Name: Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w komórkach PC3 przy użyciu mikroskopii konfokalnej i mikrofluidycznego urządzenia do izolacji. Technika ta umożliwia ilościowe określenie internalizacji EV z zastosowaniem w badaniach nad terapią nowotworową i komunikacją międzykomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NCI nr U54CA143803, CA163124, CA093900 i CA143055 dla K. J. P. Badania te zostały wsparte grantem Korea Health Technology R&D Project za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Zdrowotnego (KHIDI), finansowanym przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: HI19C1122). Praca J. Kima i Y.-K. Cho był wspierany przez Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansowany przez rząd koreański. Autorzy dziękują obecnym i byłym członkom Instytutu Urologicznego Brady'ego, a zwłaszcza członkom laboratorium Pienta-Amendment, za krytyczną lekturę manuskryptu.

1. Izolacja EV i immunofluorescencyjne znakowanie EV na chipie
<ol>
	<li>Pobieranie pożywek do hodowli komórkowych (CCM) i wstępne przetwarzanie CCM w celu izolacji EV
	<ol>
		<li>Zasiewaj komórki PC3 przy 30% zbiegu w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2. Pozwól komórkom kontrolnym rosnąć do 90% zbiegu (~48 godzin) w standardowych pożywkach i suplementach specyficznych dla linii komórkowych. 
		UWAGA: Aby składniki zawierające EV nie wpływały na wychwyt komórkowy (tj. płodową surowicę bydlęcą), należy stosować pożywki i suplementy zubożone w egzosomy.</li>
		<li>Zbierz CCM.</li>
		<li>Odwirować CCM przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu osadzenia wszelkich nieprzyłączonych komórek i dużych zanieczyszczeń zebranych za pomocą pożywki. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki.</li>
		<li>W nowej probówce odwirować supernatant o stężeniu 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzać mniejsze zanieczyszczenia i ciała apoptotyczne pozostające w pożywce. Niektóre większe pojazdy elektryczne będą peletować. Przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant przez hydrofilowy filtr strzykawkowy z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF) o średnicy 0,45 μm. 
		UWAGA: Jeśli CCM nie zostanie natychmiast przetworzony w celu izolacji EV, należy przechowywać wstępnie przetworzony CCM w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia izolacji. W przypadku zamrożenia ogranicz cykle zamrażania i rozmrażania do jednego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja EV od CCM za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji
	<ol>
		<li>W przypadku zamrożenia całkowicie rozmrozić CCM i wirować przez 30 s przed krokiem 1.2.2.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 ml wstępnie przetworzonego CCM (krok 1.1) do komory próbki urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji (patrz Tabela Materiałów)17,26. 
		UWAGA: Postępuj zgodnie ze standardową procedurą operacyjną dla urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji17,26.</li>
		<li>Wirować z prędkością 3000 obr./min przez 10 minut w wirówce stołowej (patrz tabela materiałów), aby uruchomić urządzenie mikroprzepływowe. 
		UWAGA: Jeśli CCM pozostanie w komorze próbki po pierwszym uruchomieniu, należy wykonać dodatkowe wirowania, aż cały CCM zostanie opróżniony z komory próbki.</li>
		<li>Usunąć płyn z komory na odpady za pomocą pipetowania i powtórzyć kroki 1.2.1, 1.2.2 i 1.2.3 dwukrotnie. 
		UWAGA: W sumie 3 ml CCM zostaną przetworzone do izolacji EV.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do komory na próbkę w celu przemycia wyizolowanych EV. Zakręć wirówkę stołową do obsługi urządzenia mikroprzepływowego, jak wspomniano w kroku 1.2.3. Zlokalizuj czyste EV na membranie urządzenia. 
		UWAGA: Jakość EV wyizolowanych z urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji została potwierdzona i porównana z konwencjonalną metodą UC za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA), mikroskopii oświetlenia strukturalnego, testu immunoenzymatycznego i PCR w czasie rzeczywistym w poprzednim badaniu17,26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie immunofluorescencyjne EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Należy wybrać przeciwciało specyficzne dla EV zgodnie z celem testu (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Niektóre przeciwciała mogą zakłócać miejsca wiązania ligandów specyficzne dla szlaków wychwytu EV (tj. endocytozy).</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 μg/ml przeciwciała swoistego dla EV do otworu elucyjnego urządzenia zawierającego 100 μl wyizolowanych EV.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytkowej, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciała w próbce.</li>
		<li>Przymocuj taśmę klejącą do otworu elucyjnego. Wstrzyknąć 1 ml PBS do komory na próbkę, aby wypłukać wszelkie pozostałości przeciwciał.</li>
		<li>Obracać urządzeniem z prędkością 3000 obr./min, aż komora na próbkę będzie pusta. Usunąć płyn z komory na odpady za pomocą pipetowania. Wstrzyknąć 1 ml PBS do komory na próbkę. 
