Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości
19 sierpnia 2021
Ten protokół opisuje solidną metodę korzystania z ustawień o wysokiej przepustowości do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych.
Ten łatwy do wykonania protokół ocenia skuteczność przeciwbakteryjną różnych kombinacji bakteriofagów, znanych również jako koktajle fagowe, w różnych warunkach w warunkach wysokiej przepustowości. Głównymi zaletami tej techniki jest możliwość strumieniowania różnych biotyków i czynników abiotycznych, takich jak temperatura, które mogą wpływać na skuteczność fagów w różnych warunkach środowiskowych. Metoda ta może ułatwić projektowanie odpowiednich koktajli fagowych w celu poprawy kontroli biologicznej i wyników terapeutycznych oraz określenia interakcji między gospodarzami bakteryjnymi a bakteriofagami.
Na początek należy skonfigurować test mikropłytek za pomocą końcówek z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Najpierw dodaj 180 mikrolitrów mTSB do studzienek kolumn od 1 do 12 96-dołkowej mikropłytki, a następnie przygotuj seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia każdego faga w kolumnach od jednej do ośmiu sterylnych 96-dołkowych mikropłytek, aby ustawić test. Dodaj 20 mikrolitrów pojedynczych fagów lub koktajli fagowych do studzienek od jednej do ośmiu górnego rzędu A mikropłytki.
W celu kontroli bez fagów i ślepej próby, dodaj 20 mikrolitrów mTSB do górnej studzienki kolumn od dziewięciu do 12. Podczas pipetowania wymieszać zawartość studzienki z delikatnym i wielokrotnym zasysaniem co najmniej pięć razy i zmienianiem końcówek między rozcieńczeniami. Usuń 20 mikrolitrów z ostatniego rzędu H, a następnie ustaw zbiornik na badany szczep bakteryjny, przenosząc od dwóch do trzech mililitrów rozcieńczonej kultury do zbiornika za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.
Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 20 mikrolitrów rozcieńczonej kultury bakteryjnej do każdego dołka w kolumnach od 1 do 10, zmieniając końcówki między każdym dodawaniem. Przykryj i inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W odstępach dwugodzinnych wyjmować mikropłytkę z inkubatora i odczytywać ją za pomocą czytnika mikropłytek.
Alternatywnie, należy inkubować płytkę w czytniku mikropłytek i odczytywać ją z czasem. Aby zbadać gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek, otwórz program na czytniku mikropłytek. Wybierz tryb prosty w oknie opcji uruchamiania, a następnie wybierz Utwórz nowy protokół w Menedżerze zadań.
W oknie Select Plate Type (Wybierz typ płytki) wybierz z listy rozwijanej opcję Plate (Płytka 96-dołkowa). Jako metodę wykrywania wybierz Absorbancja jako typ odczytu, wybierz opcję Punkt końcowy/kinetyczny jako typ optyki, wybierz opcję Monochromatory, a następnie kliknij przycisk OK. W polu Read Step (Krok odczytu) wprowadź 600 nanometrów dla długości fal, wybierz Normal (Normalna) dla prędkości odczytu i kliknij przycisk OK.To ustaw temperaturę dla testu, kliknij pole wyboru Inkubacja i wybierz opcję Inkubator włączony.Wprowadź żądaną temperaturę w polu temperatury, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij pole wyboru Podgrzej przed przejściem do następnego kroku dla temperatury inkubacji 37 stopni Celsjusza, chociaż opcja ta nie jest wymagana w warunkach testowych w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej na pokrywie płytki podczas inkubacji, ustaw gradient temperatury, wprowadzając wartość w polu gradientu, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie kliknij pole wyboru Kinetyczny, aby otworzyć konfigurację kinetyczną.
Ustaw czas pracy na 10 godzin dla inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub 22 godziny dla temperatury pokojowej i wprowadź dwie godziny jako interwał odczytu, a następnie kliknij OK. Kliknij pole wyboru Potrząśnij w oknie procedury, aby ustawić warunek potrząśnięcia, jeśli jest to potrzebne dla każdego odczytu kinetycznego. Wybierz opcję Liniowy jako tryb potrząsania i zmień czas trwania na 30 sekund. Ustaw wartość częstotliwości liniowej na 731 cykli na minutę, a następnie kliknij OK.In oknie dialogowym podsumowania protokołu, kliknij Układ płytki, wybierz Ślepe próby, Kontrole testu i Próbki, a następnie kliknij Dalej.
