Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest mniej pracochłonny i czasochłonny niż tradycyjna metoda liczenia jednostek tworzących kolonie w celu oszacowania wewnątrzkomórkowego wzrostu Mycobacterium tuberculosis. Technika ta ułatwia naukowcom szybkie badania przesiewowe leków zatwierdzonych przez FDA w celu zmiany ich przeznaczenia jako terapii kierowanych przez gospodarza w leczeniu gruźlicy. Metoda jest bardzo prosta i nieskomplikowana.

Podstawowa wiedza na temat technik hodowli mykobakterii i nosicieli komórek T EO wystarczyłaby, aby krok po kroku postępować zgodnie z protokołem. Na początek przenieś od sześciu do ośmiu mililitrów atenuowanej kultury prątków H37Ra z kolby T25 do 15-mililitrowej rurki polipropylenowej. Odwirować probówkę w wirówce stołowej.

Po ostrożnym wyjęciu probówki przenieś probówkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odczekaj minutę, aż bakterie się uspokoją. Wlać supernatant do pojemnika na odpady środka dezynfekującego. Następnie ponownie zamknij probówkę i zawieś bakterie w pozostałym podłożu, delikatnie stukając w bok probówki i pozwalając bakteriom osiąść na jedną minutę.

Dodaj i wymieszaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego kompletnego RPMI i przenieś do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Aby ponownie zawiesić prątki, należy pobrać zawiesinę do pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25. Następnie bardzo delikatnie wysuń się po bocznej ściance rurki, aby zminimalizować produkcję aerozolu, i powtórz proces od sześciu do ośmiu razy.

Igłę i strzykawkę należy wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś zawiesinę do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej i odwiruj, aby zeszplić wszelkie pozostałe grudki. Włóż probówkę z powrotem do szafy bezpieczeństwa i pozwól bakteriom osiąść przez minutę.

Przenieś górne 1 do 1,5 mililitra supernatantu do nowej probówki. Wyrzuć oryginalną tubkę do pojemnika na odpady zawierającego środek dezynfekujący. Dobrze wymieszaj i dodaj różne ilości zawiesiny mykobakteryjnej do dwóch szkiełek ze szklaną komorą i inkubuj szkiełka przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po trzykrotnym pipetowaniu w górę i w dół w celu usunięcia bakterii niefagocytozowanych, wyjmij pożywkę ze szkiełka szklanej komory. Umyj raz dwoma mililitrami PBS. Rozmrozić podwielokrotności 4% PFA w PBS przechowywanym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć podwielokrotność do 2% PFA i dodać dwa mililitry do każdego dołka. Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej wyjmij szkiełko z szafki bezpieczeństwa w celu barwienia. Wyrzuć PFA do pojemnika na odpady chemiczne PFA i umyj szkiełko pod delikatnym strumieniem wody z kranu.

Za pomocą plastikowej pipety transferowej dozować tyle auryminy, aby pokryć komórki na szkiełku i inkubować szkiełko przez jedną minutę w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmyj nadmiar barwnika ze szkiełka wodą z kranu i dodaj hartownicę na jedną minutę w ciemności. Po zmyciu nadmiaru gaszenia inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej z barwnikiem Hoechst w ciemności.

Następnie zmyj plamę z Hoechst. A po spuszczeniu nadmiaru wody dodaj kroplę płynu zapobiegającego blaknięciu i szkiełko nakrywkowe. Zbadaj wysuszone na powietrzu szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą obiektywu olejowego 100x.

Prątki będą fluoryzować na zielono pod filtrem Fitz, a jądra będą fluoryzować na niebiesko pod filtrem DAPI. Policz liczbę fagocytozowanych prątków na komórkę i procent zakażonych komórek, aby określić MOI. Obliczyć objętość zawiesiny prątków potrzebną do osiągnięcia wymaganego MOI na podstawie powierzchni studzienki w płytce.

Po wymieszaniu zawiesiny prątków dodaj obliczoną objętość do komórek na 12-dołkowych płytkach, aby osiągnąć pożądany MOI. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby umożliwić fagocytozę prątków. Następnie usuń bakterie zewnątrzkomórkowe, kilkakrotnie myjąc studzienki ciepłym RPMI.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy lizy przez 10 minut, aby zdać makrofagi w jednym dołku trzygodzinnej próbki i zbierz lizat, aby określić wyjściową szybkość infekcji. Następnie dodaj świeże, kompletne RPMI i wymagane dawki leku lub kontrolę pojazdu do pozostałych studzienek. Inkubować płytki w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do ośmiu dni, w zależności od projektu eksperymentu.

