Name: Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę pęcznienia agarozy do rekonstytucji białek błonowych w GUV z receptorem 5-HT1AR. Ta technika umożliwia badanie funkcji GPCR w kontrolowanym środowisku lipidowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Matthew Blosserowi za cenne dyskusje i rady. Prace te były wspierane przez Biuro Badań Marynarki Wojennej (N00014-16-1-2382) i Narodową Fundację Nauki (PHY-1915017).

1. Znakowanie białek
<ol>
	<li>Pozostaw NHS-rodaminę, fragmenty błon 5-HT1A oraz jedną kolumnę odsalającą do wirowania o MWCO 7 K w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Rozpuść 1 mg NHS-rodaminy w 100 µL dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Dodaj 5 µL 1 M roztworu wodorowęglanu sodu, aby zwiększyć pH roztworu 5-HT1AR do pH 8.</li>
	<li>Dodaj 3,66 µL roztworu NHS-rodaminy do 50 µL roztworu 5-HT1AR i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety w probówce do mikrocentryfugi. 
	UWAGA: Należy zapewnić co najmniej 10-krotny nadmiar molowy NHS-rodaminy.</li>
	<li>Przechowuj mieszaninę w ciemności i umieść na rotatorze w temperaturze pokojowej na 1 h.</li>
	<li>Przemyj kolumnę do wirowania o MWCO 7 k 200 µL 1x fosforanowym buforem solnym (1x PBS) trzy razy, wirując przez 1,5 min przy 1,5 RCF podczas każdego płukania.</li>
	<li>Przenieś znakowane białko do jednej kolumny, a w drugiej probówce do mikrocentryfugi wyrównaj masę.</li>
	<li>Odwiruj znakowane białko raz przez 5 min przy 1,5 RCF.</li>
	<li>Wykonaj pomiar widma UV-Vis za pomocą spektrofotometru NanoDrop przy 280 nm i 554 nm, a następnie oblicz wydajność znakowania zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przechowuj znakowane białko w szczelnym zamknięciu w temperaturze 5 °C do czasu dalszego użycia. Roztwór jest stabilny przez około tydzień po znakowaniu.</li>
</ol>
2. GUV z wbudowanymi w błonę receptorami 5-HT 1A
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów i odczynników
	<ol>
		<li>Pozostawić białko, lipidy i BSA (albuminę surowicy bydlęcej) do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.</li>
		<li>W tym czasie oczyścić szkiełka zakrywkowe, umieszczając je w metanolu i poddając sonikacji przez 30 min w 40 °C. Należy upewnić się, że metanol całkowicie pokrywa szkiełka, a poziom wody w kąpieli wodnej znajduje się powyżej poziomu metanolu w pojemniku. 
		UWAGA: Metanol jest toksyczny i należy z nim pracować w odpowiednim dygestorium chemicznym.</li>
		<li>Osuszyć nadmiar metanolu ze szkiełek zakrywkowych delikatnym strumieniem powietrza. Umieścić statyw ze szkiełkami w inkubatorze w 40 °C na 15 min, aby upewnić się, że nadmiar cieczy odparował.</li>
		<li>Rozpocząć proces czyszczenia plazmowego. Najpierw umieścić szkiełka zakrywkowe w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i zamknąć zawór dopływu powietrza, aby odessać całe powietrze z komory.</li>
		<li>Po wytworzeniu próżni w komorze, czyścić szkiełka przez 5 min przy wysokim ustawieniu mocy RF i niemal całkowitej próżni, z jedynie niewielkim dopływem powietrza do komory próżniowej. Aby zapewnić odpowiedni poziom plazmy, należy dostosować otwór komory próżniowej tak, aby wypadkowy kolor plazmy był stałym, jasnoróżowym. 
		UWAGA: Podczas stosowania powietrza kluczowe jest, aby plazma zachowała jasnoróżowy kolor przez cały czas trwania etapu traktowania plazmą, ponieważ ciemniejszy fioletowy kolor wskazuje na niewłaściwą ilość powietrza w komorze i doprowadzi do suboptimalnego traktowania plazmowego.</li>
		<li>Po upływie 5 min wyłączyć zasilanie RF i zwolnić próżnię. 
		UWAGA: Po wyjęciu z komory plazmowej należy upewnić się, że szkiełka zakrywkowe pozostają przykryte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hydrożelu
	<ol>
		<li>Połączyć 6 mg agarozy o ultra-niskiej temperaturze topnienia z 300 µL wody ultrapure (tj. 2% (w/v) agarozy). 
		UWAGA: Agaroza 2% zostanie użyta do otrzymania GUV bez białek. Roztwór agarozy można przechowywać w 45 °C przez dwa dni.</li>
		<li>Połączyć 9 mg agarozy o ultra-niskiej temperaturze z 300 µL wody ultrapure w celu otrzymania agarozy 3% (w/v) zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.1. Agaroza 3% zostanie użyta do otrzymania GUV z wbudowanymi białkami.</li>
		<li>Krótko wymieszać roztwór w wirówce vortex przed umieszczeniem go na bloku grzejnym w 90 °C na 10 min. Następnie ponownie wymieszać probówkę w vortexie przed przeniesieniem jej na blok grzejny w 45 °C, aby utrzymać ją w formie stopionej do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanie agarozy i białka
	<ol>
		<li>Wymieszać 21 µL agarozy 3% z 7 µL fragmentów błony 5-HT1AR. Powoli pipetować roztwór w górę i w dół wielokrotnie, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie. Następnie inkubować w 45 °C przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie hydrożelu i lipidów
	<ol>
		<li>Dla GUV bez białek: Na świeżo oczyszczonych plazmowo szkiełkach zakrywkowych stworzyć cienką warstwę, używając 20 µL agarozy 2%. Szybko nałożyć drugie szkiełko zakrywkowe na kroplę agarozy i delikatnie rozsunąć szkiełka, aby utworzyć cienką warstwę na obu szkiełkach. 
		UWAGA: Ten krok jest wymagający, ponieważ rozsuwanie kropli musi nastąpić, gdy agaroza jest nadal w formie stopionej.</li>
		<li>Dla GUV z wbudowanymi białkami: Pipetować mieszaninę białko/agaroza w górę i w dół jeszcze raz, a następnie nanieść 20 µL agarozy 2% na oczyszczone plazmowo szkiełko zakrywkowe. Postępować zgodnie z instrukcjami odlewania (slip-casting) opisanymi powyżej.</li>
