Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Protokół ten zapewnia solidną metodologię analizy pojazdów elektrycznych na poziomie komórkowym oraz praktyczne podejście do efektywnego wykorzystania pojazdów elektrycznych i analizy śledzenia pojazdów elektrycznych. Ta metoda etykietowania EV eliminuje współwytrącanie EV i barwnika, wzmacniając w ten sposób sygnały EV. Wykorzystanie EV mierzy się za pomocą analizy objętościowej w celu odróżnienia zinternalizowanych EV od powierzchownych EV.

Pojazdy elektryczne są ładunkiem aktywnym, dlatego ich wychwyt umożliwia przenoszenie cząsteczek biochemicznych. W przypadku badań nad dostarczaniem leków opartych na EV i terapią przeciwnowotworową technika ta może być narzędziem oceny. Wychwyt EV odgrywa rolę w komunikacji międzykomórkowej i jest badany w różnych dziedzinach badawczych, takich jak biologia raka, neurobiologia i dostarczanie leków.

Protokół ten potencjalnie ułatwia skuteczne oznaczanie absorpcji EV. W celu wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV należy wstrzyknąć jeden mililitr wstępnie przetworzonej pożywki do hodowli komórkowej do komory próbki urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji. Aby uruchomić urządzenie, należy obracać je w wirówce stołowej z prędkością 3000 obr./min przez 10 minut.

Po odwirowaniu usuń płyn z komory na odpady, pipetując lub zasysając, a następnie powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby przetworzyć dodatkowe dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych. Następnie, aby umyć izolowane EV, wstrzyknij jeden mililitr PBS do komory na próbkę i obróć urządzenie w wirówce stołowej. W celu znakowania immunofluorescencyjnego EV należy wstrzyknąć jeden mikrogram na mililitr przeciwciała specyficznego dla EV do otworu elucyjnego urządzenia zawierającego 100 mikrolitrów wyizolowanych EV.

Następnie inkubować przez godzinę w ciemności na wytrząsarce płytki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciała w próbce. Następnie przymocuj taśmę klejącą do otworu elucyjnego. Wstrzyknąć jeden mililitr PBS do komory na próbkę, aby wypłukać resztki przeciwciał, a następnie obracać urządzenie, aż komora na próbkę będzie pusta.

Powtórzyć płukanie, wstrzykując kolejny mililitr PBS do komory na próbkę i obracając urządzenie, jak pokazano wcześniej. Po usunięciu resztek płynu z komory, odpipetuj znakowane fluorescencyjnie EV z komory membranowej do pomarańczowej probówki lub mikroprobówki. Chroń rurkę przed światłem do czasu użycia.

Wysiew cztery razy 10 do czwartej komórki PC3 do 35-mililitrowego naczynia z jednym mililitrowym podłożem. Pozwól komórkom przylegać przez noc w optymalnych warunkach hodowli komórkowej. Następnego dnia dwukrotnie przemyj przylegające komórki pożywką zubożoną w egzosomy.

Po rozcieńczeniu znakowanych fluorescencyjnie EV do odpowiedniego stężenia przy użyciu pożywki zubożonej w egzosomy, dodać rozcieńczone EV do przylegających komórek docelowych i inkubować przez żądany czas eksperymentu. Po usunięciu niezinternalizowanych EV poprzez trzykrotne przemycie komórek pożywką wolną od egzosomów, oznacz cytoplazmę przylegających komórek jednym mikrogramem na mililitr CMTMR i inkubuj w optymalnych warunkach hodowli komórkowej. W celu obrazowania żywych komórek należy umieścić przygotowane komórki w inkubatorze na etapie.

Po ustawieniu parametrów obrazowania na podstawie próbek kontrolnych określ głębokość komórek docelowych i zakres wielkości stosu w kierunku Z, aby uzyskać obrazy konfokalne 3D, a następnie ustaw akwizycję obrazu na wiele obrazów ułożonych w stos Z zarówno barwnika specyficznego dla komórki, jak i barwnika specyficznego dla EV jednocześnie. Do przetwarzania obrazu użyj oprogramowania do automatycznego przetwarzania obrazu. Aby zbudować wirtualne powierzchnie komórek, kliknij Dodaj nowe powierzchnie.