		UWAGA: Fluorescencyjnie oznakowane EV będą znajdować się w komorze membranowej.</li>
		<li>Odpipetuj fluorescencyjnie oznaczone EV (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 2) z komory membranowej do bursztynowej probówki. Blokuj przed światłem do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inkubacja komórek z fluorescencyjnie znakowanymi EV do testu absorpcji EV
<ol>
	<li>Docelowe wysiewanie komórek i hodowla na szalkach kompatybilnych z kulturami komórkowymi.
	<ol>
		<li>Umieść 1 x 104 komórki PC3 na 8-dołkowej płytce mikroszkiełkowej (9,4 x 10,7 mm na każdą studzienkę) z 0,2 ml pożywki lub 4 x 104 komórek PC3 do 35-milimetrowej płytki z 1 ml pożywki. Umieść komórki w naczyniu kompatybilnym z kulturami komórkowymi składającym się z cienkiego szkiełka nakrywkowego (grubość: 0,18 mm). 
		UWAGA: Cienkie szkiełko nakrywkowe minimalizuje niekorzystne rozpraszanie światła.</li>
		<li>Pozostawić komórki do przylegania przez noc w optymalnych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% stężenie CO2, 90% wilgotność).</li>
		<li>Przemyj przylegające komórki dwukrotnie pożywką zubożoną w egzosomy (opisaną w kroku 1.1.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja komórek za pomocą znakowanych fluorescencyjnie EV.
	<ol>
		<li>Zmierzyć stężenie znakowanych fluorescencyjnie EV (krok 1.3.5) za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA, rysunek uzupełniający 1). Określić optymalne stężenie znakowanych fluorescencyjnie EV, które mają być dodane do hodowanych komórek (krok 2.1.2).</li>
		<li>Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie EV pożywką zubożoną w egzosomy, aby dopasować do pożądanego stężenia zmierzonego w kroku 2.2.1. (tj. 7,80 x 109 EV (w wartości NTA) w 200 μl pożywki zubożonej w egzosomy.)</li>
		<li>Dodać rozcieńczone EV (etap 2.2.2) do przylegających komórek docelowych przygotowanych w ppkt 2.1.2. Inkubować przez czas doświadczalny (tj. 4, 8 lub 12 godzin).</li>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie pożywką wolną od egzosomów, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane EV. 
		UWAGA: Opcjonalnie: Komórki można utrwalić po umyciu.</li>
		<li>Oznaczyć cytoplazmę przylegających komórek 1 μg/ml CMTMR ((5-(i-6)-(((4-chlorometylo)benzoilo)amino)tetrametylorodaminy) (patrz tabela materiałów) i inkubować w optymalnych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% stężenie CO2, 90% wilgotności). 
		UWAGA: Barwniki obszaru komórkowego powinny fluoryzować oddzielnie od oznakowanych EV, aby pomóc w określeniu lokalizacji przestrzennej (zinternalizowanej lub powierzchownej) wzbogaconych EV podczas testu wychwytu EV.</li>
		<li>Umyj znakowane komórki dwukrotnie pożywką zubożoną w egzosomy, aby usunąć resztki barwnika. Dodaj do komórek świeże podłoże zubożone w egzosomy, przygotowując się do obrazowania konfokalnego żywych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Aby wykonać obrazowanie żywych komórek, należy użyć inkubatora na etapie, aby utrzymać optymalne warunki hodowli komórek (37 °C, 5% stężenieCO2, 90% wilgotność).</li>
	<li>Umieść przygotowane komórki w inkubatorze na etapie.</li>
	<li>Ustaw parametry obrazowania na podstawie próbek kontrolnych. 
	UWAGA: Sugerowane próbki kontrolne obejmują: tylko EV znakowane fluorescencyjnie, komórki znakowane fluorescencyjnie, nieznakowane EV i komórki nieznakowane.</li>
	<li>Określ głębokość komórek docelowych i zakres rozmiaru stosu w kierunku z, aby uzyskać obrazy konfokalne 3D. 
