Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Sztuczne karmienie i pobieranie śliny stanowi bezpośrednią metodę wykrywania efektorów w ślinie owadów. Nie zostało to jednak wcześniej szczegółowo opisane. Protokół ten jest skuteczny w zbieraniu śliny z owadów saprofitycznych.

Dodatkowo jest to prosta technika, ponieważ jako sztuczną dietę używamy pożywki zawierającej tylko sacharozę. Ślina owadów saprofitycznych może wpływać na układ odpornościowy gospodarza, korzystnie wpływając na zachowania żywieniowe i przenosząc patogeny. Jest to lek, który może być stosowany do zachowania owadów i badań nad ścieżkami kostnymi owadów.

Jest to prosta metoda do wykonania. Sugeruje to jednak montaż czystego środowiska eksperymentalnego, ponieważ ślina jest zbierana do dalszych badań. Zacznij od przygotowania 5% roztworu sacharozy do sztucznej diety i przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć zanieczyszczenia bakteryjne i zanieczyszczenia.

Zagłodź około 200 małych brązowych larw leja roślinnego przez trzy do pięciu godzin przed wprowadzeniem ich do komory karmienia. Następnie, aby przygotować szklane cylindry jako komory do karmienia, przykryj jeden otwarty koniec komory membraną parafinową przed wprowadzeniem eksperymentalnych owadów, a następnie przenieś owady do szklanego cylindra i przykryj drugi koniec komory rozciągniętą membraną parafinową. Dodaj 200 mikrolitrów sztucznej diety na membranę, a następnie przykryj płyn kolejną warstwą rozciągniętej membrany parafinowej.

Na koniec przykryj komorę folią aluminiową, pozostawiając koniec z urządzeniem do sztucznej diety wystawionym na działanie światła. Po 24 godzinach zbierz ślinę SBPH, schładzając cylinder w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby unieruchomić owady, a następnie odkryj zewnętrzną folię i zbierz sztuczną dietę do sterylnych probówek o pojemności 1,5 mililitra za pomocą sterylnej pipety. Utrzymuj zebraną ślinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy.

Następnie przepłucz wewnętrzną membranę trzykrotnie 50 mikrolitrami świeżej sztucznej diety, delikatnie pipetując, a następnie zbierz sztuczną dietę myjącą do sterylnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Po trzech płukaniach dodaj świeżą sztuczną dietę na wewnętrzną membranę i umieść świeżo rozciągniętą membranę parafinową na wierzchu. Na koniec przefiltruj zebrane próbki przez jednostkę filtrującą o wielkości 0,22 mikrona, aby usunąć drobnoustroje i inne zanieczyszczenia.

Przenieś zbiorcze próbki śliny do filtra odśrodkowego o pojemności 500 mikrolitrów i 10 kilodaltonów. Odwirować próbkę. Zebrać supernatant i zwiększyć końcową objętość do 100 mikrolitrów.

Aby zmierzyć stężenie pobranej śliny, włącz spektrofotometr UV i umyj cokoły trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Wybierz opcje na ekranie w następującej kolejności, białka, białko A280. Wybierz typ i jedną jednostkę absorbancji równą jednemu miligramowi na mililitr.

Następnie zaznacz pole korekcji linii bazowej, 340 nanometrów. Następnie załaduj dwa mikrolitry 5% wodnego roztworu sacharozy jako ślepą próbę, a następnie dotknij opcji Puste u dołu ekranu. Na koniec, po ustaleniu norm, załaduj dwa mikrolitry pobranej śliny i zapisz stężenie białka.

Przy karmieniu 5% sacharozą ponad 80% SBPH przeżyło przez pierwsze cztery dni. Jednak od piątego dnia śmiertelność szybko wzrosła do 40%, a siódmego dnia przeżyła mniej niż połowa SBPH. Analiza strony SDS wykazała, że skoncentrowane próbki śliny ze śliny SBPH zakażonej RSV zawierały znacznie więcej białek niż 5% kontrola ujemna sacharozy.

W analizie Western blot w celu wykrycia białka kapsydu RSV, niezakażonych i zjadliwych owadów. Białko kapsydu RSV zostało pomyślnie wykryte w próbce wiruliferycznej, przeciwciało zaprojektowane przeciwko produktowi genu LssgMP wykryło białko 78 kilodaltonów w próbkach niezakażonych i wirusowych, wykazując, że LssgMP jest białkiem śliny. Analiza QRT PCR poziomów transkryptu LssgMP w różnych tkankach wykazała, że poziomy transkryptu Lssg w gruczole ślinowym były 20-krotnie wyższe niż w całym ciele i jelitach, potwierdzając specyficzną ekspresję LssgMP w gruczole ślinowym.

Zagłodzenie eksperymentalnych owadów przed wprowadzeniem ich do komory jest konieczne, aby zapewnić skuteczność naszego zbierania śliny. Poza tym co 24 godziny należy pobierać i wymieniać sztuczne podłoże w celu zmniejszenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego pobranej próbki. Technika ta zapewnia bezpośrednią metodę badania funkcji śliny w przenoszeniu patogenów.

Dodatkowo może pomóc w badaniu interakcji patogenów owadów z gospodarzem.