Name: Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę oceny terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca przy użyciu dużego modelu zwierzęcego. Protokół obejmuje echokardiografię, angiografię koronarną i mapowanie elektroanatomiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Marii Hedman, Tiinie Laitinen, Tomiemu Laitinenowi, Pekce Poutiainen, Annice Viren i Severi Sormunen za pomoc i zgodę na obrazowanie 15O-PET w Szpitalu Uniwersyteckim w Kuopio; oraz Heikki Karhunen, Minna Törrönen i Riikka Venäläinen z National Laboratory Animal Center za pomoc w pracy ze zwierzętami.
To badanie jest wspierane przez granty z Fińskiej Akademii, ERC i grantu CardioReGenix EU Horyzont 2020.

Przedstawione tutaj eksperymenty są przeprowadzane na około 10-tygodniowych samicach świń domowych i są zatwierdzone przez Radę Doświadczalną na Zwierzętach w Finlandii. Zwierzęta ważą 30-40 kg na początku protokołu, co pozwala na ten sam sprzęt zabiegowy i metody obrazowania, jakie są możliwe dla ludzi. Przewlekłe niedokrwienie jest wywoływane 14 dni przed transferem genów, a czas obserwacji po transferze genów zależy od użytego wektora wirusowego. Protokół badania jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Protokół ten może być stosowany do wykonywania zastrzyków terapii genowej za pośrednictwem adenowirusa lub AAV. Czas pobierania próbki musi być dostosowany do piku ekspresji transgenu, który zależy od użytego wektora wirusowego. Na przykład podczas wykonywania transferów genów adenowirusowych czas pobrania próbki jest ustawiony na 6 dni po transferze genów.
1. Leki
<ol>
	<li>Podawać dawkę dobową 200 mg amiodaronu i 2,5 mg bisoprololu w celu zapobieżenia śmiertelnym komorowym zaburzeniom rytmu serca. Leczenie rozpoczyna się 1 tydzień przed operacją niedokrwienia i jest kontynuowane codziennie aż do wizyty kontrolnej.</li>
	<li>Ponadto należy podawać zwierzętom doustne dawki klopidogrelu (300 mg) i kwasu acetylosalicylowego (300 mg) na 1 dzień przed operacją niedokrwienia, aby zapobiec ostrej zakrzepicy w stencie po umieszczeniu stentu.</li>
	<li>Na początku operacji niedokrwienia należy podać dożylnie 100 mg lidokainy i 2,5 ml (246 mg/ml)MgSO4 zwierzętom, aby zapobiec komorowym zaburzeniom rytmu serca.</li>
	<li>Podać domięśniowe wstrzyknięcie cefuroksymu (500 mg) na początku każdej operacji w celu zapobiegania zakażeniom.</li>
	<li>Podawać 30 mg enoksaparyny dożylnie na początku operacji niedokrwienia i podskórnie po zabiegu operacyjnym w celu zapobiegania zakrzepicy.</li>
	<li>W celu znieczulenia i znieczulenia należy podać 1,5 ml atropiny, 6 ml azaperonu (40 mg/ml), propofolu 20 mg/ml z szybkością 15 mg/kg / h i fentanylu 50 μg/ml z szybkością 10 μg/kg/h. Dawki leku były takie same dla każdej świni. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi stosowania u zwierząt w celu podania dawki.</li>
	<li>Znieczulaj zwierzęta podczas wszystkich operacji. Wszystkie operacje powinny być wykonywane w sterylnym środowisku przy użyciu sterylnej techniki.</li>
</ol>
2. Echokardiografia przezklatkowa
<ol>
	<li>Wykonaj echokardiografię przezklatkową przed operacją niedokrwienia, transferem genów i eutanazją, aby ocenić wykrywalny płyn osierdziowy i określić szczep mięśnia sercowego.</li>
	<li>Umieść przetwornik w trzeciej lub czwartej przestrzeni międzyżebrowej pod pachą świni, aby uzyskać dostęp do krótkich widoków przymostkowych na poziomie zastawki mitralnej, mięśnia brodawkowatego i poziomu wierzchołkowego (wideo 1). Znacznik przetwornika powinien wskazywać mostek świni. Aby zapisać klip, naciśnij przycisk Pobierz.</li>
</ol>
3. Operacje wewnątrznaczyniowe pod kontrolą fluoroskopową
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie cine lewej komory po angiogramach wieńcowych przed operacją niedokrwienia, transferem genów i pobraniem tkanek.</li>
	<li>Przygotowanie do operacji
	<ol>
		<li>Przygotować się do operacji, uspokajając świnie wstrzyknięciem domięśniowym 1,5 ml atropiny i 6 ml azaperonu.</li>
		<li>Po sedacji należy wprowadzić znieczulenie ogólne propofolem i fentanylem do zabiegów angiograficznych u świń w dawkach odpowiednio 15 mg/kg/h i 10 μg/kg/h. 
		UWAGA: Świnie są znieczulane na cały zabieg.</li>
