Name: Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj dwuwarstwową metodę kanapkową do zbierania śliny Laodelphax striatellus. Protokół umożliwia badanie funkcji śliny w transmisji patogenów i interakcjach owad-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2019YFC1200503), przez Narodową Fundację Nauki Chin (nr 32072385) oraz przez Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży CAS (2021084).

1. Konserwacja SBPH
<ol>
	<li>Hoduj zjadliwe i wolne od RSV osobniki SBPH w szklanym inkubatorze (65 x 200 mm) z 5-6 siewkami ryżu (Oryza sativa cv. Nipponbare) w szklanej komorze w laboratorium. Uprawiaj rośliny ryżu w temperaturze 25 °C w świetle 16 godzin / 8 godzin ciemnego fotoperiodu. 
	UWAGA: Wirusowe i wolne od RSV osobniki SBPH zostały początkowo złapane w prowincji Jiangsu w Chinach.</li>
	<li>Wykryć RSV w SBPH za pomocą testu immunoenzymatycznego sprzężonego z enzymem kropkowym (dot-ELISA) z przeciwciałem poliklonalnym swoistym dla królika RSV (patrz tabela materiałów) podniesionym przeciwko rybonukleoproteinom RSV (RNP). 
	UWAGA: Aby zapewnić wysoką skuteczność infekcji potomstwa, zjadliwe samice utrzymywano oddzielnie, a 15% ich potomstwa losowo badano pod kątem zakażenia RSV. Szczegóły dot-ELISA opisano w krokach 1.3-1.7.</li>
	<li>Homogenizować pojedynczy SBPH w 20 μl buforu powlekającego (0,05 M Na2CO 3-NaHCO3, pH 9,5). Umieść 3 μl każdego z nich na membranie nylonowej (patrz Tabela materiałów), a następnie wysusz membranę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Inkubować błonę z 15 ml buforu blokującego (PBS + 3% odtłuszczonego mleka) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z rozcieńczonymi pierwszorzędowymi przeciwciałami króliczymi przeciwko RSV (1:10000) w 15 ml PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemywać błonę trzykrotnie PBS przez 5 minut inkubacji za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować błonę z 1,5 μl kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (patrz tabela materiałów) w 15 ml PBS i przemywać trzykrotnie PBS przez 5 minut inkubacji za każdym razem.</li>
	<li>Opracuj immunobloty za pomocą ulepszonego zestawu chromogenicznego HRP-DAB (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory do karmienia i sztucznej diety
<ol>
	<li>Odważyć 2 g sacharozy w proszku i rozpuścić ją w 40 ml ddH2O, aby przygotować 5% wodny roztwór sacharozy jako sztuczną dietę.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm (patrz tabela materiałów) w celu usunięcia zanieczyszczeń bakteryjnych i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Zagłodź 200 larw 3-5th SBPH przez 3-5 godzin przed wprowadzeniem ich do komory. 
	UWAGA: Na jedną komorę przygotowuje się 200 SBPH; więcej SBPH powinno być przygotowane dla kilku komór.</li>
	<li>Przygotuj szklane cylindry jako komory do karmienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Przykryj jeden otwarty koniec komory membraną parafinową (patrz Tabela materiałów) przed wprowadzeniem owadów doświadczalnych. 
	UWAGA: Każdy cylinder ma 15,0 cm długości i 2,5 cm średnicy. Te szklane cylindry są wykonywane na zamówienie zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Przenieś owady do szklanego cylindra.</li>
	<li>Przykryj drugi koniec komory rozciągniętą membraną parafinową (konkretnie Parafilm M). Następnie dodaj do niego 200 μL sztucznej diety. Na koniec przykryj płyn kolejną warstwą rozciągniętej membrany parafinowej. 
