteryjnej. Etap liczenia 2.8 dostarczył rzeczywistej liczby inokulum bakteryjnego do obliczenia końcowego zastosowanego MOI. Do przygotowania fagów zwykle stosuje się surowe lizaty fagowe przygotowane przez filtracyjny zakażony w 4-6 godzinach hodowli bakteryjnej. Krytycznym etapem związanym z zakaźnością fagów jest zawsze użycie zapasów roboczych fagów przygotowanych w ciągu 3 miesięcy. Niezwykle dokładne pipetowanie (szczególnie w przypadku korzystania z pipet wielokanałowych) i jednolitość podejścia są również niezbędne do uzyskania porównywalnych i możliwych do interpretacji wyników. Zmodyfikowany TSB uzupełniony 10 mM Mg2+ zastosowano do rozcieńczenia fagów, kultury bakteryjnej i pożywki zasadowej w celu optymalizacji adsorpcji i infekcji fagów.
Ponieważ bakterie namnażają się w fazie logarytmicznej, nawet poniżej temperatury inkubatora, zaleca się stosowanie rozcieńczonej hodowli nocnej zamiast hodowli w fazie logarytmicznej, aby zminimalizować potencjalny wzrost bakterii.
Proponowany protokół ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ mikropłytka może pomieścić tylko 200 μl, długotrwała inkubacja może spowodować znaczne parowanie i nie jest zalecana. W takim przypadku test może nie być odpowiedni dla wolno rosnących bakterii. Po drugie, proponowany protokół nie był w stanie monitorować amplifikacji fagów. Po trzecie, protokół ten nie mógł monitorować rozwoju oporności na fagi w czasie, krytycznego czynnika decydującego o wyniku leczenia fagami 11,12. Konieczne są dalsze eksperymenty w celu oceny dalszej skuteczności najbardziej wpływowego koktajlu w badaniach przesiewowych w zapobieganiu pojawianiu się mutantów anty-fagowych w ekstensywnym systemie hodowli bulionu i innych matrycach biologicznych.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych środków przeciwdrobnoustrojowych, biologiczny charakter fagów wpływa na złożoność kontroli biologicznej i zastosowania terapeutycznego w warunkach praktycznych. Konwencjonalnie, racjonalna selekcja koktajli fagowych opiera się przede wszystkim na aktywności litycznej i zakresie gospodarzy fagów. Często zaleca się kandydatów na fagi o najsilniejszej aktywności litycznej i najszerszym zakresie gospodarzy13,14. Jednak w oparciu o obecne badanie, fagi takie jak rV5 i T1, choć same w sobie nie są tak zjadliwe jak T4 i T5, znacznie ułatwiły ogólny wynik kontroli biologicznej w połączeniu z T4 i / lub T5. W związku z tym, aby osiągnąć wyższą skuteczność koktajli fagowych, zaleca się ogólnoustrojowe badania przesiewowe aktywności przeciwbakteryjnej potencjalnych kombinacji fagów przeciwko docelowym szczepom gospodarza w pożądanych warunkach środowiskowych. Ponadto określenie receptorów dla kandydatów na fagi i włączenie fagów do różnych receptorów może zapobiec konkurencji o przyłączenie gospodarza, udaremnić szybki rozwój mutantów antyfagowych i poprawić wyniki kontroli biologicznej13.
Metoda ta umożliwiła dokładne ilościowe określenie kinetyki lizy fagów w formacie wysokoprzepustowym. Co więcej, umożliwiło to systematyczną ocenę różnych czynników biologicznych i środowiskowych pod kątem skuteczności przeciwbakteryjnej asortymentu fagów, ułatwiając w ten sposób formułowanie koktajli fagowych o zoptymalizowanych wynikach. Zakłada się, że przyszłe zastosowania i rozwój metody będą obejmowały monitorowanie in situ skuteczności każdego faga w koktajlach fagowych poprzez znakowanie fluorescencyjne fagów. Oprócz proponowanego protokołu, zrozumienie uwarunkowań genetycznych, które promują synergiczne i ułatwione efekty między fagami podczas jednoczesnego zakażenia jednego gospodarza, ułatwiłoby opracowanie odpowiednich koktajli fagowych o wyższej skuteczności.