		<li>Wspomaganie wentylacji poprzez intubację i respirator oraz monitorowanie parametrów fizjologicznych, takich jak EKG i parametry oddechowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczenie osłony wprowadzającej
	<ol>
		<li>Umieść osłonkę wprowadzającą w prawej tętnicy udowej dla wszystkich operacji, co jest standardową praktyką w kardiologii. Użyj ultradźwięków, aby śledzić tętnicę udową i przekłuć ją igłą wejściową (18 G). 
		UWAGA: Użyj osłonki wprowadzającej 8F do transferu genów do mięśnia sercowego i osłonki 6F do wszystkich innych operacji. Przełóż prowadnik osłonki przez igłę, aby przewlec tętnicę i przytrzymaj prowadnik nieruchomo podczas wyjmowania igły.</li>
		<li>Włóż osłonkę wprowadzającą wzdłuż prowadnika, a po umieszczeniu usuń prowadnik i podaj świni 1,25 mg diazotanu podjęzykowego w celu wywołania rozszerzenia naczyń wieńcowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Koronarografia
	<ol>
		<li>Wykonaj koronarografię bezpośrednio przed operacją niedokrwienia, transferem genów i pobraniem tkanek. Maszyneria potrzebna do wykonania angiogramów jest pokazana na Rysunek 2.</li>
		<li>Użyj cewnika 6F pod kontrolą fluoroskopową z jodowym środkiem kontrastowym, aby zobrazować prawą tętnicę wieńcową i lewą wstępującą tętnicę wieńcową (wideo 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie cine lewej komory w spoczynku i stresie dobutaminy
	<ol>
		<li>Podaj 21 ml bolusa jodowego środka kontrastowego do lewej komory za pomocą cewnika warkoczowego 5F za pomocą automatycznego wstrzykiwacza. Najpierw ustaw czas trwania bolusa na 3 s, a całkowitą objętość na 21 ml. Następnie naciśnij Pojedynczy i Tak.</li>
		<li>Obliczyć frakcję wyrzutową za pomocą oprogramowania pomiarowego stacji roboczej angiograficznej. Aby wykonać obliczenia, wybierz opcję Analiza komorowa danego obrazu. Przewiń obraz, aby wybrać przedział czasowy, jeden w rozkurczu i jeden w skurczu. Wybierz narzędzie, aby narysować kontury komór dla każdego przedziału czasowego. 
		UWAGA: Oprogramowanie oblicza teraz frakcję wyrzutową i objętość wyrzutową metodą Simpsona. Pomiar frakcji wyrzutowej wykonywany jest w stanie spoczynku i pod wpływem stresu wywołanego dobutaminą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie stresu
	<ol>
		<li>Dobutaminę należy podawać dożylnie w dawkach rosnących od 10 μg/kg/min do 20 μg/kg/min w przypadku obrazowania stresu wywołanego dobutaminą, aż do osiągnięcia docelowej częstości akcji serca 160 uderzeń na minutę. Następnie wykonaj obrazowanie filmowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Operacja niedokrwienia
	<ol>
		<li>Umieścić stent z wąskim gardłem w lewej tętnicy wieńcowej (LAD) 14 dni przed transferem genu w celu wywołania przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego. Po umieszczeniu stentu z wąskim gardłem sprawdź, czy stent z wąskim gardłem jest prawidłowo umieszczony, ograniczając przepływ krwi w naczyniach wieńcowych. 
		UWAGA: Stent z wąskim gardłem jest umieszczany na cewniku rozszerzającym i składa się ze stentu z gołego metalu pokrytego rurką z politetrafluoroetylenu uformowaną w kształt wąskiego gardła w celu zmniejszenia przepływu krwi w naczyniach wieńcowych9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definiowanie rozmiaru stentu
	<ol>
		<li>Wybierz rozmiar stentu, 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, zgodnie z rozmiarem lewej wstępującej tętnicy wieńcowej w angiogramie, korzystając z oprogramowania do automatycznego pomiaru w stacji roboczej angiograficznej (Wideo 3)12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmieszczenie stentu
	<ol>
		<li>Umieść cewkę w lewej tętnicy wieńcowej i wsuń stent z wąskim gardłem do LAD, umieszczając go dystalnie do pierwszej przekątnej.</li>
		<li>Napompuj stent do nominalnego ciśnienia w tętnicy za pomocą deflatora o stosunku stentu do światła 1,3, zakotwiczając wąskie gardło na miejscu. Po upływie dodatkowych 15 s należy opróżnić stent i wycofać sprzęt z tętnicy. 
		UWAGA: Potwierdź prawidłowe umieszczenie stentu z wąskim gardłem za pomocą angiogramu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie PET
UWAGA: Dzień przed transferem genów wykonaj 15skanów PET/CT radiowodnych z oznaczeniem O (wymaga środowiska szpitalnego i techników radiologicznych).
