Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

Ten protokół wykorzystuje pęcznienie agarozy jako potężną i dającą się uogólnić technikę włączania integralnych białek błonowych (IMP) do gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków lipidowych (GUV), jak opisano tutaj dla rekonstytucji ludzkiego białka receptora serotoninowego 1A (5-HT_1AR), jednej z klas farmakologicznie ważnych receptorów sprzężonych z białkiem G.

Badanie integralnych białek błonowych w ich naturalnym środowisku było wyzwaniem ze względu na złożoność błony plazmatycznej. Gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (GUV) są jedną z najbardziej znanych platform do badania właściwości biomembran i mogą być modyfikowane tak, aby naśladować różne warunki fizjologiczne. Protokół ten opisuje metodę wytwarzania GUV zawierających białko w oparciu o spontaniczną inkorporację, po pęcznieniu hydrożelu. Tradycyjne metody wytwarzania GUV nie są uogólnione na integralne włączenie białek błonowych. Metody te są często mało wydajne, złożone metodologicznie i doraźne, nie mają zastosowania do szerokich klas białek. Z drugiej strony, protokół ten stanowi elastyczną, solidną i prostą metodę włączania funkcjonalnych integralnych białek błonowych do GUV. Osiągnęliśmy to, przygotowując rusztowanie hydrożelowe, zawierające białko i umieszczając na nim cienką warstwę lipidu. W przedstawionym tutaj przykładzie włączyliśmy receptor sprzężony z białkiem G lub GPCR do GUV. Po ponownym uwodnieniu całego systemu, GUV wystają z powierzchni hydrożelu z membraną zawierającą odpowiednio zorientowane GPCR. Pozwól, aby wszystkie odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową. W tym czasie należy oczyścić szkiełka nakrywkowe, umieszczając je w metanolu i sonikując przez 30 minut w temperaturze 40