Aby skonfigurować powierzchnie komórek wirtualnych, kliknij przycisk Dodaj i wybierz Jakość jako typ filtru. Określ odpowiednią wartość dla dolnego limitu poprzez oględziny, ustaw maksymalną wartość dla górnego limitu i kliknij przycisk Zakończ Następnie, aby zbudować wirtualne kropki EVs, kliknij przycisk Dodaj nowe miejsca. W obszarze Ustawienia algorytmu wybierz Różne rozmiary plamki i obliczanie najkrótszej odległości, a następnie kliknij przycisk Dalej i wybierz Kanał 1 Alexa Fluor 488 jako kanał źródłowy.

Wprowadź odpowiednią wartość dla szacowanej średnicy XY w obszarze Wykrywanie punktowe i kliknij przycisk Dalej. Aby skonfigurować wirtualne kropki EV, kliknij przycisk Dodaj i wybierz Jakość jako typ filtra. Ustaw dolny próg na podstawie oględzin i kliknij przycisk Dalej W polu Typ regionów punktowych wybierz opcję Intensywność bezwzględna, a następnie kliknij przycisk Dalej.

Aby określić próg obszaru kropek EV, wprowadź odpowiednią wartość w polu Próg regionu przez inspekcję wzrokową. Wybierz opcję Średnica z w obszarze Objętość regionu i kliknij przycisk Zakończ. Aby podzielić zgrupowane miejsca wewnątrz zbudowanej powierzchni, kliknij Punkty konstrukcyjne i przejdź do Filtrów.

Następnie kliknij przycisk Dodaj i wybierz Najkrótsza odległość do powierzchni, Powierzchnia powierzchni 1 jako typ filtra. Po ustawieniu najniższego progu dla dolnego limitu i odpowiedniej wartości dla górnego limitu, kliknij przycisk Duplikuj sekcję do nowego Spoty. Aby automatycznie zliczać EV w komórkach, kliknij opcję Wbudowane miejsca 1, przejdź do Statystyki i wyeksportuj wartość z pola Całkowita liczba miejsc.

Aby uzyskać liczbę komórek, kliknij opcję Powierzchnie zbudowane 1, a następnie przejdź do sekcji Statystyka i wyeksportuj wartość z pola Całkowita liczba powierzchni z pola Ogółem. Na koniec przejdź do zakładki Szczegółowe w obszarze Statystyki, aby wyeksportować wolumin. EV wyizolowane z pożywki do hodowli komórkowych PC3 za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji znakowano przeciwciałem specyficznym dla EV skoniugowanym z fluoro-4 i wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D.

Zinternalizowane EV zostały zwizualizowane jako puncta i indywidualne EV. Przetwarzanie końcowe tych obrazów pozwala na wizualizację i kwantyfikację internalizacji EV w komórkach. Wyniki testu absorpcji EV wskazują, że poziom absorpcji EV zależy od długości okresu inkubacji. Liczba zinternalizowanych EV może być znormalizowana do objętości komórki biorcy, aby określić rzeczywistą szybkość wychwytu EV dla określonej komórki.

Procedura ta pozwala na systematyczne wykluczanie niezinternalizowanych pojazdów elektrycznych w celu precyzyjnego pomiaru liczby zinternalizowanych pojazdów elektrycznych. Rozkład wielkości zinternalizowanych kropek EV jest pokazany tutaj. Tak więc kluczowymi krokami są wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do znakowania EV, minimalizacja fluorescencji tła podczas wizualizacji fluorescencyjnych EV, a następnie analiza po obrazowaniu w celu określenia zinternalizowanych i powierzchownych EV.

Tak więc wewnątrzkomórkowe śledzenie EV może być wykonywane w czasie rzeczywistym na płaszczyźnie 3D, a dodatkowo można uzyskać analizę transportu EV w rozdzielczościach przestrzennych/czasowych oraz kolokalizację EV z organellami subkomórkowymi. Dlatego uważamy, że ta technika zapewnia łatwiejszy i bardziej efektywny sposób badania EV w matrycach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych dla badaczy zajmujących się komunikacją komórkową dla EV.