<ol>
	<li>Obrazowanie referencyjne
	<ol>
		<li>Wykonaj tomografię komputerową (CT) przed obrazowaniem odpoczynku i stresu. Użyj informacji z CT do korekcji tłumienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>15Obrazowanie wody radiowej z oznaczeniem O
	<ol>
		<li>Wykonaj obrazowanie spoczynku i stresu za pomocą bolusa 800 MBq 15H2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie stresu
	<ol>
		<li>Wykonać obrazowanie naprężeń za pomocą kolejnego bolusa wodnego 800 MBq 15O, po odpowiednim rozpadzie promieniotwórczym wynoszącym 12 min. 
		UWAGA: Przekrwienie jest wywoływane przez adenozynę (200 μg/kg/min dożylnie), jak opisano wcześniej12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Transfer genów
<ol>
	<li>Mapowanie elektroanatomiczne
	<ol>
		<li>Przejdź do mapowania elektroanatomicznego po angiogramie wieńcowym i pomiarach funkcjonalnych (echokardiografia, obrazowanie LV cine).</li>
		<li>Wprowadzić cewnik mapujący do lewej komory przez osłonkę kości udowej pod kontrolą fluoroskopową. 
		UWAGA: Zarejestruj około 100-150 punktów wokół lewej komory za pomocą cewnika mapującego, aby utworzyć mapę elektroanatomiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykończenie mapy elektroanatomicznej
	<ol>
		<li>Usuń punkty odstające, aby zapewnić bardziej wiarygodną mapę elektroanatomiczną lewej komory.</li>
		<li>W tym celu należy wybrać opcję Płaszczyzny tnące mapy i usunąć punkty, które różnią się od punktów tworzących kształt komory. Następnie wybierz opcję Trajektorie dla widoku mapy i usuń punkty, które przebyły się poziomo podczas rejestrowania punktów. 
		UWAGA: Upewnij się, że pozostałe punkty pokrywają lewą komorę i w razie potrzeby zarejestruj więcej punktów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastrzyki z transferu genów
	<ol>
		<li>Wprowadzić cewnik do iniekcji domięśniowej serca do lewej komory przez osłonkę kości udowej pod kontrolą fluoroskopową. Ustawić długość igły iniekcyjnej na 3 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kryteria wstrzyknięć do mięśnia sercowego
	<ol>
		<li>Kieruj transferami genów za pomocą systemu mapowania elektroanatomicznego i kieruj wstrzyknięcia do żywotnych, ale hipokinetycznych obszarów lewej komory. 
		UWAGA: Aby uzyskać żywotność, jako kryterium należy użyć jednobiegunowego napięcia powyżej 5 mV. W przypadku hipokinezji wybierz lokalne skracanie liniowe (LLS) tak niskie, jak to możliwe, co najmniej poniżej 12%, ale najlepiej poniżej 6%13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcje domięśniowe
	<ol>
		<li>W ciągu 30 s wstrzyknąć materiał wektorowy do punktu selekcji (krok 5.4) i trzymać igłę do wstrzykiwań wewnątrz mięśnia sercowego przez dodatkowe 5 sekund przed wycofaniem, aby zapobiec cofaniu się do lewej komory.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Eutanazja i pobieranie próbek
UWAGA: Po pomiarach angiogramu wieńcowego i frakcji wyrzutowej opisanych odpowiednio w krokach 3.4.1 i 3.5.2, podaj dożylnie 50 ml nasyconego chlorku potasu znieczulonej świni.
<ol>
	<li>Utrwalenie perfuzji serca
	<ol>
		<li>Zbierz serce z jamy klatki piersiowej. Spłucz wodą. Umieść igłę 18 G nad zastawką aortalną i podłącz igłę do pompy perfuzyjnej. Perfuzja serca za pomocą 750 ml 1% paraformaldehydu (PFA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Pokrój serce na plastry o grubości 1 cm za pomocą ostrego noża kuchennego. Pobrać próbki z obszaru transferu genów do 4% PFA i ciekłego azotu. 
		UWAGA: Aby pobrać kontrole ujemne, należy pobrać próbkę kontrolną z tylnej ściany lewej komory.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpieczne pobieranie tkanek
	<ol>
		<li>Pobieraj próbki z odległych tkanek, takich jak płuca, wątroba, nerki, śledziona i jajniki. Pobrać próbki do 4% PFA i ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Próbki do barwienia należy przechowywać w 4% PFA przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Codziennie wymieniaj PFA na świeży płyn.
	<ol>