		<li>Pozostawić agarozę do żelowania w ciemności przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nanieść lipidy kroplami na wierzch warstwy agarozy. Użyć łącznie 10 µL roztworu 2 mg/mL 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) z 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) znakowanego ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (lub innej interesującej mieszaniny lipidowej) w chloroformie na warstwę agarozy. Nanieść krople za pomocą igły do chromatografii gazowej i rozprowadzać jedną kroplę naraz za pomocą delikatnego strumienia powietrza. 
		UWAGA: W tym kroku należy zachować ostrożność, aby utworzyć stosunkowo jednorodną warstwę lipidów na wierzchu hydrożelu. Ponadto chloroform jest toksyczny i należy z nim pracować w odpowiednim dygestorium chemicznym.</li>
		<li>Złożyć komory Sykesa-Moore'a (S-M), umieszczając oring na wierzchu szkiełka zakrywkowego, a następnie nakładając górny element komory na oring. Użyć klucza dostarczonego przez producenta, aby złożyć komorę poprzez skręcenie elementów, co uszczelni komorę i zapobiegnie jakimkolwiek wyciekom. 
		UWAGA: Górna część komory powinna być dociśnięta do oringu, ale należy zachować ostrożność, aby szkiełko zakrywkowe pozostało nienaruszone, gdyż może ono pęknąć, jeśli oring nie przylega prawidłowo w komorze. Należy również upewnić się, że komora jest uszczelniona wystarczająco mocno, aby nie przeciekała po dodaniu roztworu pęczniejącego. Niedostateczne dokręcenie komory doprowadzi do wycieków i utraty próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pęcznienie i zbieranie pęcherzyków
	<ol>
		<li>Nawodnić cały układ, delikatnie pipetując 450 µL 200 mM sacharozy w 1x PBS i delikatnie opukując komory, aby zapewnić odpowiednie pokrycie warstw hydrożel-lipid buforem. 
		UWAGA: Roztwór sacharozy można zastąpić buforem rehydratacyjnym zawierającym interesujące sondy biologiczne.</li>
		<li>Umieścić komory w 45 °C i przykryć górną część komory szkiełkiem zakrywkowym, aby zapobiec parowaniu. Pozostawić próbkę do spęcznienia, chroniąc ją przed zanieczyszczeniami i światłem przez 1 h.</li>
		<li>Dodać 100 µL 1 mg/mL BSA w wodzie ultrapure do każdej studni płytki 96-dołkowej przeznaczonej do użycia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.</li>
		<li>Przemyć trzy razy wodą ultrapure i raz roztworem 200 mM sacharozy w 1x PBS.</li>
		<li>Na koniec dodać 200 mM glukozy w 1x PBS przed dodaniem roztworu próbek GUV. 
		UWAGA: BSA została użyta do blokowania adsorpcji GUV.</li>
		<li>Po dopuszczeniu do spęcznienia hydrożelu, delikatnie wstrząsnąć i opukać komorę, aby odłączyć wszelkie GUV, które mogą pozostać przytwierdzone do powierzchni hydrożelu. Następnie ostrożnie pobrać pipetą roztwór GUV-sacharoza. 
		UWAGA: Jako opcjonalny krok w celu zapewnienia odłączenia wszystkich pęcherzyków od powierzchni, można delikatnie nanieść część zawiesiny sacharozowej z powrotem na powierzchnię hydrożelu.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do wcześniej przygotowanej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 700 µL 200 mM glukozy w 1x PBS. 
		UWAGA: Gradient gęstości doprowadzi do osadzania się pęcherzyków na dnie probówki do centryfugi.</li>
		<li>Pozostawić pęcherzyki do osadzenia przez kolejną godzinę, aby upewnić się, że pęcherzyki opadną na dno probówki do mikrocentryfugi, co pozwoli na optymalne zebranie.</li>
		<li>Po osadzeniu GUV w glukozie, przenieść 300 µL z dna probówki do centryfugi (osadzone pęcherzyki) do wcześniej przygotowanej i potraktowanej BSA płytki 96-dołkowej, aby zbadać pęcherzyki pod mikroskopem konfokalnym. 
		UWAGA: Należy unikać pobierania cieczy z samego dna probówki do mikrocentryfugi, aby zminimalizować ilość zanieczyszczeń zebranych w końcowej próbce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić próbki pod mikroskopem.
	<ol>
		<li>Oświetlić próbkę laserem 488 nm (co pozwala na wizualizację błony, ponieważ dwuwarstwa została znakowana ATTO-488-DPPE).</li>
		<li>Oświetlić próbkę laserem 561 nm (co pozwala na wizualizację białka, ponieważ zostało ono znakowane NHS-Rodaminą). 
		​UWAGA: Podczas obrazowania próbki należy zachować ostrożność, ponieważ fotoutlenianie może zdestabilizować pęcherzyki. Pęcherzyki obserwowano w tym samym dniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces pęcznienia filmu białkowo-lipidowego; schemat przedstawia wyniki wzbudzenia GUVs przy 491nm/561nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62830/62830fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja szczegółowych kroków protokołu. Utworzono w BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62830/62830fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zidentyfikowaliśmy dwa etapy, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia całego protokołu: obróbka plazmowa i osadzanie lipidów. Czyszczenie plazmowe szkiełek nakrywkowych jest niezbędne do zapewnienia odpowiedniego pokrycia i przyczepności hydrożelu agarozowego do szklanego szkiełka nakrywkowego. Czyszczenie plazmowe osiąga dwie rzeczy: po pierwsze, usuwa ślady materii organicznej z powierzchni szkła; Po drugie, aktywuje powierzchnię szkiełka nakrywkowego, co pozwala na zwiększenie zwilżalności wraz ze wzrostem hydrof...