	UWAGA: Membrana parafinowa jest rozciągana do około dwukrotności swojej pierwotnej powierzchni.</li>
	<li>Przykryj komorę folią aluminiową, ale pozostaw koniec ze sztucznym urządzeniem dietetycznym wystawionym na działanie światła.</li>
</ol>
3. Pobieranie śliny SBPH
<ol>
	<li>Sztuczną dietę z wolnego od wirusa RSV i wirusowego SBPH należy pobrać oddzielnie po upływie 24 godzin.</li>
	<li>Schłodzić cylinder w temperaturze 4 °C w celu unieruchomienia owadów.</li>
	<li>Odsłoń zewnętrzną folię i zbierz sztuczny płyn dietetyczny za pomocą sterylnej pipety do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Utrzymać pobraną ślinę w temperaturze -80 °C do czasu analizy. 
	UWAGA: Pobraną ślinę można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 rok.</li>
	<li>Przepłukać błonę wewnętrzną trzykrotnie 50 μl świeżej sztucznej karmy, delikatnie pipetując, a następnie pobrać sztuczną dietę myjącą zgodnie z opisem w kroku 3.3. Umieść nową sztuczną dietę na wewnętrznej membranie i trzymaj świeżo rozciągniętą membranę parafinową na wierzchu.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.2 i 3.3 przez 5 dni do 2 tygodni. 
	UWAGA: Policz wskaźnik przeżywalności SBPH do sztucznego żywienia i zapewnij wystarczające uzupełnienie świeżego SBPH zgodnie ze wskaźnikiem przeżycia.</li>
	<li>Przefiltruj pobrane próbki przez jednostkę filtrującą 0,22 μm w celu usunięcia drobnoustrojów i innych zanieczyszczeń.</li>
</ol>
4. Stężenie pobranej śliny
<ol>
	<li>Pobrane próbki śliny przenieść do 0,5 ml filtra odśrodkowego o pojemności 10 kD (patrz tabela materiałów) i wirować w temperaturze 5 500 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Zebrać supernatant i zwiększyć końcową objętość do 100 μl.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie pobranej śliny za pomocą odpowiedniego spektrofotometru UV-VIS zgodnie z krokami 4.3-4.6.</li>
	<li>Włącz spektrofotometr i umyj cokoły trzykrotnie ddH2O.</li>
	<li>Wybierz następujące opcje na ekranie w odpowiedniej kolejności: Białka | Białko A280 | Wybierz punkt Typ | 1 Abs = 1 mg/ml. Następnie zaznacz pole wyboru Baseline Correction 340 nm.</li>
	<li>Załaduj 2 μl 5% wodnego roztworu sacharozy jako ślepą próbę, dotknij opcji Puste u dołu ekranu.</li>
	<li>Po ustaleniu norm załaduj 2 μL pobranej śliny do pomiaru. Odczyt i zapis stężenia białka. 
	UWAGA: Ostatecznie zebrano co najmniej 1 mg białek śliny.</li>
</ol>
5. Barwienie srebrem białek śliny
<ol>
	<li>Ekstrahować białko z próbek śliny owadów za pomocą buforu ładującego próbkę (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glicerolu, 2% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego i 1% β-merkaptoetanolu). Następnie należy go frakcjonować przez 10% SDS-PAGE (patrz Tabela Materiałów). Obciążyć 5% roztwór sukroseaque, potraktowany w taki sam sposób jak kontrola ujemna.</li>
	<li>Załadować 20 μl podwielokrotności próbki na żel SDS-PAGE wraz z wstępnie wybarwionym markerem. Uruchom żel na 15 minut przy 90 woltach, a następnie 50 minut przy 140 woltach.</li>
	<li>Utrwalić żel w 30% (obj./obj.) etanolu, 10% (obj./obj.) kwasie octowym przez co najmniej 30 min po elektroforezie.</li>
	<li>Spłucz żel dwukrotnie 20% (obj.) etanolem i wodą osobno przez 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Uczulać żel w 0,8 mM tiosiarczanu sodu przez 1 min, a następnie płukać dwukrotnie w wodzie przez 1 min za każdym razem.</li>