		<li>Po 48 godzinach zastąp PFA 15% sacharozą w wodzie dejonizowanej. Przechowywać przez co najmniej 24 godziny przed umieszczeniem próbek w blokach parafinowych. Próbki zamrożone błyskawicznie przechowuje się w temperaturze -70 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specifc+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Knuuti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2019+ESC+Guidelines+for+the+diagnosis+and+management+of+chronic+coronary+syndromes%3A+The+Task+Force+for+the+diagnosis+and+management+of+chronic+coronary+syndromes+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).</li>
<li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+refractory+angina%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Management of refractory angina: An update.</a> European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+gene+therapy%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future.</a> Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).</li>
<li>Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+cardiovascular+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in cardiovascular gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).</li>
<li>Hammond, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+gene+transfer+of+adenylyl+cyclase+6+in+patients+with+heart+failure%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).</li>
<li>Hartikainen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+intramyocardial+VEGF-DDNDC+gene+transfer+increasesmyocardial+perfusion+reserve+in+refractory+angina+patients%3A+A+phase+I%2FIIa+study+with+1-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up.</a> European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).</li>
<li>Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+cardiovascular+gene+therapy+and+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).</li>
<li>Roth, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+left+circumflex+Ameroid+constrictor+placement+on+adrenergic+innervation+of+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).</li>
<li>White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+collateral+development+in+swine+after+coronary+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion.</a> Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).</li>
<li>Liu, C. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stromal+cells+improve+left+ventricular+function%2C+perfusion%2C+and+remodeling+in+a+porcine+model+of+chronic+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).</li>
<li>Rissanen, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+stent+model+for+chronic+myocardial+ischemia+and+heart+failure+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).</li>
<li>Greenberg, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doppler-derived+myocardial+systolic+strain+rate+is+a+strong+index+of+left+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility.</a> Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).</li>
<li>Grönman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+myocardial+viability+with+%5B15O%5Dwater+PET%3A+A+validation+study+in+experimental+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction.</a> Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).</li>
<li>Tarkia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+68Ga-labeled+tracers+for+PET+imaging+of+myocardial+perfusion+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs.</a> Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).</li>
<li>Gyöngyösi, M., Dib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+3D+NOGA+mapping+in+ischemic+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease.</a> Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).</li>
<li>Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+of+atherosclerosis+-+New+tools+for+persistent+problems+in+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine.</a> Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Punkty czasowe tego protokołu mogą być modyfikowane w zależności od użytego wektora wirusowego. Również analizy immunohistologiczne mogą być dobrane w zależności od genu terapeutycznego. W razie potrzeby możliwe jest również dodanie większej liczby punktów czasowych i końcowych do protokołu.
Protokół ten składa się z etapów, które są niezbędne do powodzenia i niemożliwe do późniejszego skorygowania. Po pierwsze, jeśli nie uda się wywołać odpowiedniego niedokrwienia, zwierzę musi zostać wyklucz...

