Kontrole syntetycznego antygenu w immunohistochemii

Żele antygenowe BSA są dobrze scharakteryzowanymi, powtarzalnymi wzorcami IHC, które mogą uzupełniać istniejące kontrole. W protokole tym wykorzystuje się standardowe odczynniki i metody histologiczne i IHC w celu uzyskania powtarzalnych wzorców znanego składu. Kontrole te dają różnym laboratoriom możliwość kalibracji i standaryzacji testów IHC dla wielu testów istotnych diagnostycznie.

Ważne jest, aby znaleźć odpowiedni rozpuszczalnik do rozpuszczenia peptydu lub białka. Szybkie mieszanie roztworów antygenu i formaldehydu bez wprowadzania pęcherzyków może być trudne. Na początek przygotuj 20 mililitrów roztworu BSA o stężeniu 25% objętości, mieszając pięć gramów proszku BSA w 14 mililitrach PBS w 50-mililitrowej stożkowej probówce, aż do równomiernego rozprowadzenia.

Odwirować roztwór, aby rozpuścić proszek BSA. Trzymaj roztwór przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza do całkowitego rozpuszczenia. Następnego dnia dostosuj końcową objętość do 20 mililitrów za pomocą PBS.

Podobnie, przygotuj 20 mililitrów 31,3% objętościowo roztworu BSA, mieszając 6,26 grama proszku BSA w 13 mililitrach PBS. Po całonocnej inkubacji w celu całkowitego rozpuszczenia, dostosuj końcową objętość do 20 mililitrów za pomocą PBS. Aby sprawdzić, czy mieszanina formaldehydu BSA tworzy żel, podgrzej blok grzewczy do 85 stopni Celsjusza.

Następnie wymieszaj 700 mikrolitrów 25% roztworu BSA z 700 mikrolitrami 37% formaldehydu. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć razy w ciągu pięciu do 10 sekund, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Natychmiast po wymieszaniu umieść zamkniętą probówkę mikrowirówki w bloku grzewczym nagrzanym do 85 stopni Celsjusza.

Po 10 minutach wyjmij rurkę z bloku grzewczego. Pozwól mu ostygnąć i upewnij się, że żel uformował się zgodnie z oczekiwaniami. Przygotuj i wyraźnie oznacz osiem mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie przygotuj 5x roztwór podstawowy peptydu, dodaj stężenie 12,5 milimolowe, ponownie zawieszając całą masę zliberalizowanego peptydu w 60 mikrolitrach odpowiedniego rozpuszczalnika. Obserwować roztwór, aby upewnić się, że peptyd jest całkowicie rozpuszczony. Następnie dodaj dodatkową objętość rozpuszczalnika w razie potrzeby, aby uzyskać 12,5 milimolowy roztwór zgodnie z masą cząsteczkową, masą i czystością peptydów.

W tym przykładzie 5-krotny zapas peptydu ma końcową objętość 626,9 mikrolitrów. Inne próbki peptydów będą wymagały innej objętości końcowej. Następnie przygotuj 150 mikrolitrów 1x roztworu podstawowego peptydu, dodaj stężenie 2,5 milimola, rozcieńczając 30 mikrolitrów 5x peptydu w 120 mikrolitrach rozpuszczalnika.

Wirować roztwór przez pięć sekund i odwirować w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj 700 mikrolitrów 0,5-milimolowego roztworu peptydu BSA, rozcieńczając 140 mikrolitrów 1x peptydu w 560 mikrolitrach 31,3% roztworu BSA. Po wirowaniu odwirować roztwór w temperaturze pokojowej.

Podobnie, przygotuj cztery kolejne 10-krotne seryjne rozcieńczanie peptydu BSA, dodając 70 mikrolitrów roztworu peptydu BSA do 630 mikrolitrów 25% roztworu BSA. Aby przygotować żele peptydowe BSA, dodaj 37% formaldehydu do rozcieńczeń peptydu BSA w stosunku jeden do jednego, pracując po jednej próbce na raz. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć razy w ciągu pięciu do 10 sekund, nie tworząc pęcherzyków powietrza.