	UWAGA: Grubość stosu Z wynosi 1 μm. Akwizycja konfokalnego obrazu 3D trwała 2 min 34 s (każda akwizycja obrazu w płaszczyźnie Z trwała około 8 s; w sumie dwadzieścia obrazów w stosie Z).</li>
	<li>Ustaw akwizycję obrazu na wiele obrazów ułożonych w stos z zarówno barwnika specyficznego dla komórki (tj. czerwonego), jak i barwnika specyficznego dla EV (tj. zielonego) jednocześnie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 4A).</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Wykorzystaj oprogramowanie do automatycznego przetwarzania obrazu, aby przeanalizować surowe obrazy konfokalne z ułożonymi w stos z i określić wychwyt EV przez komórki (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw parametry progowe na sygnał fluorescencyjny komórek i barwniki specyficzne dla EV. Zbuduj wirtualne powierzchnie komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A,B).
	<ol>
		<li>Aby zbudować wirtualne powierzchnie komórek, kliknij przycisk Dodaj nowe powierzchnie.</li>
		<li>Wybierz opcję Obliczanie najkrótszej odległości jako "Ustawienia algorytmu", aby użyć algorytmu dostarczonego przez oprogramowanie, a następnie kliknij przycisk Dalej: Kanał źródłowy.</li>
		<li>Wybierz Kanał 2 — CMTMR jako "Kanał źródłowy" w tym eksperymencie.</li>
		<li>Wybierz opcję Wygładź i wprowadź odpowiednią wartość w polu "Szczegóły powierzchni" dla wygładzania powierzchni. 
		UWAGA: 0,57 μm w tym eksperymencie, ponieważ 1 piksel odpowiada 0,57 μm w surowych danych obrazowania.</li>
		<li>Wybierz Intensywność bezwzględną jako "Thresholding".</li>
		<li>Aby automatycznie progować obraz fluorescencyjny za pomocą podanego algorytmu, kliknij opcję Threshold (Absolute Intensity) (Próg (intensywność bezwzględna): Wartość jest ustawiana automatycznie.</li>
		<li>Wybierz opcję Włącz jako "Podziel stykające się obiekty (rosnący region)" i umieść wartość szacowanego rozmiaru komórki w polu "Średnica punktów początkowych", 10,0 μm w tym eksperymencie. Następnie kliknij przycisk Dalej: Filtruj punkty początkowe.</li>
		<li>Aby skonfigurować wirtualne powierzchnie komórek, kliknij przycisk + Dodaj, a następnie wybierz Jakość jako "Typ filtra". Określ odpowiednią wartość (210 w tym eksperymencie) dla dolnego limitu za pomocą oględzin i maksymalną wartość (1485) dla górnego limitu, a następnie kliknij przycisk Zakończ. 
		UWAGA: Oględziny oznaczają, że badacz może odróżnić obszar komórkowy od surowego obrazu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Następnie, aby zbudować wirtualne kropki pojazdów elektrycznych, kliknij przycisk Dodaj nowe miejsca.</li>
		<li>Wybierz Różne rozmiary plamki (Rosnący region) i Obliczanie najkrótszej odległości jako "Ustawienia algorytmu", a następnie kliknij Dalej: Kanał źródłowy.</li>
		<li>Wybierz Kanał 1 - Alexa Fluor 488 jako "Kanał źródłowy" w tym eksperymencie.</li>
		<li>Wprowadź odpowiednią wartość w polu "Szacowana średnica XY" dla wykrywania punktowego, 1 μm w tym eksperymencie. Następnie kliknij przycisk Dalej: Filtruj miejsca.</li>
		<li>Aby skonfigurować wirtualne kropki EV, kliknij przycisk + Dodaj, wybierz Jakość jako "Typ filtra" i ustaw "Dolny próg" przez oględziny, 100 w tym eksperymencie. Następnie kliknij przycisk Dalej: Typ regionu dodatkowego.</li>
		<li>Wybierz opcję Absolute Intensity (Intensywność bezwzględna) jako "Typ regionów dodatkowych", a następnie kliknij przycisk Next: Spot Regions.</li>
		<li>Aby określić próg, region kropek EV, wprowadź odpowiednią wartość w polu "Próg regionu" przez oględziny, 100 jako "Próg regionu" w tym eksperymencie. 
		UWAGA: Oględziny oznaczają, że badacz może odróżnić obszar EV od surowego obrazu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Wybierz opcję Objętość regionu jako "Średnica od", a następnie kliknij przycisk Zakończ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj algorytmów dostarczonych przez oprogramowanie, aby podzielić zgrupowane miejsca wewnątrz zbudowanej powierzchni w kroku 4.2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C, i-iv).