Choroba wieńcowa jest odpowiedzialna za ogromną część śmiertelności i obciążenia chorobami na całym świecie1. Obecne strategie leczenia to interwencje przezskórne, leczenie farmakologiczne i operacja pomostowania2. Jednak pomimo postępu tych obecnych metod terapeutycznych, wielu pacjentów cierpi na tak zwaną oporną na leczenie dławicę piersiową, co podkreśla niezaspokojoną potrzebę nowych metod leczenia3. Angiogeneza terapeutyczna za pośrednictwem terapii genowej może być ukierunkowana na tę grupę pacjentów.
Terapia genowa mięśnia sercowego jest najczęściej dostarczana przy użyciu różnych wektorów wirusowych, najczęściej adenowirusa z niedoborem replikacji4. Jako geny terapeutyczne stosuje się różne angiogenne czynniki wzrostu. Najbardziej istotnie zbadanymi angiogennymi czynnikami wzrostu są czynniki wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), które pośredniczą w sygnalizacji angiogennej poprzez receptory czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR) i ich koreceptory5. Kilka badań klinicznych dowiodło korzyści i bezpieczeństwa terapii genowej serca i sprawiło, że ta nowatorska metoda leczenia stała się realistyczną opcją leczenia chorób niedokrwiennych serca6,7. Jednak koncepcja ta nadal wymaga ulepszenia genów terapeutycznych i wektorów wirusowych, które są testowane na dużych modelach zwierzęcych przed wejściem do klinik. Świnia była często używana jako zwierzę laboratoryjne, ponieważ jej serce jest bardzo podobne do serca ludzkiego. Wielkość układu sercowo-naczyniowego świni pozwala na stosowanie podobnych wynalazków cewników, jakie stosuje się u ludzi. Wszystkie metody obrazowania dostępne dla ludzi mogą być stosowane u świń8.
Istnieje kilka dużych modeli zwierzęcych dla przewlekłego niedokrwienia. Najczęściej używany jest model dusiciela ameroid9,10,11. Wadą tej metody jest inwazyjność, ponieważ torakotomia jest potrzebna, aby uzyskać dostęp do naczyń wieńcowych. Wcześniej w naszej grupie opracowano miniinwazyjny model stentu z wąskim gardłem dla przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego12. Metoda ta jest również stosowana w tym manuskrypcie do wywoływania niedokrwienia mięśnia sercowego.
Użyteczność obrazowania ultradźwiękowego znacznie się rozwinęła, pomimo wieku tej metody obrazowania. Na przykład szczep mięśnia sercowego jest nadal używany głównie w badaniach ze względu na swoją nowość. Szczep mięśnia sercowego odzwierciedla zmiany w funkcji skurczowej serca lepiej niż tradycyjny pomiar frakcji wyrzutowej w trybie M13. Tak więc tutaj, w dużym modelu zwierzęcym, wykorzystuje się pomiar obciążenia mięśnia sercowego. Aby ocenić czynność serca, rzut serca mierzy się również za pomocą obrazowania kinowego lewej komory podczas angiografii. Pojemność minutowa serca jest mierzona zarówno w spoczynku, jak i pod wpływem stresu wywołanego dobutaminą w celu oceny funkcji mięśnia sercowego w warunkach stresu.
Oprócz pomiarów funkcji serca, informacje na temat perfuzji mięśnia sercowego są niezbędne w badaniach nad terapią genową mającą na celu terapeutyczną angiogenezę. W tym modelu zwierzęcym zwierzęta są obrazowane za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej radiowodnej znakowanej 15O (15H2O-PET), ponieważ jest to złoty standard pomiaru perfuzji mięśnia sercowego. 15H2O-PET został wcześniej zatwierdzony do pomiaru perfuzji niedokrwionego serca świni 14.
Tak więc, metody i modalności wymienione powyżej stanowią doskonałą perspektywę do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwionym sercu.