	<li>Zanurz żel w 12 mM azotanu srebra na co najmniej 1 godzinę, a następnie zanurz go w wodzie dejonizowanej na 10 s przed przeniesieniem do roztworu wywoływacza.</li>
	<li>Gdy tło żelu ciemnieje, zanurz żel w roztworze zatrzymującym (5% kwas octowy) na co najmniej 30 minut, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Żel należy przemyć dwukrotnie wodą przez 30 minut za każdym razem. Wywołaj obraz za pomocą systemu detekcji (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
6. Wykrywanie białek za pomocą western blotting
<ol>
	<li>Wykryj mucynopodobne białko SBPH (LssgMP) i RSV w ślinie za pomocą western blot przy użyciu odpowiednio specyficznych przeciwciał.</li>
	<li>Próbki śliny owadów należy traktować zgodnie z krokiem 5.1.</li>
	<li>Załadować 20 μl podwielokrotności próbki do 10% żelu SDS-PAGE wraz ze wstępnie wybarwionym markerem i 20 μl niezakażonej próbki śliny RSV jako kontrolę negatywną. Uruchom żel przez 15 minut przy 90 woltach, a następnie przez 50 minut przy 140 woltach.</li>
	<li>Zmieszać 100 ml 10x buforu do przenoszenia białka (na mokro) (patrz tabela materiałów) z 900 ml ddH2O do roztworu roboczego (1x), a następnie przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu za pomocą buforu do przenoszenia białek (1x).</li>
	<li>Zablokuj membranę w 5% odtłuszczonym mleku za pomocą 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej tris z 0,05% Tween 20 (TBST) w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godz. 
	UWAGA: W tym protokole zmieszaj 100 ml 10x TBST (patrz Tabela materiałów) z 900 ml ddH2O w roztworze roboczym.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami królika przeciwko RSV lub LssgMP (oba 1:10000) rozcieńczonymi w TBST w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny 
	UWAGA: Produkcja pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko RSV została wspomniana powyżej. Firma biotechnologiczna wyprodukowała królicze przeciwciało poliklonalne anty-LssgMP przeciwko peptydowi LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.</li>
	<li>Przemyć membranę trzykrotnie TBST przez 10 minut inkubacji za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować błonę z kozimi przeciwciałami antykróliczymi sprzężonymi z peroksydazą chranu, rozcieńczonymi w 1:10000 TBST.</li>
	<li>Rozwijaj immunobloty za pomocą ulepszonego systemu wykrywania blottingu Western Blotting w chemiluminescencji.</li>
</ol>
7. Wykrywanie wzorca wyrażenia LssgMP w SBPH
<ol>
	<li>Unieruchomić owady w temperaturze 4 °C na 5 minut.</li>
	<li>Umyj owady 75% etanolem i ddH2O jeden po drugim, a następnie rozbioruj owady we wstępnie schłodzonym TBS (0,01 M soli fizjologicznej buforowanej Tris).</li>
	<li>Wypreparować owady z brzucha, odcinając przednie kończyny SBPH w stawie koksy-krętarza za pomocą kleszczy; umyć jelito środkowe i gruczoły ślinowe dwukrotnie w TBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z hemolimfy.</li>
	<li>Umieść pięć tkanek w probówce wolnej od RNaz o pojemności 1,5 ml, aby wyekstrahować RNA. Każdą probówkę należy traktować jako jedną próbkę.</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję RNA zgodnie z protokołami producenta i metodą PCR Z ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), aby zbadać względne poziomy ekspresji transkryptu LssgMP w ekstraktach całego ciała lub różnych tkanek L. striatellus. 