	<ol>
		<li>Kliknij utworzone spoty, a następnie przejdź do sekcji Filtry.</li>
		<li>Kliknij przycisk + Dodaj, a następnie wybierz Najkrótsza odległość do powierzchni Powierzchnie = Powierzchnia 1 jako Typ filtru, a następnie kliknij przycisk Powiel wybór do nowych miejsc. Najniższy próg (-7,0 w tym eksperymencie) dla dolnej granicy i odpowiednia wartość (-0,5) dla górnej granicy. 
		UWAGA: Ustaw górny limit z szacowanym promieniem spotów. W tym eksperymencie szacowana średnica plamek, tj. kropek EV, została ustawiona na 1 μm w kroku 4.2.11. W związku z tym górna granica może wynosić 0,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Automatyczne zliczanie EV wewnątrz komórek 
	UWAGA: Oprogramowanie automatycznie policzy liczbę EV wewnątrz komórek, wskazując liczbę zinternalizowaną przez komórki docelowe.
	<ol>
		<li>Kliknij utworzony wybór Miejsca 1 [Najkrótsza odległość do powierzchni = Powierzchnie 1 z zakresu od -7,00 do -0,500].</li>
		<li>Przejdź do Statystyk i wyeksportuj wartość z "Całkowitej liczby miejsc" 
		UWAGA: Algorytmy dostarczone przez oprogramowanie automatycznie obliczą liczbę i objętość komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ wydajność absorpcji EV w okresie inkubacji na podstawie wyżej obliczonych wartości (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).
	<ol>
		<li>Aby uzyskać liczbę komórek, kliknij utworzone Powierzchnie 1, a następnie przejdź do Statystyk i wyeksportuj wartość "Całkowita liczba powierzchni" z pola Ogółem.</li>
		<li>Przejdź do Szczegółowe do Statystyki, aby wyeksportować wolumin ze Szczegółowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li>
<li>Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864(2021).</li>
<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).</li>
<li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li>
<li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180(2020).</li>
<li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li>
<li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829(2014).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li>
<li>Hoen, E. N. M. N. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+distinct+exosome+subpopulations%3A+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li>
<li>Woo, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exodisc+for+Rapid%2C+Size-Selective%2C+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li>
<li>Kim, T. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAST%3A+Size-Selective%2C+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li>
<li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092(2020).</li>
<li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots%2C+traffic+within+endosomes%2C+and+are+targeted+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li>
<li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+extracellular+vesicles+visualization%3A+From+static+to+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494(2020).</li>
<li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029(2015).</li>
<li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57(2018).</li>
<li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated%2C+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261(2020).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma%2C+urine+and+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044(2020).</li>
</ol>

Y.-K. Cho jest wynalazcą patentów na urządzenie mikroprzepływowe Exodisc oparte na nanofiltracji, które są licencjonowane przez Labspinner (Ulsan, Korea). Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test wychwytu EV oparty na obrazowaniu fluorescencyjnym 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej zapewnia wydajną metodologię i czułą analizę. To fluorescencyjne oznakowanie EV ułatwia wizualizację EV i z powodzeniem przeprowadza precyzyjny test wychwytu EV. Poprzednie metody etykietowania pojazdów elektrycznych i usuwania pozostałości barwnika zostały opisane poprzez usuwanie wytrącania za pomocą ultrawirowania (UC); jednak UC może współstrącać EV, a unieruchomiony barwnik może prowadzić do fałszywie dodatniego syg...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanocząsteczki związane z błoną lipidową, które są podzielone według ich rozmiarów: ektosomy (100-500 nm) i egzosomy (50-150 nm)1. EV zawierają różne biomolekuły, takie jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy. Te biomolekuły pochodzą z komórek, zanim zostaną zamknięte w kapsułkach jako ładunek i uwolnione do przestrzeni zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem EVs1,2,3.
Ze względu na różnorodność ich ładunku, uważa się, że pojazdy elektryczne odgrywają aktywną rolę w komunikacji międzykomórkowej. Uwalnianie i wychwyt EV przez komórki umożliwia przenoszenie biomolekuł między komórkami4,5. Wprowadzenie ładunku EV do komórki może zmienić funkcje komórki odbiorcy i stan homeostazy4,5,6. Pojazdy elektryczne są internalizowane przez wiele ścieżek; Jednak dokładne mechanizmy nie zostały dokładnie wykazane.