<table><tbody><tr><td>1% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Przygotowany z proszku paraformaldehydu</td></tr><tr><td>15 % sacharozy</td><td>VWR</td><td>VWRC27480.294</td><td>Przygotowany ze stałej sacharozy</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Przygotowany z proszku paraformaldehydu</td></tr><tr><td>5 F Cewnik warkoczowy</td><td>Cordis</td><td>534-550S</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 6 F AR2</td><td>Cordis</td><td>670-112-00</td><td></td></tr><tr><td>6 F osłona wprowadzająca</td><td>Cordis</td><td>504-606X</td><td></td></tr><tr><td>8 F osłona wprowadzająca</td><td>Cordis</td><td>504-608X</td><td></td></tr><tr><td>Kwas acetylosalicylowy</td><td></td><td></td><td>Zmienny producent</td></tr><tr><td>Amiodaron</td><td></td><td></td><td>Zmienny producent</td></tr><tr><td>Stacja angiograficzna</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw angiolaboratoryjny</td><td>M&ouml; </td><td></td><td>Zaprojektowany na potrzeby naszego angiolaboratorium, zawiera sterylne serwety, kubki i waciki</td></tr><tr><td>Bisoprolol</td><td></td><td></td><td>Różny producent</td></tr><tr><td>Cefuroksym</td><td></td><td></td><td>Różny producent</td></tr><tr><td>Clopidogrel</td><td></td><td></td><td>Różny producent</td></tr><tr><td>Coroflex Niebieski stent</td><td>B.Braun Medical</td><td>5029012</td><td>Numer katalogowy zależy od wielkości stentu</td></tr><tr><td>Crile kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyclotron</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobutamina</td><td></td><td></td><td>Różny producent</td></tr><tr><td>System mapowania elektroanatomicznego</td><td>Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enoxaparin</td><td></td><td></td><td>Różny producent</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td></td><td></td><td>Zmienny producent</td></tr><tr><td>Cewnik do iniekcji domięśnia sercowego</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jod środek kontrastowy</td><td>Iomeron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nóż</td><td></td><td></td> kuchenny <td>Różny producent</td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td></td><td></td><td>Zmienny producent</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>Zmienny producent</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>Różny producent</td></tr><tr><td>Igła 18 G</td><td>Cordis</td><td>12-004943</td><td></td></tr><tr>Pompa <td></td><td></td><td></td><td>perfuzyjna</td></tr><tr><td>Skaner PET-CT</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td><td></td>z politetrafluoroetylenu</tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>Różni producenci</td></tr><tr><td>Skalpel nr 11</td><td>VWR</td><td>SWAN0503</td><td></td></tr><tr><td>Diazotan podjęzykowy</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat ultrasonograficzny</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Choroba wieńcowa jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Pomimo postępu obecnych metod leczenia, znaczna część pacjentów z chorobą wieńcową nadal ma objawy. Angiogeneza terapeutyczna za pośrednictwem terapii genowej oferuje nowatorską metodę terapeutyczną poprawiającą perfuzję mięśnia sercowego i łagodzącą objawy. Terapia genowa z różnymi czynnikami angiogennymi została zbadana w kilku badaniach klinicznych. Ze względu na nowatorstwo metody, postęp terapii genowej mięśnia sercowego to ciągła droga od ławki do łóżka. Dlatego do oceny bezpieczeństwa i skuteczności potrzebne są duże modele zwierzęce. Im bardziej duży model zwierzęcy identyfikuje pierwotną chorobę i punkty końcowe stosowane w klinikach, tym bardziej przewidywalne są wyniki badań klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu świni. Stosujemy klinicznie istotne metody obrazowania, takie jak obrazowanie ultrasonograficzne i 15H2O-PET. Aby ukierunkować transfery genów do pożądanego obszaru, stosuje się mapowanie elektroanatomiczne. Celem tej metody jest: (1) naśladowanie przewlekłej choroby wieńcowej, (2) indukowanie terapeutycznej angiogenezy w niedotlenionych obszarach serca oraz (3) ocena bezpieczeństwa i skuteczności terapii genowej przy użyciu odpowiednich punktów końcowych.