Bakteriofagi (fagi) to wirusy, które naturalnie atakują komórki bakteryjne, zakłócając metabolizm bakterii i powodując lizę bakterii. W przeciwieństwie do konwencjonalnych środków przeciwdrobnoustrojowych (np. antybiotyków), widma fagów gospodarzy są stosunkowo wąskie, zdolne do infekowania tylko wybranego zestawu gatunków lub szczepów bakterii, a zatem powinny zminimalizować skutki uboczne dla mikrobioty, które są korzystne dla zdrowia zwierząt i ludzi. Wraz ze wzrostem oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR), fagi i ich pochodne prowadzą do alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych do kontrolowania bakteryjnych chorób zakaźnych, w tym zakażeń bakteryjnych AMR u ludzi i zwierząt1,2. Fagi mają potwierdzony potencjał terapeutyczny przeciwko patogenom bakteryjnym >20, które powodują powierzchowne infekcje oraz infekcje górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego u ludzi3.
W warunkach rolniczych, strategia kontroli biologicznej oparta na fagach polega na terapeutycznym wykorzystaniu fagów do kontroli patogenów bakteryjnych. Biokontrola fagów jest dobrze akceptowana jako zielona technologia, skuteczna w odkażaniu patogenów przenoszonych przez żywność (np. Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC), Salmonella i Listeria) w różnych produktach spożywczych4,5. Ponadto fagi mogą być stosowane jako środki odkażające do dezynfekcji powierzchni przetwarzania żywności i skór zwierzęcych, które można zintegrować z konwencjonalnymi systemami przeciwdrobnoustrojowymi (np. chemikaliami, pasteryzacją parą i gorącą wodą) w celu zwiększenia pożądanych rezultatów i zmniejszenia wpływu na środowisko. Wykorzystanie fagów do redukcji bakterii odzwierzęcych u zwierząt jest również obiecujące1. Istnieje jednak potrzeba sprostania wyzwaniom technicznym w celu poprawy wyników podejścia opartego na kontroli biologicznej fagów, które ma być powszechnie stosowane w różnych systemach produkcji żywności. Głównym wyzwaniem jest upośledzona skuteczność fagów spowodowana rozwojem mutantów opornych na bakterie5 oraz zmiany w fizjologii bakterii spowodowane ekspozycją na stresory środowiskowe6.
W celu zminimalizowania ryzyka oporności na fagi, proponuje się koktajle fagowe (tj. kombinację wielu fagów), które mają zwiększoną siłę kontroli biologicznej w rolnictwie i akwakulturze7. Jednak z kilku badań udowodniono, że koktajle fagowe nie zawsze oferują lepszą skuteczność niż podawanie pojedynczego faga. Na przykład koktajl 3 fagów podobnych do T4 miał węższy zakres gospodarzy w stosunku do szczepów E. coli8. Co więcej, AKFV33, członek tekwintawirusa, miał większą skuteczność niż koktajl czterech fagów w usuwaniu E. coli O157 z wołowiny, pomimo zastosowanych temperatur inkubacji4. Ostatnio doniesiono, że skuteczność poszczególnych fagów nie przewiduje skuteczności koktajli fagowych w kontroli O1579, ponieważ interakcje między wieloma fagami mogą zmieniać skuteczność. Co najważniejsze, wiele czynników, takich jak rodzaje i kombinacje fagów, docelowe szczepy i MOI oraz temperatury i czasy inkubacji, mogą wpływać na interakcje między fagami. Dlatego staranne badanie kombinacji fagów pod kątem określonych bakterii w celu oceny synergii lub ułatwienia fagów, a przynajmniej w celu zapewnienia minimalnego antagonizmu fagów w określonych warunkach środowiskowych, jest niezwykle ważne dla uzyskania optymalnych wyników. W tym miejscu opisano metodę systematycznej oceny skuteczności różnych kombinacji fagów przeciwko patogenom przenoszonym przez żywność w różnych warunkach środowiskowych. Korzyścią płynącą z tego podejścia jest umożliwienie badań przesiewowych wszystkich możliwych czynników biotycznych i abiotycznych, które zgodnie z przewidywaniami wpływają na skuteczność przeciwbakteryjną fagów w warunkach naturalnych. W protokole jako przykład zastosowano STEC O157 i ich infekujące fagi.