Większość testów absorpcji EV, takich jak znakowanie genetyczne, fluorescencyjnie oznacza poszczególne EVs7. Uzyskany sygnał może być mierzony za pomocą fotometru mikropłytkowego, cytometrii przepływowej lub mikroskopii, przy czym każda technologia ma istotne ograniczenia. Fotometry mikropłytkowe, cytometria przepływowa lub standardowa mikroskopia dwuwymiarowa (2D) nie są w stanie odróżnić zinternalizowanych i powierzchownie przyczepionych EVs8,9. Dodatkowo, niezbędne przygotowanie próbki dla każdej z tych technik może wprowadzić dodatkowe problemy do oceny absorpcji EV. Na przykład, podniesienie przylegających komórek za pomocą trypsyny przed analizą wychwytu EV może rozszczepić niektóre powierzchownie przyczepione EV na powierzchni komórki10,11. Trypsyna może również wchodzić w interakcje z powierzchnią komórki, wpływając na fenotyp komórki i EV. Ponadto trypsyna może nie odłączyć całkowicie powierzchownych EV, zniekształcając izolowane populacje.
Aby dokładnie oznaczyć EV barwnikami fluorescencyjnymi, wymagane są dodatkowe etapy mycia, aby usunąć resztki barwnika7. Akceptowane techniki izolacji mogą również przyczyniać się do fałszywych dodatnich sygnałów z powodu koagulacji, która występuje podczas izolacji EV. Na przykład ultrawirowanie seryjne (UC) jest szeroko stosowane do izolowania pojazdów elektrycznych i usuwania unieruchomionego barwnika. Jednak UC może współstrącać EV, a resztkowy barwnik może prowadzić do fałszywie dodatniego sygnału12,13. Inne metody nanofiltracji, takie jak filtracja kolumnowa, są również szeroko stosowane do usuwania nieunieruchomionego barwnika. Złożona natura EV i barwnika oddziałujących w matrycy kolumny może prowadzić do niepełnego usunięcia resztkowego barwnika z powodu zmiany molekularnego odcięcia kolumny przez złożone dane wejściowe14,15,16.
Obecny protokół proponuje mikroprzepływowe urządzenie oparte na nanofiltracji do izolowania i mycia fluorescencyjnie oznakowanych izolowanych EV. Urządzenie mikroprzepływowe oparte na nanofiltracji może zapewnić wydajną filtrację za pomocą technologii separacji wspomaganej płynami (FAST)17,18. FAST zmniejsza spadek ciśnienia na filtrze, zmniejszając w ten sposób potencjalną agregację między EV a barwnikami. Dzięki skutecznemu usuwaniu resztkowego barwnika możliwe jest poprawienie jakości znakowanych fluorescencyjnie EV i specyficzności testu.
Mikroskopia konfokalna może rozróżnić zinternalizowane i powierzchownie przyczepione EV na powierzchni komórki i kompleksowo zbadać komórkowe mechanizmy wychwytu EV w rozdzielczości czasoprzestrzennej19,20,21,22,23,24,25. Na przykład, Sung i in. opisali wizualizację cyklu życia egzosomu za pomocą opracowanego przez siebie reportera żywej komórki. Lokalizacja zinternalizowanych EV została wykryta i przeanalizowana za pomocą mikroskopu konfokalnego w narzędziach do przetwarzania trójwymiarowego (3D) i post-image20. Chociaż rozmiar małych EV (40-200 nm) jest poniżej limitu rozdzielczości mikroskopu optycznego, fluorescencyjnie znakowane EV można wykryć za pomocą mikroskopii konfokalnej, ponieważ fotodetektor może wykryć zwiększoną emisję fluorescencji. W związku z tym subkomórkową lokalizację znakowanych fluorescencyjnie EV w komórce można precyzyjnie określić, uzyskując wiele obrazów EV i otaczających organelli komórkowych w stosie z.
