Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Protokół ten będzie przydatny dla badaczy, którzy chcą opracować metody produkcji i oczyszczania AAV przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów. Produkcja AAV przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów jest opłacalną metodą, którą można łatwo zwiększyć i jest zgodna z obecną dobrą praktyką produkcyjną. Niektóre części protokołu zostaną zademonstrowane przez Alana Heizera, asystenta naukowego w moim laboratorium.

Zacznij od rozmrożenia jednej fiolki komórek Sf9 i natychmiast zasiej je w 15 mililitrach pożywki do hodowli komórek owadów. Hoduj komórki Sf9 w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przy 125 obr./min i 28 stopniach Celsjusza w kolbach okrągłodennych z luźno przymocowaną nasadką do wymiany powietrza. Rozmnażaj komórki w jednolitrowej kolbie zawierającej 200 mililitrów pożywki, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do produkcji komórek TIPS.

Dodaj 50 mililitrów ogniw Sf9 2 razy 10 do 6 ogniw zasilających na mililitr w dwóch kolbach. Zainfekuj jedną kolbę komórek Sf9 0,5 mililitra bakulowirusa-AAV2-GFP, a drugą kolbę komórek 0,5 mililitra bakulowirusa-AAV2-rep-cap. Trzy dni później zbierz małą porcję komórek Sf9 zakażonych bakulowirusem, znanych również jako komórki TIPS.

Zabarwić 2 razy 10 do 5 potęgi zarówno niezakażonych, jak i zakażonych bakulowirusem komórek Sf9 0,5 mikrograma mysiego przeciwciała anty-bakulowirusowego gp64 zawierającego barwnik fluorescencyjny w 100 mikrolitrach buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze otoczenia w ciemności. Po umyciu komórek PBS w celu usunięcia przeciwciała, ponownie zawiesić wybarwione komórki w 300 mikrolitrach PBS zawierających 0,5 albuminy surowicy bydlęcej. Przeanalizuj ekspresję gp64 bakulowirusa na komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Gdy komórki są zdolne do życia w 80 do 90%, ze wzrostem średnicy, zbierz komórki i kriokonserwuj 1 razy 10 do 7 komórek zasilających w jednym mililitrze pożywki do hodowli owadów, zastąpionych 10% płodową surowicą bydlęcą i 10% dimetylosulfotlenkiem w pojemniku do powolnego zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś probówkę zawierającą komórki TIPS do zamrażarki z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. Hoduj i hoduj naiwne komórki Sf9 w ilości od 2 razy 10 do 6 komórki zasilającej na mililitr w temperaturze 28 stopni Celsjusza w kilku dwulitrowych kolbach zawierających 400 mililitrów pożywki do hodowli komórek owadów w inkubatorze z wytrząsarką, która jest potrzebna do produkcji wirusa związanego z adenowirusem lub AAV.

Po trzech do czterech dniach gęstość ogniw zwiększa się do 5 do 6 razy 10 do 6 ogniw zasilających na mililitr. Do produkcji AAV w kolbach w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną należy użyć pipety lub pompy perystaltycznej, aby wysiać 400 mililitrów kultury Sf9 w proporcji 2 razy 10 do 6 ogniw zasilających na mililitr do dwulitrowej kolby, aseptycznie. Ustaw wytrząsarkę orbitalną na 125 obr./min i 28 stopni Celsjusza.

Rozmrozić po jednej fiolce z każdej komórki BACULOVIRUS-AAV-GFP i baculovirus-AAV-rep-cap TIPS. Rozcieńczyć komórki 20 mililitrami pożywki do hodowli owadów i przeprowadzić liczenie żywotności komórek za pomocą błękitu trypanowego. Zaszczepić obie komórki TIPS w stosunku od 1 do 10 000 w stosunku do naiwnych komórek Sf9 hodowanych w kolbie wytrząsającej lub bioreaktorze.

Drugiego dnia zbierz jeden mililitr kultury Sf9 aseptycznie i zabarwij barwnikiem błękitu trypanowego, aby przeanalizować liczbę komórek, żywotność i morfologię. Trzeciego dnia powtórz kroki wykonane drugiego dnia i sprawdź stan infekcji bakulowirusem po wybarwieniu komórek Sf9. Piątego dnia powtórz kroki wykonane drugiego dnia, a następnie zbierz pożywkę hodowlaną i komórki, gdy żywotność Sf9 spadnie do około 50%Zbierz supernatant i osad komórkowy po wirowaniu i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu osadu komórkowego wytwarzającego AAV dodaj do niego bufor do lizy komórek i energicznie wymieszaj. Inkubować ponownie zawieszony osad przez 30 minut w temperaturze otoczenia, aby uwolnić cząstki AAV. Po odwirowaniu przenieś lizat komórkowy do nowego pojemnika.

Po rozmrożeniu wymieszać lizat komórkowy i supernatant do hodowli komórkowych. Dodaj 20 jednostek na mililitr nukleazy i 10-milimolowego chlorku magnezu do lizatu komórkowego, aby strawić DNA i RNA, a następnie inkubować przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przefiltrować lizat przez system podwójnej filtracji polieterosulfonu o średnicy 0,8 mikrometra i 0,2 mikrometra za pomocą pompy.

Przechowuj oczyszczony lizat komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc lub natychmiast oczyść AAV. Zamontuj 10-mililitrową kolumnę AVB Sepharose na maszynie chromatograficznej i włóż rurociąg do próbki AAV, buforu płuczącego i buforu elucyjnego. Włożyć probówki do szczelin kolektora frakcji maszyny chromatograficznej w celu zebrania frakcji roztworu przepływowego kolumny, buforu płuczącego i buforu elucyjnego zawierającego cząstki AAV.

Zrównoważyć kolumnę AVB Sepharose z pięcioma objętościami PBS przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę. Załadować przefiltrowany lizat komórkowy zawierający cząstki AAV do kolumny powinowactwa AVB Sepharose za pomocą chromatografa wyposażonego w pompę do próbek. Uruchomić próbkę z natężeniem przepływu trzech mililitrów na minutę.

Przepuść PBS przez kolumnę z natężeniem przepływu trzech mililitrów na minutę, aż krzywa absorpcji ultrafioletu przy 280 nanometrach powróci do linii podstawowej i stanie się stabilna. Eluować cząstki AAV z kolumny sefarozy AVB za pomocą 50-milimolowego buforu cytrynianu sodu o pH 3 z szybkością przepływu trzech mililitrów na minutę. Natychmiast rozcieńczyć supernatant AAV w jednej piątej objętości 500-milimolowego Tris HCl pH 8,0 w celu zneutralizowania kwaśnego buforu elucyjnego zawierającego AAV.

Zapobiega to degradacji za pośrednictwem pH, która mogłaby wystąpić w przypadku kwaśnego buforu elucyjnego o pH 3,0. Następnie rozcieńczyć supernatant AAV dziesięciokrotnie PBS, tak aby cząstki AAV znalazły się w buforze fizjologicznym. Przechowywać jeden mililitr każdej próbki przepływowej kolumny, bufor do przemywania i 100 mikrolitrów eluowanego supernatantu AAV w celu oceny obecności AAV przez zakażenie komórek docelowych.

Skonfiguruj system filtracji o przepływie stycznym, wyposażony we wkład z membraną polieterosulfonową z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów w celu skoncentrowania AAV. Uruchom 200 mililitrów PBS przez 10 minut, aby zrównoważyć moduł filtracji o przepływie stycznym. Załaduj próbkę AAV, kontrolując przepływ pompy, aż próbka zostanie zredukowana do żądanej objętości.

Diafiltrować retentat za pomocą 100 mililitrów PBS. Po zagęszczeniu próbki AAV do żądanej objętości, należy pobrać próbkę AAV, przefiltrować ją przez filtr polieterosulfonowy o średnicy 0,2 mikrometra i podzielić na porcje. Następnie przechowuj próbkę AAV w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Większość komórek Sf9 została zainfekowana bakulowirusem w ciągu trzech do czterech dni, z powodu wielu rund infekcji, o czym świadczy ekspresja glikoproteiny gp64 bakulowirusa. Większość komórek wykazuje również wzrost średnicy. Komórki wykazują wzrost średnicy, efekt cytopatyczny i około połowa komórek umiera w ciągu pięciu dni po zakażeniu, co jest oznaką zakończenia produkcji AAV.

Pik białka zaobserwowano podczas elucji z kwaśnym buforem odpowiadającym frakcji AAV. Oczyszczone próbki AAV wykazują trzy odrębne białka kapsydu: VP1, VP2 i VP3, po SDS-PAGE i barwieniu srebrem. Najważniejszym krokiem jest pobranie komórek TIPS przed krioprezerwacją, kiedy większość komórek zostaje zakażona bakulowirusem, przy minimalnej liczbie zgonów komórek.

Opisaliśmy tutaj produkcję i oczyszczanie wektora AAV serotypu 2 jako model. Protokół ten może być jednak stosowany również do innych serotypów AAV.