Po zdefiniowaniu ustawień dla każdego typu studni kliknij przycisk Zakończ. Wybierz identyfikator studni w interfejsie po lewej stronie, przypisz go do macierzy pokazanej w oknie Układ płyt, a następnie kliknij OK. Kliknij przycisk Read Plate, zapisz protokół jako plik prt i kliknij Zapisz. Włóż tabliczkę i kliknij OK. Po zakończeniu eksperymentu zapisz go jako plik xpt i kliknij przycisk Zapisz.
Wyeksportuj dane do Excela, klikając przycisk Tak w oknie wiadomości w celu dalszej analizy. Kliknij opcję Zapisz tak/Nie i pole wyboru Nie pytaj ponownie, aby zapisać preferencje. Zgodnie z protokołem przeprowadzono porównanie skuteczności fagów z różnymi kombinacjami fagów, temperaturami, czasami i wielością infekcji lub MOI.
Na podstawie tej analizy skuteczność faga anty-O157 została zmaksymalizowana po 14, 16 lub 18 godzinach inkubacji w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby zrozumieć kinetykę zabijania fagów przez bakterie, wartości OD przy 600 nanometrach wykreślono w stosunku do czasu pobierania próbek, MOI i leczenia fagowego. Pokazano reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza poddanych działaniu promieni Celsjusza.
T4 całkowicie hamował rozwój bakterii przy każdym pobieraniu próbek, nawet przy niskim MOI. Aby przeanalizować hamujący wzrost bakterii, średnie wartości OD ze wszystkich MOI wykreślono dla każdego czasu pobierania próbek i traktowania fagów. Reprezentatywne wykresy w dwóch temperaturach ujawniły, że skuteczność zabijania fagów, na przykład dla T1 i T4, była zwiększona przy 22 stopniach Celsjusza w porównaniu do 37 stopni Celsjusza.
Pokazano porównanie ogólnej skuteczności fagów, co ułatwia określenie najlepszego leczenia fazowego. Na przykład w przypadku szczepu Escherichia coli 3081 leczenie fagami T4 i T5 plus T4 było najskuteczniejszym leczeniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jednak w temperaturze 22 stopni Celsjusza, oprócz T4, skuteczne były fagi T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 i cztery koktajle fagowe.
Podczas wykonywania tej procedury niezbędne jest niezwykle dokładne pipetowanie, szczególnie w przypadku korzystania z pipety wielokanałowej, oraz jednolitość podejścia w celu uzyskania porównywalnych i możliwych do interpretacji wyników. Konieczne są dalsze eksperymenty w celu oceny dalszej wydajności najbardziej wpływowego koktajlu w badaniach przesiewowych, zapobiegając pojawieniu się mutantów antyfagowych w ekstensywnym systemie hodowli bulionu i innych matrycach biologicznych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę wykorzystania ustawień wysokoprzepustowych do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych. Technika ta pozwala na ocenę różnorodnych kombinacji fagów w zmiennych warunkach w celu poprawy wyników terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Terapia fagowa
- Przesiewy antybakteryjne
Wprowadzenie
- Bakteriofagi to wirusy infekujące bakterie, które mogą być wykorzystywane jako środki biologicznej kontroli.
- Koktajle fagowe mogą zwiększyć skuteczność leczenia infekcji bakteryjnych.
- Przesiewy wysokoprzepustowe umożliwiają jednoczesną ocenę wielu warunków.
- Zrozumienie interakcji między fagami a gospodarzami bakteryjnymi jest kluczowe dla skutecznej terapii.
Cel badania
- Ocena skuteczności przeciwbakteryjnej różnych koktajli fagowych.
- Określenie wpływu czynników środowiskowych na efektywność fagów.
- Ułatwienie projektowania zoptymalizowanych terapii fagowych w zwalczaniu infekcji bakteryjnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie analizy na płytkach wielodołkowych z rozcieńczeniami seryjnymi fagów.
- Inkubacja płytek wielodołkowych w kontrolowanych temperaturach.
- Pomiary gęstości optycznej przy 600 nm w celu oceny wzrostu bakterii.
- Analiza danych w celu porównania skuteczności fagów w różnych warunkach.
Główne wyniki
- Fag T4 skutecznie hamował wzrost bakterii przy niskiej wielokrotności zakażenia (MOI).
- Optymalna skuteczność fagów została zaobserwowana przy określonych czasach i temperaturach inkubacji.
- Koktajle fagowe wykazywały zróżnicowaną skuteczność w zależności od szczepu bakteryjnego i warunków.
- Precyzyjne pipetowanie oraz jednolitość podejścia były kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia systematyczne podejście do oceny koktajli fagowych.
- Konieczne są dalsze badania w celu oceny skuteczności najefektywniejszych kombinacji fagów.
- Zrozumienie interakcji między fagami a bakteriami może prowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Systematyczna ocena wysokoprzepustowa koktajli bakteriofagowych umożliwia szybką, ilościową ocenę skuteczności przeciwbakteryjnej wobec patogenów przenoszonych przez żywność w różnorodnych warunkach środowiskowych. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną w wyborze środków biologicznej kontroli i minimalizuje ryzyko przy podejmowaniu wczesnych decyzji dotyczących portfela nowych strategii przeciwbakteryjnych. Integracja rzetelnych danych przesiewowych przyspiesza przejście od etapu odkrywania do skalowalnych rozwiązań z zakresu biokontroli w bezpieczeństwie żywności i biotechnologii rolniczej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę interakcji fage-bakterie w obrębie wielu szczepów i w różnych warunkach.
- Wspiera walidację funkcjonalną kandydowanych koktajli fagowych do ukierunkowanej kontroli patogenów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyk mechanistycznych poprzez ujawnianie zależności skuteczności fagów od czynników środowiskowych.
- Zapewnia priorytetyzację opartą na danych dla dalszego rozwoju środków biologicznej kontroli.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowane i powtarzalne testy na mikropłytkach do wysokoprzepustowego screeningu skuteczności fagów.
- Generuje ilościowe odczyty gęstości optycznej do bezpośredniego porównania działań fagów.
- Umożliwia skalowalną ocenę kombinacji fagowych, wartości MOI oraz zmiennych środowiskowych.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych procesów optymalizacji i opracowywania formulacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje wyniki przesiewowe do potrzeb translacyjnych w zakresie bezpieczeństwa żywności oraz zastosowań w biologicznej kontroli w rolnictwie.
- Wspiera ciągłość procesu od odkryć in vitro do walidacji przedklinicznej w odpowiednich macierzach.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój koktajli fagowych o najwyższych profilach skuteczności.
- Dostarcza informacji mechanistycznych służących do opracowania strategii zarządzania opornością.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta wysokoprzepustowa metoda przesiewowa łączy wczesną fazę odkryć z identyfikacją wiodących kandydatów w biologicznej kontroli opartej na fagach, wspierając oparty na danych wybór i optymalizację potencjalnych koktajli.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa interakcje fag-bakteria i wyjaśnia determinanty skuteczności w zmiennych warunkach.
- Przesiewanie: Standaryzuje warunki analizy i umożliwia odtwarzalną, skalowalną ocenę skuteczności fagów.
- Analityka: Zapewnia kinetyczne pomiary gęstości optycznej dla rzetelnego porównania statystycznego poszczególnych wariantów.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście z przesiewania in vitro do oceny przedklinicznej w kontekście bezpieczeństwa żywności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do ciągłej optymalizacji koktajli fagowych i monitorowania oporności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze fagów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w zakresie skuteczności biokontroli.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów przesiewowych przeciwbakteryjnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera świadome podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne wykorzystanie kapitału przy rozwoju kandydatów do biokontroli.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój koktajli fagowych o najwyższych profilach wydajności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikrobiologii, biologii fagów oraz projektowania testów ilościowych.
- Niezbędny jest dostęp do czytników mikropłytek, kontrolowanej inkubacji oraz infrastruktury do analizy danych.
- Wymagana jest rygorystyczna technika pipetowania oraz standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów bakteryjnych lub matryc środowiskowych.
- W celu postępów w badaniach translacyjnych niezbędna jest walidacja uzupełniająca w układach biologicznych o większej skali lub o wysokim stopniu złożoności.