Dodatkowo, rekonstrukcja 3D i przetwarzanie danych po zakończeniu przetwarzania mogą dostarczyć dalszych informacji na temat pozycjonowania zinternalizowanych, powierzchownych i swobodnie unoszących się EV. Wykorzystując te procesy w połączeniu z poklatkowym obrazowaniem żywych komórek oferowanym przez mikroskopię konfokalną, można precyzyjnie ocenić poziom wychwytu EV, a także możliwe jest śledzenie wychwytu EV w czasie rzeczywistym. Co więcej, analizę transportu EV można przeprowadzić za pomocą mikroskopii konfokalnej, oceniając kolokalizację EV z organellami, co jest pierwszym krokiem do określenia, w jaki sposób zinternalizowane EV są zaangażowane w funkcję wewnątrzkomórkową. Protokół ten opisuje metodologię wykonywania testu wychwytu EV przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji17,26, mikroskopia konfokalna i analiza po obrazie.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD63</td><td>Biolegend</td><td>353038</td><td>Fluorescencyjne przeciwciało swoiste specyficzne dla EV z barwnikiem fluorescencyjnym</td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Odczynnik do znakowania fluorescencyjnego żywych komórek (cytoplazmy)</td></tr><tr><td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td><td>Nikon</td><td>MRD77400</td><td>Obiektyw do obrazowania konfokalnego, NA=1,25</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 20X</td><td>Nikon</td><td>MRD70200</td><td>Obiektyw do obrazowania konfokalnego, NA=0,75</td></tr><tr><td>Exodisc</td><td>Labspinner Inc.</td><td>EX-D1001</td><td>Urządzenie mikroprzepływowe oparte na nanofiltracji do izolacji EV</td></tr><tr><td>ExoDiscovery</td><td>Labspinner, Inc.</td><td>EX-R1001</td><td>Urządzenie operacyjne do Exodisc</td></tr><tr><td>FBS zubożonego w egzosomy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2720801</td><td>Składnik odżywczy pożywki do hodowli komórkowych do pobierania EV pochodzącego z linii komórkowej PC3</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td>Odżywka do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG H& L wstępnie zaabsorbowany</td><td>abcam</td><td>&nbsp; ab7063</td><td>Mysie przeciwciało IgG do negatywnej kontroli znakowania EV</td></tr><tr><td>Ibidi USA&nbsp; U DISH &mu;-Dish 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>Naczynie hodowlane do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Imaris 9.7.1</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.7.1</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>końcowego System inkubatora+ CO2/O2/N2 mieszalnik gazów</td> Live <td>Cell Instrument</td><td>TU-O-20</td><td>Inkubator do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Aparat Nikon A1 HD25 / A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Aparat do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Mikroskop odwrócony do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.50.00</td><td>Nikon</td><td>4.50.00</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu do mikroskopu Nikon</td></tr><tr><td>NTA, NanoSight NS500</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS500</td><td>Urządzenie do pomiaru stężenia EV</td></tr><tr><td>OriginPro 2020</td><td>OriginLab</td><td>9.7.0.185</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Antybiotyki do hodowli komórek</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21875034</td><td>Pożywka do hodowli komórek PC3</td></tr><tr><td>SYTO RNASelect Green Fluorescencyjny barwnik komórkowy - 5 mM roztwór w DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32703</td><td>Barwnik fluorescencyjny barwiony RNA do znakowania EV</td></tr></tbody></table>

test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Istnieje potrzeba praktycznych testów do wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) przez komórki. Wychwyt EV odgrywa rolę w komunikacji międzykomórkowej w różnych dziedzinach badań; biologia raka, neurobiologia i dostarczanie leków. W literaturze opisano wiele testów wychwytu EV; Brakuje jednak praktycznej, szczegółowej metodologii eksperymentalnej. Wychwyt EV można ocenić poprzez fluorescencyjne znakowanie EV w celu wykrycia ich lokalizacji w komórkach. Rozróżnienie między zinternalizowanymi pojazdami elektrycznymi w komórkach a powierzchownymi pojazdami elektrycznymi w ogniwach jest trudne, ale kluczowe, aby dokładnie określić wykorzystanie pojazdów elektrycznych. W związku z tym w niniejszej pracy zaproponowano test, który skutecznie określa ilościowo wychwyt EV za pomocą trójwymiarowej (3D) fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Znakowane fluorescencyjnie EV przygotowano za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji, zwizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D, a następnie przeanalizowano za pomocą zaawansowanego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Protokół zapewnia solidną metodologię analizy pojazdów elektrycznych na poziomie komórkowym oraz praktyczne podejście do efektywnej analizy.