	UWAGA: Pary starterów użyte do amplifikacji genów to LssgMP-q-F/LssgMP-q-R, qPCR na bazie SYBR Green przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Poziom transkryptu czynnika wydłużenia translacji L. striatellus 2 (ef2) określono ilościowo za pomocą pary starterów ef2-q-F/ef2-q-R w celu normalizacji matryc cDNA. A sekwencje starterów są załączone poniżej:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li>
<li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Pathology+Journal%22%5BJournal%5D)">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li>
<li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+rice+stripe+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636(2014).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949(2014).</li>
<li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082(2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312(2019).</li>
<li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion%2C+detoxification+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li>
<li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li>
<li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216(2010).</li>
<li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper%2C+Nilaparvata+lugens+%28St%C3%A5l%29+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS%2FMS+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li>
<li>Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers%2C+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+%28Hemiptera%3A+Delphacidae%29%3A+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li>
<li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254(2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li>
<li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li>
<li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-like+protein%2C+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li>
<li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li>
<li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+a+brown+planthopper+%28Nilaparvata+lugens+St%C3%A5l%29+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice%2C+Oryza+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper%2C+Laodelphax+striatellus%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li>
<li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840(2016).</li>
<li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li>
<li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vat%2C+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry%3A+from+molecular+structure+to+field+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420(2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Udane hodowanie owadów na sztucznych dietach zostało po raz pierwszy odnotowane w 1962 roku, kiedy Mittler i Dadd opisali technikę membrany parafinowej w celu utrzymania sztucznej diety29,30. Metoda ta została zbadana w wielu aspektach biologii i zachowania owadów, na przykład suplementacji składników odżywczych, karmienia dsRNA i pozyskiwania wirusów. Opierając się na wymaganiach analizy śliny, 5% sacharoza jest stosowana jako ogólna sztuczna dieta do zbierania ...

Wirus pasiastek ryżowych (RSV), wirus RNA o ujemnej nici z rodzaju Tenuivirus, powoduje poważne choroby w produkcji ryżu w Azji Wschodniej1,2,3. Przenoszenie wirusa RSV z zakażonych roślin ryżu na zdrowe zależy od wektorów owadów, głównie Laodelphax striatellus, który przenosi RSV w sposób trwały i propagacyjny. SBPH nabywa wirusa po żerowaniu na roślinach zakażonych RSV. Po dostaniu się do organizmu owada wirus RSV infekuje komórkę nabłonka jelita środkowego dzień po karmieniu, a następnie przechodzi przez barierę jelita środkowego, aby przeniknąć do hemolimfy. Następnie wirus RSV rozprzestrzenia się do różnych tkanek za pośrednictwem hemolimfy, a następnie rozprzestrzenia się. Po okresie utajenia trwającym około 10-14 dni po nabyciu, wirus wewnątrz gruczołu ślinowego może zostać przeniesiony do zdrowych roślin żywicielskich poprzez wydzielaną ślinę, podczas gdy SBPH wysysa sok z łyka4,5,6,7,8,9,10. Wydajny proces odżywiania i różne czynniki w ślinie są niezbędne do rozprzestrzeniania się wirusa RSV z owada na roślinę żywicielską.
Uważa się, że ślina owadów wydzielana przez gruczoły ślinowe pośredniczy w owadach, wirusach i roślinach żywicielskich. Owady z rodzaju hemipteran zwykle wytwarzają dwa rodzaje śliny: ślinę żelującą i ślinę wodnistą11,12,13. Żelująca ślina jest wydzielana głównie do apoplazmy w celu podtrzymania ruchu trzpienia między komórkami gospodarza, a także jest związana z przezwyciężaniem odporności roślin i odpowiedzi immunologicznej14,15,16,17. Na etapie sondowania żerowania owady sporadycznie wydzielają żelującą ślinę, która natychmiast utlenia się, tworząc kołnierz powierzchniowy. Następnie pojedyncze lub rozgałęzione osłony otaczają styl, aby zarezerwować kanał rurowy18,19,20. Zakłada się, że kołnierz powierzchniowy na naskórku ułatwia penetrację trzpienia, służąc jako punkt zaczepienia, podczas gdy osłonki wokół trzpienia mogą zapewniać stabilność mechaniczną i smarowanie16,21,22,23. Nlshp uznano za białko niezbędne do tworzenia osłonki ślinowej i skutecznego odżywiania skoczka brunatnego (Nilaparvata lugens, BPH). Hamowanie ekspresji białka osłonki strukturalnej (SHP) wydzielanego przez mszycę Acyrthosiphon pisum zmniejszyło jej rozmnażanie poprzez zakłócenie karmienia z probówek sitowych gospodarza24. Co więcej, u niektórych gatunków owadów uważa się, że żelowe czynniki śliny wywołują odpowiedź immunologiczną roślin poprzez tworzenie tak zwanych wzorców molekularnych związanych z roślinożercami (HAMP). U N. lugens, NlMLP, białko podobne do mucyny związane z tworzeniem osłonki, indukuje obronę roślin przed żerowaniem, w tym śmierć komórki, ekspresję genów związanych z obroną i odkładanie kalozy 25,26. Udowodniono również, że niektóre żelowe czynniki śliny u mszyc wywołują reakcje obronne roślin poprzez interakcje między genami podobne do wzorców molekularnych związanych z patogenami12,15,27.