Aby określić procentowy czas do uzyskania dodatniego wyniku (TTP) początkowego inokulum trzygodzinnej próbki, podgrzej bulion Middlebrook i butelki z kulturą instrumentalną do temperatury pokojowej. Przenieś pożywkę z płytki 12-dołkowej do odpowiednich oznakowanych probówek stożkowych i dodaj 500 mikrolitrów sterylnego buforu do lizy do każdej studzienki. Po 10 minutach delikatnie zeskrob komórki ze studzienki sterylnym skrobakiem i połącz je z pożywką w odpowiedniej stożkowej probówce.

Po umyciu studzienki 0,5 mililitra sterylnego PBS i połączeniu z pożywką i lizatem, rozbij grudki, delikatnie przepuszczając każdą próbkę przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 25 sześć do ośmiu razy. Rozcieńczyć próbkę w bulionie MB, dodając 900 mikrolitrów bulionu MB do 100 mikrolitrów próbki i powtórzyć proces zbioru w wymaganych punktach czasowych podczas inkubacji. Przygotuj butelki z zestawem instrumentów, sterylizując gumową nakrętkę 70% alkoholem.

Przenieś wystarczającą ilość suplementów odżywczych dla wszystkich próbek do stożkowej probówki i za pomocą igły i strzykawki wstrzyknij 0,5 mililitra suplementu odżywczego do butelki do hodowli instrumentów. Następnie odpipetować 500 mikrolitrów rozcieńczonej próbki jeden na 10 w jednomililitrowej probówce z dnem w kształcie litery V. Za pomocą igły i strzykawki wstrzyknąć 500 mikrolitrów próbki do przypisanych butelek z kulturami instrumentów.

Po ostrożnym przetransportowaniu butelek z szafy bezpieczeństwa biologicznego do przyrządu w celu załadunku, naciśnij przycisk ładowania na automatycznym systemie wykrywania drobnoustrojów. Zeskanuj kody kreskowe na butelkach do hodowli instrumentów i umieść butelki w inkubatorze systemu wykrywania w temperaturze 37 stopni Celsjusza na okres do 42 dni. Odczytaj i zapisz czas potrzebny do osiągnięcia dodatniego wyniku na ekranie przyrządu i oblicz procentowe TTP.

Dodatni TTP wskazuje na wzrost prątków. Zautomatyzowany przyrząd do hodowli płynów monitorował poziom dwutlenku węgla co 10 minut i obliczał TTP, czyli liczbę dni od inokulacji do momentu, gdy kultury zostaną oznaczone jako pozytywne. Zilustrowano odwrotną zależność między wartościami TTP i log(10) CFU w początkowym inokulum.

Porównując wewnątrzkomórkowy wzrost Mycobacterium tuberculosis w obrębie makrofagów określony przez zliczenie CFU z opisaną metodą hodowli automatycznej, uzyskano istotną korelację między wynikami. Wzrost prątków prątków gruźlicy przedstawiono graficznie, porównując wartości TTB przez okres do ośmiu dni po zakażeniu makrofagów z początkową wartością TTP. Podobny trend między CFU a hodowlą płynną wykazał znaczące hamowanie wzrostu Mycobacterium tuberculosis w makrofagach w obecności kwasu all-trans retinowego lub AtRA w roztworze lub równoważnej dawki AtRA zamkniętej w mikrocząstkach PLGA.

Eksperyment dawka-odpowiedź przeprowadzono na zakażonych komórkach THP-1 w celu określenia skuteczności samego antybiotyku Linezolid lub połączenia linezolidu i interferonu gamma. Nie zaobserwowano istotnych interakcji między lekami. Barwienie AFP pozwala nam na użycie niskiego MOI w celu zminimalizowania śmierci komórek podczas infekcji makrofagów i zapewnienia, że ten sam MOI jest stosowany niezależnie od zastosowanego leczenia.

Zgodnie z tym protokołem, ołowiowe leki przeciwgruźlicze mogą być identyfikowane i dalej badane w celu zbadania ich skuteczności in vivo.