Powodzenie operacji niedokrwienia można potwierdzić w ramach niniejszego protokołu za pomocą angiografii wieńcowej oraz poprzez określenie obszaru hipokinetycznego przy użyciu echokardiografii przezklatkowej (Rycina 1>) przed przejściem do dostarczania genu. Stan zamknięcia tętnicy wieńcowej można ocenić za pomocą angiografii wieńcowej, a mapowanie elektroanatomiczne pozwala na zidentyfikowanie obszarów niedokrwionych i hibernujących.
Skuteczność terapii genowej m...

Terapia genowa mięśnia sercowego w chorobie niedokrwiennej serca jest bardzo obiecująca dla przyszłych terapii. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu.

Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a ...

Metody i metody obrazowania zastosowane w tym protokole stanowią doskonały obraz bezpieczeństwa i skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca przed przystąpieniem do badań klinicznych. Głównymi zaletami tej techniki jest niska inwazyjność modelu niedokrwienia, ale także precyzyjne ukierunkowanie terapii genowej na hipokinetyczne, ale wciąż żywotne obszary serca. Zacznij od wykonania echokardiografii przezklatkowej przed operacją niedokrwienia, transferem genów i eutanazją, aby ocenić wykrywalny płyn osierdziowy i określić szczep mięśnia sercowego.Umieść przetwornik w trzeciej lub czwartej przestrzeni międzyżebrowej pod pachą świni ze znacznikiem skierowanym na mostek świni, aby uzyskać dostęp do krótkich widoków przymostkowych na poziomie zastawki mitralnej, mięśnia brodawkowatego i poziomu wierzchołkowego. Następnie naciśnij przycisk Acquire, aby zapisać klip. Do wykonania koronarografii bezpośrednio przed operacją niedokrwienia należy użyć cewnika 6-F pod kontrolą fluoroskopową z jodowym środkiem kontrastowym, aby zobrazować prawą tętnicę wieńcową, lewą wstępującą tętnicę wieńcową i lewą przednią tętnicę zstępującą.W przypadku obrazowania kinowego w automatycznym wstrzykiwaczu ustaw czas trwania bolusa na trzy sekundy, a całkowitą objętość na 21 mililitrów, a następnie naciśnij pojedynczy i tak, aby podać jodowy środek kontrastowy do lewej komory przez cewnik warkoczowy 5-F. Wykonaj obrazowanie filmowe zwierzęcia w spoczynku, a następnie podawaj dobutaminę dożylnie i zwiększając dawki w celu indukcji stresu. Po osiągnięciu docelowego tętna wynoszącego 160 uderzeń na minutę wykonuje obrazowanie filmowe i usuwa cewnik warkoczowy.Aby obliczyć frakcję wyrzutową, otwórz oprogramowanie pomiarowe, wybierz analizę komorową danego obrazu. Przewiń obraz, aby wybrać przedział czasowy, jeden w rozkurczu i jeden w skurczu, a następnie wybierz narzędzie do rysowania konturów komór dla każdego przedziału czasu. W celu wywołania przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego, 14 dni przed transferem genów należy umieścić cewkę w lewej tętnicy wieńcowej i wsunąć stent z wąskiej szyjki do lewej tętnicy wieńcowej, a następnie umieścić stent dystalnie do pierwszej przekątnej.Napompuj stent do nominalnego ciśnienia w tętnicy, używając indeflatora o stosunku stentu do światła 1,3 w celu zakotwiczenia wąskiego gardła na miejscu. Po dodatkowych 15 sekundach należy opróżnić stent, wycofać sprzęt z tętnicy i zapewnić prawidłowe umieszczenie stentu z wąskim gardłem za pomocą angiografii. Po angiografii i pomiarach funkcjonalnych pod kontrolą fluoroskopową wprowadzić cewnik mapujący do lewej komory przez osłonkę kości udowej w celu mapowania elektroanatomicznego i zebrać co najmniej 100 punktów z lewej komory, a następnie kliknąć przycisk akceptacji, aby zatwierdzić punkt.Na ostatniej mapie, aby zapewnić żywotność, jako kryterium należy użyć jednobiegunowego napięcia powyżej pięciu miliwoltów. A w przypadku hipokinezji wybierz lokalne skrócenie liniowe tak niskie, jak to możliwe, co najmniej tak niskie, jak 12%, ale najlepiej poniżej 6%Po eutanazji zwierzęcia zbierz serce z jamy klatki piersiowej. Po wypłukaniu pobranego serca umieść igłę o rozmiarze 18 nad zastawką aortalną i przymocuj igłę do pompy perfuzyjnej.Perfekować serce 750 mililitrami 1% paraformaldehydu. Użyj ostrego noża, aby pokroić serce na plastry o grubości jednego centymetra i zbierz próbki z obszaru transferu genów do 4% paraformaldehydu i ciekłego azotu. Przechowuj próbki do barwienia w 4% paraformaldehydzie przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Skuteczność terapii genowej analizowano, mierząc napięcie obwodowe, frakcję wyrzutową i perfuzję mięśnia sercowego za pomocą skanu PET 15O-woda. Próbki tkanek można pobrać bezpośrednio z obszaru transferu genów, porównując serce z mapą elektroanatomiczną. Ekspresję transgenu i angiogenezę terapeutyczną oceniano za pomocą immunologicznej analizy histologicznej, analizując liczbę komórek dodatnich po barwieniu beta-galaktozydazą oraz analizując obszar naczyń włosowatych mięśnia sercowego, po barwieniu cząsteczką adhezyjną płytek krwi/komórek śródbłonka-1.Ważne jest, aby potwierdzić umieszczenie stentu z wąskim gardłem za pomocą angiogramu i pobrania próbki z obszaru transferu genów, co można potwierdzić, porównując serce z mapą elektroanatomiczną. Ogólnie rzecz biorąc, ważne jest, aby wszystkie pomiary były wykonywane w jak najbardziej powtarzalny sposób.