Syntetyczne membrany modelowe są potężnymi narzędziami w badaniu podstawowych właściwości i funkcji biomembran. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) są jedną z najbardziej znanych platform do badania różnych właściwości błony plazmatycznej i mogą być zaprojektowane tak, aby naśladować różne warunki fizjologiczne1,2,3,4,5,6,7,8. Powszechnie wiadomo, że błona plazmatyczna i jej organizacja odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, takich jak transdukcja sygnału, adhezja, endocytoza i transport9,10,11,12,13,14,15.
GUV zostały wytworzone przy użyciu różnych metod, w tym delikatnego nawilżania16, hydrożelowe pęcznienie17, electroformation18, techniki mikroprzepływowe19,20,21,22, jetting23, oraz wymiana rozpuszczalników24, 25,26. Ze względu na wyzwania związane z obsługą integralnych białek błonowych (IMP), platformy do ich badania in vitro były ograniczone. GUV stanowią uproszczoną platformę do badania badanych produktów leczniczych w środowisku, które naśladuje ich środowisko naturalne. Chociaż istnieje kilka podejść do rekonstytucji białek w GUV, pojawiają się wyzwania związane z włączeniem białek o prawidłowej orientacji i utrzymaniem funkcjonalności białka27.
Najbardziej udana rekonstytucja białek w GUV wymaga metody wymiany detergentu; która polega na rozpuszczeniu białek z ich rodzimego środowiska przez detergenty, następnie oczyszczeniu białek, a następnie zastąpieniu cząsteczek detergentu lipidami za pomocą różnych metod28. Podczas gdy detergenty służą do stabilizacji trzeciorzędowej struktury badanych produktów leczniczych podczas oczyszczania, micele detergentów są stosunkowo nienaturalnym środowiskiem dla tych białek, które są lepiej ustabilizowane, szczególnie w badaniach funkcjonalnych, w dwuwarstwach lipidowych28,29,30. Co więcej, włączenie funkcjonalnych białek transbłonowych do dwuwarstwy lipidowej przy użyciu tradycyjnych technik wytwarzania GUV było trudne ze względu na rozmiar, delikatność tych białek i dodatkowe etapy wymiany detergentów, które byłyby potrzebne27,31,32,33. Użycie rozpuszczalnika organicznego do usuwania detergentów powoduje agregację i denaturację białek34. Ulepszona metoda za pośrednictwem detergentu jest obiecująca, jednak należy zachować ostrożność na etapie usuwania detergentu i może być konieczna optymalizacja dla określonych białek31,35. Ponadto metody wykorzystujące elektroformację mogą ograniczać wybór białka i mogą nie być odpowiednie dla wszystkich kompozycji lipidowych, zwłaszcza naładowanych lipidów31,36,37. Inną techniką, która została zastosowana, jest indukowana peptydami fuzja dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV) zawierających pożądane białko z GUV, chociaż okazało się, że jest to pracochłonne i może prowadzić do wprowadzenia obcych cząsteczek - peptydów fuzogennych33,38,39. Gigantyczne pęcherzyki błony komórkowej (GPMV), które pochodzą z żywych komórek, mogą być używane do przezwyciężenia niektórych z tych problemów, jednak pozwalają na minimalną kontrolę wynikowego składu lipidów i białek14,40,41. Dlatego integracja IMP w warstwie bilipidowej GUV przy użyciu naszej zmodyfikowanej metody pęcznienia agarozy stanowi wiarygodną metodę dalszego badania tych białek w środowisku błonowym42,43,44,45.
Sygnalizacja komórkowa i komunikacja obejmuje rodzinę białek znanych jako receptory sprzężone z białkiem G (GPCR); GPCR należą do największej rodziny białek i są związane z modulacją nastroju, apetytu, ciśnienia krwi, funkcji układu sercowo-naczyniowego, oddychania i snu oraz wieloma innymi funkcjami fizjologicznymi46. W tym badaniu wykorzystano ludzki receptor serotoninowy 1A (5-HT1AR), który jest prototypowym członkiem rodziny GPCR. 5-HT1AR można znaleźć w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i naczyniach krwionośnych; Wpływa na liczne funkcje, takie jak funkcje sercowo-naczyniowe, żołądkowo-jelitowe, hormonalne, a także uczestniczy w regulacji nastroju47. Dużą przeszkodą w badaniach nad GPCR jest ich złożona amfifilowa struktura, a GUV stanowią obiecującą platformę do badania różnych właściwości będących przedmiotem zainteresowania, począwszy od funkcjonalności białek, interakcji lipid-białko