<table><tbody><tr><td>Niezbędne materiały, odczynniki i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pętle inokulacyjne</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>1374361</td><td>MgSO4.7H2O</td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Średnica: 100 mm, sterylne</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-300XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014405</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielofunkcyjna Pipet-Lite L12-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014412</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet RT LTS 1000&micro; L FL 768A/8-o niskiej retencji</td> Końcówki do pipet <td>METTLER TOLEDO</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>SR LTS 20&micro; L F 960A/5</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005860</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet SR LTS 300&micro; L 768A/4</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005867</td><td>bez filtra</td></tr><tr><td>Zbiornik</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne, przezroczyste, 96-dołkowe płaskie mikropłytki polistyrenowe z pokrywkami</td><td>Fisher</td><td>168055</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy (TSA)</td><td>Sigma</td><td>105458-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy (TSB)</td><td>Sigma</td><td>105459-0500</td><td></td></tr><tr><td>Komórka w kształcie litery T Rozsiewacze</td><td>VWR</td><td>76299-566</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analogowy mieszalnik wirowy</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowe inkubatory mikrobiologiczne</td><td>Fisher</td><td>50125590H</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z płytami grzejnymi</td><td>FIsher</td><td>13-889-335</td><td></td></tr><tr><td>Wielokątne mieszadła</td><td>FIsher</td><td>14-512-125</td><td>długość: 20 mm</td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Hybrydowy czytnik wielomodowy</td><td>Fisher</td><td>BTNEO2M</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SAS SAS Institute</td><td>9.4</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Patogeny bakteryjne nieustannie stanowią wyzwanie dla systemów bezpieczeństwa żywności na całym świecie. Wraz z rosnącymi obawami o pojawienie się bakterii odpornych na ciepło i środki odkażające, pilnie potrzebne są nowe środki przeciwbakteryjne. Strategia kontroli biologicznej oparta na bakteriofagach polega na terapeutycznym zastosowaniu fagów do zwalczania patogenów bakteryjnych w środowisku rolniczym. Biokontrola fagów jest coraz częściej akceptowana jako zrównoważona technologia, skuteczna w odkażaniu patogenów przenoszonych przez żywność. Aby zapewnić skuteczne wyniki kontroli biologicznej, kluczowe znaczenie ma systematyczne badania przesiewowe kombinacji fagów pod kątem docelowych bakterii w wymaganych warunkach środowiskowych. Na skuteczność przeciwbakteryjną koktajli fagowych mogą mieć wpływ rodzaje i kombinacje fagów, docelowe szczepy bakterii, mnogość infekcji, temperatura i czas. Aby opracować koktajl fagowy o najwyższej skuteczności, zaproponowana metoda polegała na systematycznej ocenie skuteczności poszczególnych fagów i koktajli fagowych w zabijaniu patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność w określonych warunkach. Skuteczność zabijania bakterii monitorowano, mierząc gęstość optyczną w pożądanych temperaturach i czasie trwania. O wyższej skuteczności fagów decydowało całkowite zahamowanie wzrostu bakterii. Proponowana metoda jest solidnym, opartym na dowodach podejściem, które ma ułatwić formułowanie koktajli fagowych o doskonałej skuteczności przeciwbakteryjnej.