Za pomocą mikrofluidycznego urządzenia opartego na nanofiltracji wyizolowano EV z PC3 CCM i oznakowano je swoistym dla EV przeciwciałem (CD63) sprzężonym z fluorophorem (Rycina 1). Oznakowane EV zostały pomyślnie zwizualizowane za pomocą konfokalnej mikroskopii 3D (Rycina 2). Oznakowane EV inkubowano z komórkami przez kilka godzin w pośrodku pozbawionym egzosomów. Po inkubacji komórki przemyto pośrodkiem pozbawionym egzosomów. Pozostałe EV zostały zinternalizowa...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Protokół ten zapewnia solidną metodologię analizy pojazdów elektrycznych na poziomie komórkowym oraz praktyczne podejście do efektywnego wykorzystania pojazdów elektrycznych i analizy śledzenia pojazdów elektrycznych. Ta metoda etykietowania EV eliminuje współwytrącanie EV i barwnika, wzmacniając w ten sposób sygnały EV. Wykorzystanie EV mierzy się za pomocą analizy objętościowej w celu odróżnienia zinternalizowanych EV od powierzchownych EV.Pojazdy elektryczne są ładunkiem aktywnym, dlatego ich wychwyt umożliwia przenoszenie cząsteczek biochemicznych. W przypadku badań nad dostarczaniem leków opartych na EV i terapią przeciwnowotworową technika ta może być narzędziem oceny. Wychwyt EV odgrywa rolę w komunikacji międzykomórkowej i jest badany w różnych dziedzinach badawczych, takich jak biologia raka, neurobiologia i dostarczanie leków.Protokół ten potencjalnie ułatwia skuteczne oznaczanie absorpcji EV. W celu wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV należy wstrzyknąć jeden mililitr wstępnie przetworzonej pożywki do hodowli komórkowej do komory próbki urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji. Aby uruchomić urządzenie, należy obracać je w wirówce stołowej z prędkością 3000 obr./min przez 10 minut.Po odwirowaniu usuń płyn z komory na odpady, pipetując lub zasysając, a następnie powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby przetworzyć dodatkowe dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych. Następnie, aby umyć izolowane EV, wstrzyknij jeden mililitr PBS do komory na próbkę i obróć urządzenie w wirówce stołowej. W celu znakowania immunofluorescencyjnego EV należy wstrzyknąć jeden mikrogram na mililitr przeciwciała specyficznego dla EV do otworu elucyjnego urządzenia zawierającego 100 mikrolitrów wyizolowanych EV.Następnie inkubować przez godzinę w ciemności na wytrząsarce płytki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciała w próbce. Następnie przymocuj taśmę klejącą do otworu elucyjnego. Wstrzyknąć jeden mililitr PBS do komory na próbkę, aby wypłukać resztki przeciwciał, a następnie obracać urządzenie, aż komora na próbkę będzie pusta.Powtórzyć płukanie, wstrzykując kolejny mililitr PBS do komory na próbkę i obracając urządzenie, jak pokazano wcześniej. Po usunięciu resztek płynu z komory, odpipetuj znakowane fluorescencyjnie EV z komory membranowej do pomarańczowej probówki lub mikroprobówki. Chroń rurkę przed światłem do czasu użycia.Wysiew cztery razy 10 do czwartej komórki PC3 do 35-mililitrowego naczynia z jednym mililitrowym podłożem. Pozwól komórkom przylegać przez noc w optymalnych warunkach hodowli komórkowej. Następnego dnia dwukrotnie przemyj przylegające komórki pożywką zubożoną w egzosomy.Po rozcieńczeniu znakowanych fluorescencyjnie EV do odpowiedniego stężenia przy użyciu pożywki zubożonej w egzosomy, dodać rozcieńczone EV do przylegających komórek docelowych i inkubować przez żądany czas eksperymentu. Po usunięciu niezinternalizowanych EV poprzez trzykrotne przemycie komórek pożywką wolną od egzosomów, oznacz cytoplazmę przylegających komórek jednym mikrogramem na mililitr CMTMR i inkubuj w optymalnych warunkach hodowli komórkowej. W celu obrazowania żywych komórek należy umieścić przygotowane komórki w inkubatorze na etapie.Po ustawieniu parametrów obrazowania na podstawie próbek kontrolnych określ głębokość komórek docelowych i zakres wielkości stosu w kierunku Z, aby uzyskać obrazy konfokalne 3D, a następnie ustaw akwizycję obrazu na wiele obrazów ułożonych w stos Z zarówno barwnika specyficznego dla komórki, jak i barwnika specyficznego dla EV jednocześnie. Do przetwarzania obrazu użyj oprogramowania do automatycznego przetwarzania obrazu. Aby zbudować wirtualne powierzchnie komórek, kliknij Dodaj nowe powierzchnie.Aby skonfigurować powierzchnie komórek wirtualnych, kliknij przycisk Dodaj i wybierz Jakość jako typ filtru. Określ odpowiednią wartość dla dolnego limitu poprzez oględziny, ustaw maksymalną wartość dla górnego limitu i kliknij przycisk Zakończ Następnie, aby zbudować wirtualne kropki EVs, kliknij przycisk Dodaj nowe miejsca. W obszarze Ustawienia algorytmu wybierz Różne rozmiary plamki i obliczanie najkrótszej odległości, a następnie kliknij przycisk Dalej i wybierz