Do badania czynników wydzielania śliny niezbędnych do odżywiania owadów i/lub przenoszenia patogenów, konieczne jest przeanalizowanie wydzielanej śliny. W tym miejscu opisano metody sztucznego karmienia i pobierania w celu uzyskania wystarczającej ilości śliny do dalszej analizy. Używając pożywki zawierającej tylko jeden składnik odżywczy, zebrano wiele białek śliny i przeanalizowano je za pomocą barwienia srebrem i western blot. Metoda ta będzie pomocna w dalszych badaniach nad czynnikami w ślinie, które są niezbędne do transmisji RSV przez SBPH.

<table><tbody><tr><td>Filtr odśrodkowy 10-KD</td><td>Merck Millipore</td><td>R5PA83496</td><td>Do koncentracji</td></tr><tr><td>10x Bufor do transferu białek (mokry)</td><td>macGENE</td><td>MP008</td><td>Bufor transferowy do western blotting</td></tr><tr><td>10x bufor TBST</td><td>Coolaber</td><td>SL1328-500mL&razy; 10</td><td>Bufor płuczący do western blotting</td></tr><tr><td>Azure c600 biosystems</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure c600</td><td>System obrazowania do western blotting i barwienia srebrem</td></tr><tr><td>Kolor Prestained protein ladder</td><td>GenStar</td><td>M221-01</td><td>Marker białkowy do western blot</td></tr><tr><td>ECL&nbsp; Odczynniki do wykrywania Western Blot</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2209</td><td>Wykrywanie Western blot</td></tr><tr><td>Ulepszony zestaw chromogenny HRP-DAB</td><td>TIANGEN</td><td></td>#PA110 <td>Reakcja chromogenna</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową Sigma</td><td></td><td>401393-2ML</td><td>Poliklonalne przeciwciało drugorzędowe do western blotting</td></tr><tr><td>Immobilon(R)-P Membrana z polifluorku winylidenu</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Membrana transferowa do western blotting</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125</td><td>Do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)</td></tr><tr><td>KIT, iSCRIPT cDNA SYNTHES</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>Do odwrotnej transkrypcji PCR (RT-PCR)</td></tr> <tr><td>Millex-GP Filter, 0,22 i mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Do filtracji</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAB TGX Żele</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td>Do SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>Wykrywanie stężenia białka</td></tr><tr><td>Membrana nylonowa</td><td>PALL</td><td>T42754</td><td>Membrana do dot-ELISA</td></tr><tr><td>Parafilm M Membrana</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Tworzenie sztucznej diety kanapki</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-LssgMP przeciwko peptydom LssgMP</td><td>Genstript</td><td></td><td>Królik pierwszorzędowe przeciwciało poliklonalne anty-LssgMP do western blotting</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-RSV</td><td>Genstript</td><td></td><td>Królik pierwszorzędowe przeciwciało poliklonalne anty-RSV do western blotting i kropki ELISA</td></tr><tr><td>RNAprep czysty Micro Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP420</td><td>do ekstrakcji RNA</td></tr></tbody></table>

dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny laodelphax striatellus

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Wirus pasiasty ryżu (RSV), który powoduje znaczne straty ekonomiczne w rolnictwie w Azji Wschodniej, jest całkowicie zależny od wektorów owadów w celu skutecznego przenoszenia się między ryżem gospodarza. Laodelphax striatellus (mały brązowy skoczek roślinny, SBPH) jest głównym wektorem owadów, który poziomo przenosi RSV podczas wysysania soku z łyka. Ślina odgrywa znaczącą rolę w zachowaniach żywieniowych owadów. Wygodna metoda, która przyda się do badań nad śliną owadów o zachowaniu żywieniowym przekłuwająco-ssącym, jest opisana tutaj. W tej metodzie owadom pozwolono żywić się sztuczną dietą umieszczoną między dwiema rozciągniętymi warstwami filmu parafinowego. Dieta zawierająca ślinę była zbierana każdego dnia, filtrowana i zagęszczana do dalszej analizy. Na koniec zbadano jakość pobranej śliny za pomocą barwienia białek i immunoblottingu. Przykładem tej metody było wykrycie obecności wirusa RSV i białka podobnego do mucyny w ślinie SBPH. Te metody sztucznego karmienia i pobierania śliny stworzą podstawy do dalszych badań nad czynnikami w ślinie owadów związanymi z zachowaniami żywieniowymi i przenoszeniem wirusa.