Zgodnie z protokołem przeprowadzono porównanie skuteczności fagów anty-O157 w zależności od różnych kombinacji fagów, temperatur, czasów oraz MOI. Wpływ temperatury i czasu inkubacji, MOI, użytych fagów oraz szczepów bakteryjnych na zwiększenie skuteczności przeciwko E. coli O157 przedstawiono w Tabeli 1 (tabela ilorazu szans)9. Przeanalizowano procent (%) pomiarów mętności optycznej ≤ 0,01 dla każdego preparatu fagowego w każdych warunkach doświadczalnych. Na podstawie tej analizy stwierdzono, że skuteczność fagów anty-O157 była najwyższa po 14, 16 lub 18 h inkubacji w temperaturze 22 °C (P &lt; 0,001) oraz przy MOI = 1000 (P &lt; 0,001), przy czym odpowiednio 75% i 89% wzrostu hodowli traktowanej fagami zostało całkowicie zahamowane. Ogólnie, spośród 11 preparatów fagowych, koktajl T1, T4 i rV5 okazał się najskuteczniejszy (P &lt; 0,05) przeciwko O157. Ponadto, w obrębie testowanych temperatur inkubacji, czasów, MOI i fagów, wrażliwość na fagi była zróżnicowana, przy czym spośród badanych szczepów O157 szczep CO281-31N był najbardziej wrażliwy (P &lt; 0,001), a szczep 3081 najmniej wrażliwy (P &lt; 0,001) na działanie fagów.
Aby zrozumieć kinetykę niszczenia bakterii przez fagi dla każdego badanego szczepu bakteryjnego, wartość OD600 narysowano w funkcji czasu pobierania próbek, wartości MOI oraz rodzaju obróbki fagowej dla każdej temperatury inkubacji. Reprezentatywne wyniki skuteczności fagów przeciwko E. coli O157 3081 w temperaturze 37 °C przedstawiono na Rysunku 2. Przed oceną zahamowania krzywej wzrostu w kulturze traktowanej fagami upewniono się, że krzywa wzrostu kultury kontrolnej bez fagów ma normalny przebieg. Zgodnie z Rysunkiem 2, zastosowanie faga T4 całkowicie zahamowało wzrost bakterii w 37 °C w każdym punkcie pomiarowym przy MOI tak niskim jak 1. Aby przedstawić ogólny wpływ fagów na hamowanie wzrostu bakterii w czasie w różnych temperaturach, niezależnie od MOI, średnią wartość OD600nm wyliczoną dla wszystkich MOI (MOI &gt; 0) narysowano w funkcji czasu pobierania próbek i rodzaju obróbki fagowej (Rysunek 3). W porównaniu z 37 °C, skuteczność niszczenia przez konkretne fagi, np. fagi T4 oraz T1 + T4, była wyższa w 22 °C. Inne podejście do podsumowania i porównania ogólnej skuteczności przeciwdziałania O157 różnych fagów przedstawiono w Tabeli 2 i Tabeli 39. Wartość OD600 uśredniono dla każdego czasu pobierania próbek i MOI, a następnie uszeregowano skuteczność fagów od najwyższej (A) do najniższej (F: 37 °C i D: 22 °C). Tabela ta ułatwia identyfikację najskuteczniejszej obróbki fagowej. Na przykład dla szczepu 3081 fagi T4 i T5 + T4 (Panel A) były najskuteczniejszą kuracją w 37 °C, natomiast poza fagiem T4, fagi T1 + T4, T1 + T4 + rV5 oraz koktajle z 4 fagów (Panel A) okazały się najskuteczniejszą kuracją w 22 °C.
Niniejszy protokół pozwolił nam również porównać skuteczność fagów przeciwko różnym szczepom bakteryjnym oraz dostosować przygotowanie fagów. Na przykład podczas wyboru fagów w temperaturze 37 °C, z wyłączeniem szczepu 3081, mieszanina fagów T1 + T4 + rV5 wykazała najwyższą skuteczność przeciwko wszystkim pozostałym szczepom, niezależnie od ich typów fagowych. W temperaturze 22 °C najskuteczniejszy przeciwko wszystkim badanym szczepom był koktajl składający się z 4 fagów. Optymalne wartości MOI doprowadziły do całkowitej lizy (OD600 ≤ 0,01), co wskazywało na potencjalnie wyższą skuteczność w warunkach eksperymentalnych (Tabela 2 i Tabela 3).
<img alt="Schemat testu rozcieńczeń fagowych; płytka wielodołkowa, hodowla bakteryjna, kontrola, układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Sugerowany układ testu na 96-dołkowej mikropłytce. Seryjne 10-krotne rozcieńczenia każdego faga są przygotowywane w kolumnach 1-8 sterylnych mikropłytek 96-dołkowych. Cztery fagi przeciwko jednemu szczepowi bakterii mogą być testowane w dubletach, w sąsiednich kolumnach, na każdej płytce. Pozostałe kolumny służą jako kontrole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe wzrostu szczepów bakteryjnych, OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; w funkcji czasu (h), analiza wykresu dla wielu warunków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Krzywe wzrostu szczepu 3081 E. coli O157 w 37 °C poddanego i niepoddanego działaniu fagów przy poszczególnych wartościach MOI. Dane zostały zestawione z dwóch niezależnych prób. Słupki przedstawiają odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wydajność terapii fagowej; OD600nm vs czas; krzywe wzrostu; analiza porównawcza; dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Krzywe wzrostu szczepów 3081 E. coli O157. (A) Krzywe wzrostu w 37 °C. (B) Krzywe wzrostu w 22 °C. Każda krzywa reprezentuje kultury pojedyncze i mieszane, poddane oraz niepoddane działaniu fagów przy różnych MOI. Dane zostały zestawione z dwóch niezależnych prób. Słupki przedstawiają standardowy błąd średniej (zaadaptowano z Referencji9 za zgodą). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Ilorazy szans porównujące prawdopodobieństwo wyższej skuteczności fagów przeciwko E. coli O157 w zależności od temperatury inkubacji, czasu inkubacji, MOI, rodzajów fagów oraz szczepów E. coli O157 (zaadaptowano z literatury9 za zgodą autora). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Ogólna skuteczność fagów przeciwko E. coli O157 w temperaturze 37 °C (zaadaptowano z publikacji9 za zgodą autorów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Ogólna skuteczność fagów przeciwko E. coli O157 w temperaturze 22 °C (zaadaptowano z referencji9 za zgodą). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>
Ryciny uzupełniające 1-11: Zrzuty ekranu z działania i procedur czytnika mikropłytek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje solidną metodę korzystania z ustawień o wysokiej przepustowości do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych.