Kanał 1 Alexa Fluor 488 jako kanał źródłowy.Wprowadź odpowiednią wartość dla szacowanej średnicy XY w obszarze Wykrywanie punktowe i kliknij przycisk Dalej. Aby skonfigurować wirtualne kropki EV, kliknij przycisk Dodaj i wybierz Jakość jako typ filtra. Ustaw dolny próg na podstawie oględzin i kliknij przycisk Dalej W polu Typ regionów punktowych wybierz opcję Intensywność bezwzględna, a następnie kliknij przycisk Dalej.Aby określić próg obszaru kropek EV, wprowadź odpowiednią wartość w polu Próg regionu przez inspekcję wzrokową. Wybierz opcję Średnica z w obszarze Objętość regionu i kliknij przycisk Zakończ. Aby podzielić zgrupowane miejsca wewnątrz zbudowanej powierzchni, kliknij Punkty konstrukcyjne i przejdź do Filtrów.Następnie kliknij przycisk Dodaj i wybierz Najkrótsza odległość do powierzchni, Powierzchnia powierzchni 1 jako typ filtra. Po ustawieniu najniższego progu dla dolnego limitu i odpowiedniej wartości dla górnego limitu, kliknij przycisk Duplikuj sekcję do nowego Spoty. Aby automatycznie zliczać EV w komórkach, kliknij opcję Wbudowane miejsca 1, przejdź do Statystyki i wyeksportuj wartość z pola Całkowita liczba miejsc.Aby uzyskać liczbę komórek, kliknij opcję Powierzchnie zbudowane 1, a następnie przejdź do sekcji Statystyka i wyeksportuj wartość z pola Całkowita liczba powierzchni z pola Ogółem. Na koniec przejdź do zakładki Szczegółowe w obszarze Statystyki, aby wyeksportować wolumin. EV wyizolowane z pożywki do hodowli komórkowych PC3 za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji znakowano przeciwciałem specyficznym dla EV skoniugowanym z fluoro-4 i wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D.Zinternalizowane EV zostały zwizualizowane jako puncta i indywidualne EV. Przetwarzanie końcowe tych obrazów pozwala na wizualizację i kwantyfikację internalizacji EV w komórkach. Wyniki testu absorpcji EV wskazują, że poziom absorpcji EV zależy od długości okresu inkubacji. Liczba zinternalizowanych EV może być znormalizowana do objętości komórki biorcy, aby określić rzeczywistą szybkość wychwytu EV dla określonej komórki.Procedura ta pozwala na systematyczne wykluczanie niezinternalizowanych pojazdów elektrycznych w celu precyzyjnego pomiaru liczby zinternalizowanych pojazdów elektrycznych. Rozkład wielkości zinternalizowanych kropek EV jest pokazany tutaj. Tak więc kluczowymi krokami są wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do znakowania EV, minimalizacja fluorescencji tła podczas wizualizacji fluorescencyjnych EV, a następnie analiza po obrazowaniu w celu określenia zinternalizowanych i powierzchownych EV.Tak więc wewnątrzkomórkowe śledzenie EV może być wykonywane w czasie rzeczywistym na płaszczyźnie 3D, a dodatkowo można uzyskać analizę transportu EV w rozdzielczościach przestrzennych/czasowych oraz kolokalizację EV z organellami subkomórkowymi. Dlatego uważamy, że ta technika zapewnia łatwiejszy i bardziej efektywny sposób badania EV w matrycach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych dla badaczy zajmujących się komunikacją komórkową dla EV.

extracellular-vesicle-uptake-assay-via-confocal-microscope-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy test do wizualizacji i ilościowego określenia poboru komórkowego przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV. Test ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego i pozwala na odróżnienie zinternalizowanych EV od tych przyklejonych do powierzchni komórki.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: metoda wizualizacji i ilościowego określania wychwytu komórkowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

W tej pracy opisujemy protokoły do badania roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. W szczególności skupiamy się na interakcjach EV z komórkami śródbłonka.

Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Opisujemy protokół znakowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z makrofagów barwnikami PKH i obserwowania ich absorpcji in vitro i w rdzeniu kręgowym po podaniu dokanałowym.

Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) służy do ominięcia typowego limitu dyfrakcji mikroskopii świetlnej i do oglądania egzosomów w skali nanometrów. Może być stosowany zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach do charakteryzowania egzosomów.

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę analizy wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w komórkach PC3 przy użyciu mikroskopii konfokalnej i mikrofluidycznego urządzenia do izolacji. Technika ta umożliwia ilościowe określenie internalizacji EV z zastosowaniem w badaniach nad terapią nowotworową i komunikacją międzykomórkową.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Przeglądaj więcej filmów