Schematy instalacji do sztucznego karmienia i pobierania śliny 
Rysunek 1A przedstawia szklany cylinder (15 cm x 2,5 cm) wykorzystywany jako komora karmienia do pobierania śliny. Najpierw larwy SBPH poddano głodzeniu przez kilka godzin w celu zwiększenia wydajności pobierania, a następnie unieruchomiono poprzez schładzanie przez 5 min. Po przeniesieniu owadów do szklanego cylindra oba otwarte końce komory pokryto rozciągniętą membraną parafinową. Na jednym końcu 200 µL 5%...

Obecny protokół opisuje metodę zbierania wystarczającej ilości śliny od owadów wysysających za pomocą sztucznego podłoża. Jest to wygodna metoda zbierania śliny owadów i badania funkcji śliny pod kątem zachowań żywieniowych owadów i przenoszenia wirusa przenoszonego przez wektory.

Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Sztuczne karmienie i pobieranie śliny stanowi bezpośrednią metodę wykrywania efektorów w ślinie owadów. Nie zostało to jednak wcześniej szczegółowo opisane. Protokół ten jest skuteczny w zbieraniu śliny z owadów saprofitycznych.Dodatkowo jest to prosta technika, ponieważ jako sztuczną dietę używamy pożywki zawierającej tylko sacharozę. Ślina owadów saprofitycznych może wpływać na układ odpornościowy gospodarza, korzystnie wpływając na zachowania żywieniowe i przenosząc patogeny. Jest to lek, który może być stosowany do zachowania owadów i badań nad ścieżkami kostnymi owadów.Jest to prosta metoda do wykonania. Sugeruje to jednak montaż czystego środowiska eksperymentalnego, ponieważ ślina jest zbierana do dalszych badań. Zacznij od przygotowania 5% roztworu sacharozy do sztucznej diety i przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć zanieczyszczenia bakteryjne i zanieczyszczenia.Zagłodź około 200 małych brązowych larw leja roślinnego przez trzy do pięciu godzin przed wprowadzeniem ich do komory karmienia. Następnie, aby przygotować szklane cylindry jako komory do karmienia, przykryj jeden otwarty koniec komory membraną parafinową przed wprowadzeniem eksperymentalnych owadów, a następnie przenieś owady do szklanego cylindra i przykryj drugi koniec komory rozciągniętą membraną parafinową. Dodaj 200 mikrolitrów sztucznej diety na membranę, a następnie przykryj płyn kolejną warstwą rozciągniętej membrany parafinowej.Na koniec przykryj komorę folią aluminiową, pozostawiając koniec z urządzeniem do sztucznej diety wystawionym na działanie światła. Po 24 godzinach zbierz ślinę SBPH, schładzając cylinder w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby unieruchomić owady, a następnie odkryj zewnętrzną folię i zbierz sztuczną dietę do sterylnych probówek o pojemności 1,5 mililitra za pomocą sterylnej pipety. Utrzymuj zebraną ślinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy.Następnie przepłucz wewnętrzną membranę trzykrotnie 50 mikrolitrami świeżej sztucznej diety, delikatnie pipetując, a następnie zbierz sztuczną dietę myjącą do sterylnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Po trzech płukaniach dodaj świeżą sztuczną dietę na wewnętrzną membranę i umieść świeżo rozciągniętą membranę parafinową na wierzchu. Na koniec przefiltruj zebrane próbki przez jednostkę filtrującą o