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Ten łatwy do wykonania protokół ocenia skuteczność przeciwbakteryjną różnych kombinacji bakteriofagów, znanych również jako koktajle fagowe, w różnych warunkach w warunkach wysokiej przepustowości. Głównymi zaletami tej techniki jest możliwość strumieniowania różnych biotyków i czynników abiotycznych, takich jak temperatura, które mogą wpływać na skuteczność fagów w różnych warunkach środowiskowych. Metoda ta może ułatwić projektowanie odpowiednich koktajli fagowych w celu poprawy kontroli biologicznej i wyników terapeutycznych oraz określenia interakcji między gospodarzami bakteryjnymi a bakteriofagami.Na początek należy skonfigurować test mikropłytek za pomocą końcówek z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Najpierw dodaj 180 mikrolitrów mTSB do studzienek kolumn od 1 do 12 96-dołkowej mikropłytki, a następnie przygotuj seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia każdego faga w kolumnach od jednej do ośmiu sterylnych 96-dołkowych mikropłytek, aby ustawić test. Dodaj 20 mikrolitrów pojedynczych fagów lub koktajli fagowych do studzienek od jednej do ośmiu górnego rzędu A mikropłytki.W celu kontroli bez fagów i ślepej próby, dodaj 20 mikrolitrów mTSB do górnej studzienki kolumn od dziewięciu do 12. Podczas pipetowania wymieszać zawartość studzienki z delikatnym i wielokrotnym zasysaniem co najmniej pięć razy i zmienianiem końcówek między rozcieńczeniami. Usuń 20 mikrolitrów z ostatniego rzędu H, a następnie ustaw zbiornik na badany szczep bakteryjny, przenosząc od dwóch do trzech mililitrów rozcieńczonej kultury do zbiornika za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 20 mikrolitrów rozcieńczonej kultury bakteryjnej do każdego dołka w kolumnach od 1 do 10, zmieniając końcówki między każdym dodawaniem. Przykryj i inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W odstępach dwugodzinnych wyjmować mikropłytkę z inkubatora i odczytywać ją za pomocą czytnika mikropłytek.Alternatywnie, należy inkubować płytkę w czytniku mikropłytek i odczytywać ją z czasem. Aby zbadać gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek, otwórz program na czytniku mikropłytek. Wybierz tryb prosty w oknie opcji uruchamiania, a następnie wybierz Utwórz nowy protokół w Menedżerze zadań.W oknie Select Plate Type (Wybierz typ płytki) wybierz z listy rozwijanej opcję Plate (Płytka 96-dołkowa). Jako metodę wykrywania wybierz Absorbancja jako typ odczytu, wybierz opcję Punkt końcowy/kinetyczny jako typ optyki, wybierz opcję Monochromatory, a następnie kliknij przycisk OK. W polu Read Step (Krok odczytu) wprowadź 600 nanometrów dla długości fal, wybierz Normal (Normalna) dla prędkości odczytu i kliknij przycisk OK.To ustaw temperaturę dla testu, kliknij pole wyboru Inkubacja i wybierz opcję Inkubator włączony.Wprowadź żądaną temperaturę w polu temperatury, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij pole wyboru Podgrzej przed przejściem do następnego kroku dla temperatury inkubacji 37 stopni Celsjusza, chociaż opcja ta nie jest wymagana w warunkach testowych w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej na pokrywie płytki podczas inkubacji, ustaw gradient temperatury, wprowadzając wartość w polu