Po wymieszaniu umieść zamkniętą mikroprobówkę wirówkową w bloku grzewczym o temperaturze 85 stopni Celsjusza na 10 minut. Po przygotowaniu i podgrzaniu wszystkich roztworów peptydów BSA i formaldehydu, pozwól żelom ostygnąć na blacie przez pięć do 10 minut. Następnie za pomocą czystej, elastycznej jednorazowej szpatułki laboratoryjnej usuń próbkę żelu z probówki mikrowirówki w jednym kawałku.

I umieść go w szczelnie zamkniętym pojemniku zawierającym co najmniej 15 mililitrów neutralnej buforowanej formaliny, używając oddzielnego pojemnika dla każdej próbki. Alternatywnie, używając nowej żyletki z pojedynczą krawędzią, odetnij spód rurki mikrowirówki i wypchnij żel z dna za pomocą powietrza lub odpowiedniej sondy. Za pomocą czystej, obosiecznej maszynki do golenia przytnij stożek żelowy w cylindryczne krążki o grubości około pięciu milimetrów.

Po owinięciu krążków folią biopsyjną należy umieścić jeden większy krążek żelowy w jednej kasecie, a pozostałe krążki żelowe razem w drugiej kasecie do wykorzystania w budowie mikromacierzy tkankowej. Przed przetworzeniem umieść żele kasetowe w co najmniej 15 mililitrach 10% neutralnej buforowanej formaliny na żel, używając oddzielnego pojemnika dla każdej próbki. Następnie przetrzyj żele w automatycznym procesorze tkanek histologicznych zgodnie z dużym harmonogramem tkanek z ciśnieniem i próżnią.

Po zakończeniu przetwarzania próbki wyjmij kasety z procesora tkanek i przenieś je do centrum zatapiania parafiny. Po rozpakowaniu żeli z folii biopsyjnej zanurz je w parafinie lub w każdej próbce zanurz jeden krążek żelu w małej foremce o wymiarach 15 na 15 milimetrów. A pozostałe krążki żelu razem w drugiej większej formie.

Dla każdej serii rozcieńczeń peptydów należy utworzyć dwa szkiełka podstawowe zawierające łącznie sześć oddzielnych sekcji. Jeden odcinek z każdej z pięciu próbek z serii rozcieńczeń i jeden odcinek z próbki kontrolnej ujemnej BSA. Po pocięciu i wysuszeniu szkiełek, zabarwić dwie szkiełka przygotowane dla każdego peptydu pożądanym przeciwciałem pierwszorzędowym.

Zgodnie ze standardowymi protokołami immunohistochemicznymi spodziewaj się zobaczyć stosunkowo jednolity sygnał w każdym odcinku żelu. Przy czym różne próbki żelu wykazują zakres intensywności sygnału odpowiadający rozcieńczeniom peptydów. W celu budowy żelowej mikromacierzy tkankowej BSA należy wyciąć cztery odcinki mikromacierzy tkankowej o grubości czterech mikrometrów i wybarwić przeciwciałem monoklonalnym królika zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi.

Oceń uzyskaną intensywność plam jakościowo poprzez inspekcję lub ilościowo kup cyfrowe skanowanie i analizę obrazu. Po przedziałaniu z odpowiednimi przeciwciałami, kontrola ujemna BSA tylko próbki żelu wykazywały minimalny sygnał. Intensywność sygnału w pojedynczej próbce żelu jest względnie jednorodna i wzrasta wraz ze wzrostem stężenia antygenu.

Ponad 10% komórek MDA-MB-175 wykazuje słabe i całkowicie obwodowe barwienie błoniaste. W przeciwieństwie do tego, ponad 10% komórek SKBR-3 wykazuje intensywne, całkowicie obwodowe barwienie błoniaste Pracuj szybko po dodaniu formaldehydu, ponieważ roztwory zaczną żelować nawet w temperaturze pokojowej. Używamy tej metody do przeprowadzania kontroli IHC podczas testowania nowych przeciwciał, aby mieć pewność, że test działał zgodnie z oczekiwaniami, nawet jeśli testowane przeciwciała nie wykazują żadnego sygnału.

Kontrole tkanek lub linii komórkowych są z natury zmienne. Kontrole antygenów syntetycznych pozwalają na dokładniejszy pomiar efektu zmiany określonych warunków reakcji ISD.