wielkości 0,22 mikrona, aby usunąć drobnoustroje i inne zanieczyszczenia.Przenieś zbiorcze próbki śliny do filtra odśrodkowego o pojemności 500 mikrolitrów i 10 kilodaltonów. Odwirować próbkę. Zebrać supernatant i zwiększyć końcową objętość do 100 mikrolitrów.Aby zmierzyć stężenie pobranej śliny, włącz spektrofotometr UV i umyj cokoły trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Wybierz opcje na ekranie w następującej kolejności, białka, białko A280. Wybierz typ i jedną jednostkę absorbancji równą jednemu miligramowi na mililitr.Następnie zaznacz pole korekcji linii bazowej, 340 nanometrów. Następnie załaduj dwa mikrolitry 5% wodnego roztworu sacharozy jako ślepą próbę, a następnie dotknij opcji Puste u dołu ekranu. Na koniec, po ustaleniu norm, załaduj dwa mikrolitry pobranej śliny i zapisz stężenie białka.Przy karmieniu 5% sacharozą ponad 80% SBPH przeżyło przez pierwsze cztery dni. Jednak od piątego dnia śmiertelność szybko wzrosła do 40%, a siódmego dnia przeżyła mniej niż połowa SBPH. Analiza strony SDS wykazała, że skoncentrowane próbki śliny ze śliny SBPH zakażonej RSV zawierały znacznie więcej białek niż 5% kontrola ujemna sacharozy.W analizie Western blot w celu wykrycia białka kapsydu RSV, niezakażonych i zjadliwych owadów. Białko kapsydu RSV zostało pomyślnie wykryte w próbce wiruliferycznej, przeciwciało zaprojektowane przeciwko produktowi genu LssgMP wykryło białko 78 kilodaltonów w próbkach niezakażonych i wirusowych, wykazując, że LssgMP jest białkiem śliny. Analiza QRT PCR poziomów transkryptu LssgMP w różnych tkankach wykazała, że poziomy transkryptu Lssg w gruczole ślinowym były 20-krotnie wyższe niż w całym ciele i jelitach, potwierdzając specyficzną ekspresję LssgMP w gruczole ślinowym.Zagłodzenie eksperymentalnych owadów przed wprowadzeniem ich do komory jest konieczne, aby zapewnić skuteczność naszego zbierania śliny. Poza tym co 24 godziny należy pobierać i wymieniać sztuczne podłoże w celu zmniejszenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego pobranej próbki. Technika ta zapewnia bezpośrednią metodę badania funkcji śliny w przenoszeniu patogenów.Dodatkowo może pomóc w badaniu interakcji patogenów owadów z gospodarzem.

two-layered-membrane-sandwich-method-for-laodelphax-striatellus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Ten film opisuje gruczoł limfatyczny Drosophila - główne miejsce hematopoezy u larw muchy - i pokazuje przykładowy protokół do preparowania i montowania narządu do immunohistochemii i obrazowania fluorescencyjnego.

Rozwarstwienie gruczołów limfatycznych larw: izolowanie narządu wytwarzającego hemocyty Drosophila

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Przedstawiona tutaj jest metoda nawożenia kleszczy krwią in vitro za pomocą systemu sztucznej błony, aby umożliwić częściowe lub pełne zagęszczenie różnych etapów życia kleszcza.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Poznaj dwuwarstwową metodę kanapkową do zbierania śliny Laodelphax striatellus. Protokół umożliwia badanie funkcji śliny w transmisji patogenów i interakcjach owad-gospodarz.

Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Przeglądaj więcej filmów