gradientu, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie kliknij pole wyboru Kinetyczny, aby otworzyć konfigurację kinetyczną.Ustaw czas pracy na 10 godzin dla inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub 22 godziny dla temperatury pokojowej i wprowadź dwie godziny jako interwał odczytu, a następnie kliknij OK. Kliknij pole wyboru Potrząśnij w oknie procedury, aby ustawić warunek potrząśnięcia, jeśli jest to potrzebne dla każdego odczytu kinetycznego. Wybierz opcję Liniowy jako tryb potrząsania i zmień czas trwania na 30 sekund. Ustaw wartość częstotliwości liniowej na 731 cykli na minutę, a następnie kliknij OK.In oknie dialogowym podsumowania protokołu, kliknij Układ płytki, wybierz Ślepe próby, Kontrole testu i Próbki, a następnie kliknij Dalej.Po zdefiniowaniu ustawień dla każdego typu studni kliknij przycisk Zakończ. Wybierz identyfikator studni w interfejsie po lewej stronie, przypisz go do macierzy pokazanej w oknie Układ płyt, a następnie kliknij OK. Kliknij przycisk Read Plate, zapisz protokół jako plik prt i kliknij Zapisz. Włóż tabliczkę i kliknij OK. Po zakończeniu eksperymentu zapisz go jako plik xpt i kliknij przycisk Zapisz.Wyeksportuj dane do Excela, klikając przycisk Tak w oknie wiadomości w celu dalszej analizy. Kliknij opcję Zapisz tak/Nie i pole wyboru Nie pytaj ponownie, aby zapisać preferencje. Zgodnie z protokołem przeprowadzono porównanie skuteczności fagów z różnymi kombinacjami fagów, temperaturami, czasami i wielością infekcji lub MOI.Na podstawie tej analizy skuteczność faga anty-O157 została zmaksymalizowana po 14, 16 lub 18 godzinach inkubacji w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby zrozumieć kinetykę zabijania fagów przez bakterie, wartości OD przy 600 nanometrach wykreślono w stosunku do czasu pobierania próbek, MOI i leczenia fagowego. Pokazano reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza poddanych działaniu promieni Celsjusza.T4 całkowicie hamował rozwój bakterii przy każdym pobieraniu próbek, nawet przy niskim MOI. Aby przeanalizować hamujący wzrost bakterii, średnie wartości OD ze wszystkich MOI wykreślono dla każdego czasu pobierania próbek i traktowania fagów. Reprezentatywne wykresy w dwóch temperaturach ujawniły, że skuteczność zabijania fagów, na przykład dla T1 i T4, była zwiększona przy 22 stopniach Celsjusza w porównaniu do 37 stopni Celsjusza.Pokazano porównanie ogólnej skuteczności fagów, co ułatwia określenie najlepszego leczenia fazowego. Na przykład w przypadku szczepu Escherichia coli 3081 leczenie fagami T4 i T5 plus T4 było najskuteczniejszym leczeniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jednak w temperaturze 22 stopni Celsjusza, oprócz T4, skuteczne były fagi T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 i cztery koktajle fagowe.Podczas wykonywania tej procedury niezbędne jest niezwykle dokładne pipetowanie, szczególnie w przypadku korzystania z pipety wielokanałowej, oraz jednolitość podejścia w celu uzyskania porównywalnych i możliwych do interpretacji wyników. Konieczne są dalsze eksperymenty w celu oceny dalszej wydajności najbardziej wpływowego koktajlu w badaniach przesiewowych, zapobiegając pojawieniu się mutantów antyfagowych w ekstensywnym systemie hodowli bulionu i innych matrycach biologicznych.