large-animal-model-for-evaluating-efficacy-gene-therapy-ischemic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę transferu genów w leczeniu niedokrwiennej niewydolności serca z wykorzystaniem modelu zawału mięśnia sercowego u świń. Nasza prosta i powtarzalna metoda pozwala na łatwą ocenę skuteczności różnych transferów genów w sposób bardzo prosty i odtwarzalny.

Transfer genów w przedklinicznym modelu niedokrwiennej niewydolności serca

Ten protokół opisuje model zawału mięśnia sercowego (MI) świni za pomocą 90-minutowej zamkniętej klatki piersiowej zamknięcia balonu wieńcowego lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD), po której następuje reperfuzja. Ponadto przedstawiono również protokół dla kilku parametrów końcowych, takich jak czynność serca, hemodynamika, opór mikronaczyniowy i wielkość zawału.

Zawał mięśnia sercowego i ocena wyników funkcjonalnych u świń

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie umieszczenia urządzenia do opóźnionego zwężania (ameroid zwężającego) wokół tętnicy wieńcowej w modelu świni. To urządzenie tworzy niedokrwiony obszar serca, który jest przydatny do badania nowych technik obrazowania diagnostycznego i nowych metod leczenia.

Model przewlekłego niedokrwienia serca u świń przy użyciu zwężacza ameroidowego

Tutaj prezentujemy protokół indukcji kriouszkodzenia lewej komory, po którym następuje wszczepienie łaty mięśnia sercowego, pochodzącej z ludzkich kardiomiocytów komórek iPS w modelu świnki morskiej.

Implantacja plastrów sercowo-mięśniowych pochodzących z hiPSC po urazie mięśnia sercowego w modelu świnki morskiej

Tutaj opisujemy przedkliniczny model ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach (świniach), który został mocno ugruntowany i wykorzystany do zbadania nowych strategii kardioprotekcyjnych.

Przedkliniczny model ortotopowego przeszczepiania serca od świń

Staraliśmy się stworzyć świński model niewydolności serca wywołanej zablokowaniem lewej tętnicy obwodowej i szybką stymulacją, aby przetestować efekt i bezpieczeństwo domięśniowego podawania komórek macierzystych w terapiach komórkowych.

Opracowanie świńskiego modelu niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego do leczenia komórkami macierzystymi

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Obecny protokół opisuje metody ekspresji transgenu w sercach szczurów i myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa do mięśnia sercowego pod kierunkiem echokardiografii. Wyjaśniono również metody oceny podatności serca na komorowe zaburzenia rytmu serca poprzez programowaną stymulację elektryczną izolowanych serc z perfuzją Langendorffa.

Ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca

Obecny protokół opisuje trzy metody podawania kardioaktywnych środków terapeutycznych w modelu świniowym. Samice świń rasy lądowej otrzymywały leczenie poprzez: (1) torakotomię i wstrzyknięcie przeznasierdziowe, (2) wstrzyknięcie przezwsierdziowe za pomocą cewnika lub (3) wlew dożylny za pomocą minipompy osmotycznej żyły szyjnej.

Dostarczanie terapii kardioaktywnej w modelu zawału mięśnia sercowego u świń

Obecne badanie demonstruje wysoce powtarzalny model zwierzęcy ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u królików przy użyciu mini-torakotomii lewej dla przypadków przeżycia lub sternotomii linii środkowej dla przypadków nieprzeżytych.

Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików

Poznaj metodę oceny terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca przy użyciu dużego modelu zwierzęcego. Protokół obejmuje echokardiografię, angiografię koronarną i mapowanie elektroanatomiczne.

Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Przeglądaj więcej filmów