i interakcji białko-białko. Do badania interakcji lipidowo-białkowych zastosowano różne podejścia, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonów (SPR)48,49, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)50,51, test nakładki lipidów białkowych (PLO)51,52,53,54, masa natywna spektrometria55, izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC)56,57, oraz test sedymentacji liposomów58,59. Nasze laboratorium wykorzystało uproszczone podejście GUV do zbadania wpływu interakcji lipid-białko na funkcjonalność białka poprzez inkapsulację BODIPY-GTPγS, który wiąże się z podjednostką Giα w stanie aktywnym receptora. Ich wiązanie uwalnia fluorofor, wytwarzając sygnał fluorescencyjny, który może być wykryty w czasie45. Co więcej, w różnych badaniach analizowano interakcje lipidowo-białkowe i rolę białek w wykrywaniu lub stabilizowaniu krzywizny błony60,61, a wykorzystanie wykonalnego podejścia GUV może być kluczową zaletą.
Ten protokół demonstruje prostą metodę wprowadzania GPCR do membrany GUV za pomocą zmodyfikowanego systemu hydrożelu agarozowego17,42. Ponadto, w oparciu o nasze wcześniejsze prace, nasza metoda może być odpowiednia dla badanych produktów morskich, które mogą wytrzymać krótkotrwałą ekspozycję na temperaturę 30-40 °C. Krótko mówiąc, rozprowadzamy cienką warstwę agarozy w połączeniu z fragmentami membrany zawierającymi interesujący nas GPCR. Po żelowaniu tej warstwy osadzamy roztwór lipidowy na wierzchu agarozy i pozwalamy rozpuszczalnikowi odparować. Następnie przeprowadzono rehydratację systemu za pomocą buforu wodnego, w wyniku czego powstały GUV z białkiem wbudowanym w dwuwarstwę lipidową.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850375C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroskop odwrócony TI-Eclipse</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850355C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>13/16&Prime; ID, 1&Prime; O-ringi silikonowe OD</td><td>Sterling Seal & Zasilanie, Neptun, IN</td><td>5-003-8770</td><td></td></tr><tr><td>16-bitowa kaskada II 512 ze sprzężonym ładunkiem elektronowym kamera</td><td>fotometryczna, Huntington Beach, CA&</td><td>nbsp; Cascade II 512</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>50 mW lasery na ciele stałym przy 488 nm i filtr emisyjny wyśrodkowany na 525 nm i 561 nm z filtrem emisyjnym wyśrodkowanym na 595 nm</td><td>Koherentny, Santa Clara, CA</td><td>488/561-50-LS Fragmenty membrany</td><td></td></tr><tr><td>5-HT1AR</td><td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td><td>RBHS1AM400UA</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-488-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DPPE)</td><td>ATTO-TEC, Siegen, Niemcy</td><td>AD 488-155</td><td></td></tr><tr><td>Stacjonarny środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>chloroform (CHCl3)</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td><td>CX1055</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (Chol)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning</td><td>, Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td><td>Elma, Singen, Niemcy</td> <td>[już niesprzedawane na głównej stronie internetowej]</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>metanol (MeOH)</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td><td>MX0485</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (10x PBS)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>tarcza spinning-disc Głowica konfokalna CSUX</td><td>Yokogawa, Tokio, Japonia</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>standardowe szkiełka nakrywkowe szklane 25 mm nr 1</td><td>ChemGlass, Vineland, NJ</td><td>CLS-1760</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Komory Sykesa-Moore'a</td><td>Bellco, Vineland, NJ</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o bardzo niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5030</td><td></td></tr><tr><td>Analogowy blok grzewczy VWR</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>[już niesprzedawane na głównej stronie internetowej]</td><td></td></tr> <tr><td>VWR Tube Rotator</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem g (gpcr)

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Solidne badania in vitro struktury i funkcji integralnych białek błonowych były wyzwaniem ze względu na złożoność błony plazmatycznej i liczne czynniki wpływające na zachowanie białek w żywych komórkach. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) to biomimetyczny i wysoce przestrajalny system modelowy in vitro do badania interakcji białko-błona i sondowania zachowania białek w precyzyjny, zależny od bodźca sposób. W tym protokole przedstawiamy niedrogą i skuteczną metodę wytwarzania GUV z ludzkim receptorem serotoniny 1A (5-HT1AR) stabilnie zintegrowanym z błoną. Wytwarzamy GUV metodą pęcznienia modyfikowanego hydrożelu; poprzez osadzenie filmu lipidowego na mieszaninie agarozy i 5-HT1AR, a następnie uwodnienie całego systemu, można utworzyć pęcherzyki z odpowiednio zorientowanym i funkcjonalnym 5-HT1AR wbudowanym w błonę. Te GUV mogą być następnie wykorzystane do badania interakcji białko-błona i zachowania lokalizacyjnego za pomocą mikroskopii. Ostatecznie protokół ten może pogłębić naszą wiedzę na temat funkcjonalności integralnych białek błonowych, zapewniając głęboki wgląd fizjologiczny.

Zmierzono stężenie białka, a stopień znakowania obliczono jako stosunek molowy barwnika do białka wynoszący 1:1. Analizując GUV za pomocą mikroskopii konfokalnej, potwierdzono prawidłowe formowanie się pęcherzyków oraz integrację białek. Lipidy znakowano 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, a białko znakowano kowalencyjnie poprzez modyfikację amin pierwszorzędowych za pomocą estru NHS rodaminy. Rysunek 2a i Rysunek 2b przedstawiają pęcherzyk z wbudowanym białkiem odpowiednio...

Ten protokół wykorzystuje pęcznienie agarozy jako potężną i dającą się uogólnić technikę włączania integralnych białek błonowych (IMP) do gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków lipidowych (GUV), jak opisano tutaj dla rekonstytucji ludzkiego białka receptora serotoninowego 1A (5-HT1AR), jednej z klas farmakologicznie ważnych receptorów sprzężonych z białkiem G.

Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Badanie integralnych białek błonowych w ich naturalnym środowisku było wyzwaniem ze względu na złożoność błony plazmatycznej. Gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (GUV) są jedną z najbardziej znanych platform do badania właściwości biomembran i mogą być modyfikowane tak, aby naśladować różne warunki fizjologiczne. Protokół ten opisuje metodę wytwarzania GUV zawierających białko w oparciu o spontaniczną inkorporację, po pęcznieniu hydrożelu. Tradycyjne metody wytwarzania GUV nie są uogólnione na integralne włączenie białek błonowych. Metody te są często mało wydajne, złożone metodologicznie i doraźne, nie mają zastosowania do szerokich klas białek. Z drugiej strony, protokół ten stanowi elastyczną, solidną i prostą metodę włączania funkcjonalnych integralnych białek błonowych do GUV. Osiągnęliśmy to, przygotowując rusztowanie hydrożelowe, zawierające białko i umieszczając na nim cienką warstwę lipidu. W przedstawionym tutaj przykładzie włączyliśmy receptor sprzężony z białkiem G lub GPCR do GUV. Po ponownym uwodnieniu całego systemu, GUV wystają z powierzchni hydrożelu z membraną zawierającą odpowiednio zorientowane GPCR. Pozwól, aby wszystkie odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową. W tym czasie należy oczyścić szkiełka nakrywkowe, umieszczając je w metanolu i sonikując przez 30 minut w temperaturze 40

construction-model-lipid-membranes-incorporating-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Ten raport opisuje badanie przesiewowe różnych detergentów do przygotowania wizualnego GPCR, rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go. Przedstawiono metody biochemiczne charakteryzujące jakość kompleksu na różnych etapach oczyszczania. Protokół ten można uogólnić na inne kompleksy białek błonowych dla ich przyszłych badań strukturalnych.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Różnorodność lipidów błony pod względem struktury i składu jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do procesów komórkowych i może być markerem choroby. Symulacje dynamiki molekularnej pozwalają nam badać błony i ich interakcje z biomolekułami w rozdzielczości atomowej. W tym miejscu udostępniamy protokół do budowania, uruchamiania i analizowania złożonych systemów membranowych.

Realistyczne modelowanie błon z wykorzystaniem złożonych mieszanin lipidowych w badaniach symulacyjnych

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Techniki biosensorów optycznych mogą wykrywać zmiany w masie w pobliżu błony plazmatycznej w żywych komórkach i pozwalają śledzić reakcje komórkowe zarówno w pojedynczych komórkach, jak i populacjach komórek. Protokół ten będzie opisywał wykrywanie modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G w nienaruszonych komórkach przy użyciu tego podejścia.

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Poznaj metodę pęcznienia agarozy do rekonstytucji białek błonowych w GUV z receptorem 5-HT1AR. Ta technika umożliwia badanie funkcji GPCR w kontrolowanym środowisku lipidowym.

Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

Przeglądaj więcej filmów