bacteriophage-effectiveness-for-biocontrol-foodborne-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Opisujemy prostą metodę badania kultur bakteryjnych pod kątem produkcji związków hamujących inne bakterie.

Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie

Powtarzalna, dokładna i efektywna czasowo metoda ilościowego PCR (qPCR) do oznaczania bakteriofagów T7 jest opisana tutaj. Protokół jasno opisuje przygotowanie genomowego DNA fagowego, przygotowanie reakcji PCR, warunki cykliczne qPCR i analizę danych qPCR.

Ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Ten protokół umożliwia ujawnienie wpływu profagów na ich gospodarzy. Kultury bakteryjne są synchronizowane w warunkach, które najlepiej wspierają stan lizogeniczny, ograniczając spontaniczną indukcję. RT-qPCR jednoznacznie odróżnia geny ograniczone do profagów i te niesprzężone z kontroli fagów od tych, które ulegają ekspresji podczas cyklu replikacji litycznej.

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Opisano metodę mikropłytek opartą na gęstości optycznej, która pozwala określić ilościowo długoterminowy wzrost bakterii w obecności bakteriofagów, odpowiednich dla promieniowców i innych wolno rosnących bakterii. Metoda ta obejmuje modyfikacje mające na celu zmniejszenie parowania i kondensacji pokrywy oraz kod R do obliczania wskaźników infekcji wirusowej, w tym obszaru pod krzywą, maksimum wzrostu i względnej zjadliwości.

Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Bakteriofagi, wszechobecne i różnorodne na Ziemi, infekują i namnażają się w organizmach bakteryjnych, odgrywając kluczową rolę w ekosystemach mikrobiologicznych. Pomimo ich znaczenia, ich obecność może zakłócić procesy przemysłowe. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą lipopolisacharydy bakteryjne do eliminacji bakteriofagów z kultur Salmonelli.

Usuwanie bakteriofagów z zakażonych kultur salmonelli

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj metodę oceny skuteczności koktajli bakteriofagowych w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność. Technika wysokoprzepustowa umożliwia szybkie testowanie różnych warunków i optymalizację terapii.

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów