Formulacja i modulacja akustyczna optycznie odparowanych nanokropel perfluorowęglowodoru
July 16th, 2021
Optycznie aktywowane nanokropelki perfluorocarbonu są obiecujące w zastosowaniach obrazowania poza układem naczyniowym. W tym artykule pokażemy, jak syntetyzować te cząstki, sieciować fantomy poliakrylamidu i modulować kropelki akustycznie, aby wzmocnić ich sygnał.
Protokół ten pozwala na prostą i szybką syntezę optycznie odparowanych nanokropel perfluorowęglowych i zapewnia metodę zwiększania wydajności tych cząstek. Wersja osobista pozwala na zwiększenie kontrastu poprzez manipulację fazą obrazowania ultrasonograficznego w pierwszej kolejności. Nie wymaga dodatkowego sprzętu i może być wykonywany na dowolnym programowalnym systemie ultrasonograficznym.
Rozpocząć od przepłukania 10-mililitrowej kolby okrągłodennej chloroformem i wypłukać 10-mililitrową i jedną mililitrową strzykawkę ze szkła gazoszczelnego chloroformem, kilkakrotnie zasysając pełną objętość strzykawki i wydychając ją w sumie trzy razy. Za pomocą strzykawek dodaj 200 mikrolitrów po 25 miligramów na mililitr DSPE-mPEG-2000, osiem mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr DSPC i jeden mililitr po mililitr IR-1048 do kolby okrągłodennej. Należy pamiętać o oczyszczeniu strzykawek między lipidami lub barwnikiem, aby zapobiec zanieczyszczeniu zapasu.
Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej. Upewnij się, że podciśnienie jest powoli dostosowywane do 332 milibarów, aby zapobiec uderzeniom. Po pięciu minutach zmniejsz ciśnienie do 42 milibarów, aby usunąć wodę, która mogła dostać się do roztworu.
Zawiesić ciastko lipidowe w jednym mililitrze PBS i sonikować lub wirować w temperaturze pokojowej przez pięć minut lub do momentu, gdy całe ciastko lipidowe zostanie zawieszone i rozpuszczone w roztworze. Przenieść roztwór do szklanej fiolki o pojemności siedmiu mililitrów i umieścić fiolkę w szklanym naczyniu wypełnionym lodem, aby roztwór ostygł przez pięć minut. Wypłukać gazoszczelną szklaną strzykawkę z perfluoroheksanem.
Następnie dodać 50 mikrolitrów perfluoroheksanu do fiolki za pomocą strzykawki. Sonda sonikuje mieszaninę z amplitudą ustawioną na jeden, czasem procesu ustawionym na 20 sekund, impulsem włączonym ustawionym na jedną sekundę i impulsem wyłączonym ustawionym na pięć sekund. Następnie zmień ustawienia zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i ponownie poddaj mieszaninę sonikacji.
Przenieś roztwór nano kropelek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przy 300 g przez trzy minuty, aby oddzielić większe kropelki, które mają więcej niż jeden mikrometr od mniejszych kropel. Wyrzuć osad i przenieś supernatant do innej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Przemyć sklarowany szwanek, odwirowując stężenie 3 000 g przez pięć minut, aby wszystkie kropelki znalazły się w roztworze.
Ponownie zawiesić PFCnD w jednym mililitrze PBS, pipetując osad w górę iw dół, a następnie sonikować w kąpieli sonicater przez jedną minutę. Rozcieńczyć podstawowe PFCnD 100 razy, dodając 10 mikrolitrów PFCnD do 990 mikrolitrów PBS i zanurzyć w kąpieli w celu rozproszenia PFCnD przed pomiarem ich wielkości. Zmierz wielkość kropel za pomocą dynamicznego rozpraszania światła.
Odgazuj wodę, napełniając 500-mililitrową kolbę próżniową 400 mililitrami wody dejonizowanej, uszczelnij gumowym korkiem i podłącz kolbę do przewodu próżniowego. Otwórz przewód podciśnieniowy i zanurz dno kolby w sonicaterze wanny. Sonikować przez pięć minut lub do momentu, gdy nie będzie widać tworzenia się pęcherzyków gazu.
Przygotuj 10% amonu na roztwór siarczanu, rozpuszczając 500 miligramów w pięciu mililitrach odgazowanej wody. Delikatnie zamieszaj roztwór, jeśli nadsiarczan amonu nie rozpuści się całkowicie. W 400-mililitrowej zlewce z mieszadłem na płytce mieszającej dodaj 150 mililitrów odgazowanej wody i 50 mililitrów 40 roztworu bisakryloamidu, aby uzyskać 200 mililitrów 10% roztworu bisakryloamidu.
Mieszaj mieszaninę z prędkością 200 obr./min, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie bez wprowadzania bąbelków. Odważyć 400 miligramów krzemionki i dodać ją do 10% roztworu bisakryloamidu akryloamidu, aby utworzyć 0,2% roztworu krzemionki i akrylamidu. Przygotuj kwadratową formę z cylindrycznym wtrąceniem, odcinając końcówki z plastikowej pipety transferowej i podtrzymując ją w formie taśmą laboratoryjną.
Dodaj dwa mililitry 10% roztworu nadsiarczanu amonu do zlewki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% i dodaj 250 mikrolitrów TEMED do roztworu fantomowego. Pozostaw roztwór do mieszania przez mniej niż minutę. Szybko wlej roztwór do formy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.
Roztwór powinien polimeryzować w ciągu 10 minut. Usuń fantom, przesuwając płaski koniec szpatułki laboratoryjnej wokół krawędzi formy i odwracając formę. Włącz i rozgrzej pulsacyjny system laserowy przez około 20 minut zgodnie z instrukcjami producenta.
Upewnij się, że wiązka światłowodu jest prawidłowo podłączona do wyjścia laserowego, a dwie nogi są prawidłowo umieszczone w uchwycie wiązki światłowodów. Po włączeniu systemu obrazowania ultrasonograficznego podłącz matrycowy przetwornik obrazowania do systemu i zamocuj przetwornik w uchwycie, aby wyrównać jego płaszczyznę obrazowania z przekrojem lasera. Ustaw częstotliwość powtarzania impulsów systemu laserowego na 10 Hz i umieść miernik mocy na końcu wiązki światłowodów, aby zmierzyć energię.
Dostosuj opóźnienie przełącznika Q, aż szacowana fluencja wyniesie 70 milidżuli na centymetr kwadratowy. Wypełnij jeden z kanałów w fantomie z poliakryloamidu żelem ultradźwiękowym i mieszaniną PFCnD za pomocą jednomililitrowej plastikowej strzykawki z końcówką ślizgową. Obficie pokryj górną część kanału żelem ultradźwiękowym i usuń wszelkie pęcherzyki za pomocą jednomililitrowej plastikowej strzykawki z końcówką.
Na koniec umieść fantom z poliakrylamidu pod przetwornikiem i wiązką włókien. Pomyślne opracowanie i separacja odśrodkowa PFCnD daje kropelki o średnicy około 200 do 300 nanometrów. Wielkość kropel zwiększa się z czasem w wyniku koalescencji i dyfuzji w procesie znanym jako dojrzewanie Ostwalda.
Stwierdzono, że kontrast z włączeniem dla impulsu końcowego jest około 3,2 razy większy, czyli o 220% lepszy niż w przypadku impulsu P. Obszar hiperechogeniczny został obliczony dla każdej klatki i znormalizowany przez obszar hiperechogeniczny pierwszej klatki, a następnie dopasowany do modelu rozpadu wykładniczego. Charakterystyczny czas zaniku znormalizowanego obszaru hiperechogenicznego był do 3,5 razy dłuższy w obrazowaniu impulsów N w porównaniu z impulsami P.
Różnicowe klatki obrazu w trybie B zostały zarejestrowane w czasie dla każdego obrazowania impulsu N i impulsu P. Jedną z najważniejszych rzeczy jest wydalenie lipidów z dna kolby, aby upewnić się, że zostaną one prawidłowo włączone do ciasta lipidowego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół syntezy optycznie odparowujących nanokropel perfluorowęglowodorów i poprawy ich wydajności obrazowania. Metoda pozwala na akustyczną modulację w celu poprawy kontrastu sygnału bez konieczności stosowania dodatkowego sprzętu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Zastosowania obrazowania
- Nanotechnologia
- Techniki ultrasonograficzne
Tło
- Nanokrople perfluorowęglowodorów są obiecujące dla obrazowania poza układem krążenia.
- Modulacja akustyczna może zwiększyć sygnały obrazowania.
- Proces syntezy jest prosty i wydajny.
- Nie jest potrzebny specjalistyczny sprzęt do implementacji.
Cel badania
- Przedstawienie syntezy nanokropel perfluorowęglowodorów.
- Dostarczenie metody poprawy wydajności obrazowania.
- Ułatwienie użycia tych cząstek w różnych zastosowaniach obrazowania.
Zastosowane metody
- Płukanie i przygotowywanie strzykawek z chloroformem.
- Dodawanie określonych lipidów i barwników do kolby z okrągłym dnem.
- Kroslinkowanie fantomów poliakryloamidu.
- Modulowanie akustycznie nanokropel dla zwiększonego sygnału.
Główne wyniki
- Udana synteza optycznie odparowujących nanokropel perfluorowęglowodorów.
- Wykazane zwiększenie kontrastu obrazu.
- Protokół można wykonać na standardowych programowalnych systemach ultrasonograficznych.
- Potencjalne zastosowania w kontekstach obrazowania nienaczyniowego.
Wnioski
- Optycznie aktywowane nanokrople perfluorowęglowodorów są skuteczne w obrazowaniu.
- Metoda jest dostępna i nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
- Wymagana jest dalsza eksploracja zastosowań w różnych dziedzinach obrazowania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optically vaporized perfluorocarbon nanodroplets enable non-vascular ultrasound imaging by extravasating to target sites and generating on-demand contrast through laser-triggered vaporization. This approach supports mechanistic de-risking in target validation by providing repeatable, background-free signal for preclinical imaging studies. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing multiplexed, super-resolution imaging without vascular confinement limitations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in extravasated tissue compartments using optically triggered nanodroplets.
- Operational Value: Supports biological de-risking through repeatable contrast generation for longitudinal target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantifiable acoustic readouts after optical droplet vaporization for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates screening readiness via consistent submicron droplet size (200–300 nm) post-centrifugal separation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by enabling contrast enhancement in deep tissue models via optical and acoustic modulation.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation through reprocessable "blinking" nanodroplets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical imaging, supporting lead identification with enhanced signal specificity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling non-vascular imaging of target-rich tissues via extravasatable nanodroplets.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible droplet synthesis and size-selective centrifugation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., hyperechoic area, decay time) for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via recondensable droplets that allow repeated imaging sessions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for contrast-enhanced ultrasound across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through background-free, on-demand contrast for mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardization and scalability via probe sonication and centrifugal purification workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing false positives in preclinical imaging through multiplexing capability.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by super-resolution imaging of target modulation in extravasated spaces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid nanoparticle formulation and probe sonication parameters.
- Needs access to programmable ultrasound systems and pulsed laser systems for optical triggering.
- Demands cross-team standardization of lipid synthesis and phantom preparation for consistent results.
- Involves adaptation considerations for varying perfluorocarbon core boiling points and optical absorber loading.
- Practical limitation: Droplet size increases over time due to Ostwald ripening, requiring timely use post-synthesis.
