Name: Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę hodowli ciekłej do ilościowego oznaczania wzrostu Mycobacterium tuberculosis w makrofagach. To podejście umożliwia szybkie przesiewanie zatwierdzonych leków jako terapii ukierunkowanych na gospodarza w badaniach nad gruźlicą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), Health Research Board w Irlandii [HRA-POR/2012/4 i HRA-POR-2015-1145] oraz Royal City of Dublin Hospital Trust.

Doświadczenia opisane w niniejszym protokole przeprowadzono z użyciem atenuowanego szczepu H37Ra Mtb, który może być hodowany w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (Containment Level 2). Wszystkie manipulacje z żywymi prątkami wykonywano w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) klasy II. Procedury eksperymentalne zaprojektowano tak, aby zminimalizować powstawanie aerozoli. Hodowla komórek eukariotycznych (komórki THP-1) była również prowadzona w BSC klasy II. Laboratorium przeprowadziło ocenę ryzyka i zapewniło, że wszystkie procedury są zgodne z instytucjonalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Do przeprowadzenia opisanej metody (krok 1) wykorzystano ludzką linię komórek monocytycznych THP-1. Komórki poddaje się różnicowaniu w makrofagi poprzez stymulację forbolem 12-mirystynianem 13-octanem (PMA) przed zakażeniem prątkami.
1. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Namnożyć zapas szczepu H37Ra do fazy logarytmicznej w bulionie Middlebrook 7H9 (MB) uzupełnionym wzbogaceniem albuminą, dekstrozą i katalazą (ADC) (10%) oraz 0,05% polisorbatem 80. Przechowywać zapas H37Ra w alikwotach 1 mL w zamrażarce w temperaturze -80 °C do 1 roku.</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę 1 mL Mtb-H37Ra i przenieść ją do kolby T25 z nakrętką z filtrem zawierającej 9 mL uzupełnionego bulionu MB około 1 tygodnia przed planowanym eksperymentem. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 dni w inkubatorze statycznym.</li>
	<li>Hodować komórki THP-1 w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej nieinaktywowanej termicznie (kompletna (c)RPMI) w kolbie T75 w inkubatorze z nawilżaniem i CO2 przy 5% CO2/37 °C i pasażować dwa razy w tygodniu, aby utrzymać gęstość poniżej 1 x 106 komórek/mL.</li>
	<li>Zróżnicować komórki THP-1 w makrofagi na 3 dni przed infekcją poprzez delikatne kilkukrotne pipetowanie komórek pipetą serologiczną w kolbach T75 w celu rozbicia grudek, a następnie przenieść je do probówki stożkowej 50 mL.</li>
	<li>Wirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej, odlać nadsącz i delikatnie zawiesić osad w 2 mL RPMI. Wykonać pomiar liczby komórek, aby oszacować liczbę komórek/mL.</li>
	<li>Zasiać 2 mL makrofagów THP-1 na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej z gęstością 100 000 komórek/mL w cRPMI z dodatkiem 100 ng/mL PMA przez 72 h. Usunąć z komórek pożywkę zawierającą PMA i zastąpić ją świeżą cRPMI przed infekcją Mtb.</li>
	<li>Przygotować oddzielne płytki dla każdego wymaganego punktu czasowego.</li>
	<li>Zasiać komórki z tą samą gęstością (100 000 komórek/mL) na 2-dołkowych szklanych szkiełkach z komorami w celu określenia wielokrotności infekcji (MOI).</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 na 3 dni w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Ilościowe oznaczenie wychwytu Mtb
<ol>
	<li>Oznaczanie stopnia poboru Mtb przez makrofagi (MOI)
	<ol>
		<li>W dniu zakażenia przygotować komorę bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC) i pracować na dwóch warstwach ręcznika papierowego, aby wyłapać ewentualne wycieki. Przygotować pojemniki na odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
		<li>Odlać 6-8 mL kultury prątków z kolby T25 i przenieść je do probówki z polipropylenu o pojemności 15 mL. 
		UWAGA: W przypadku mniejszych eksperymentów można stosować probówki o mniejszej objętości.</li>
		<li>Wirować probówkę w wirówce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 2890 x g.</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odczekać 1 min, aby bakterie osiadły.
		<ol>
			<li>Odlać nadosad w pojemniku z dezynfekcją, zakręcić probówkę i resuspender bakterie w pozostałej pożywce, stukając w ściankę probówki. Odczekać 1 min, aby bakterie osiadły.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 2 mL uprzednio ogrzanej pożywki cRPMI, delikatnie wymieszać i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Bardzo ostrożnie resuspender prątki za pomocą igły 25 G i strzykawki 5 mL. Aby resuspender, pobrać zawiesinę prątków do strzykawki i bardzo delikatnie wypuścić ją wzdłuż ścianki probówki, aby zminimalizować powstawanie aerozoli. Powtórzyć czynność 6-8 razy. 
		UWAGA: Należy zachować najwyższą ostrożność, ponieważ jest to kultura prątków o wysokiej gęstości. Aby uniknąć ryzyka zakłucia igłą, w miarę możliwości stosować igły stępione oraz strzykawki z systemem Luer Lock.</li>
		<li>Utylizować igłę i strzykawkę w pojemniku na odpady ostre w komorze BSC.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL (z zakrętką) i wirować w temperaturze pokojowej przez 3 min przy 100 x g, aby zbić pozostałe grudki w osad. Przenieść probówkę z powrotem do komory bezpieczeństwa i odczekać 1 min, aż bakterie osiadną.</li>
		<li>Przenieść górne 1-1,5 mL nadosadu do nowej probówki. Oryginalną probówkę wyrzucić do pojemnika z odpadami zawierającego środek dezynfekujący. Dobrze wymieszać i dodać różne ilości zawiesiny prątków (np. 5, 25, 50, 150 µL) na szkiełka z dwiema komorami i inkubować przez 3 h w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie bakterii kwasoodpornych (AFB) 
	UWAGA: Po 3 h inkubacji makrofagi są przemywane i utrwalane paraformaldehydem w celu inaktywacji prątków. Następnie szkiełka barwi się przy użyciu zestawu Modified Auramine O (patrz Tabela materiałów), aby oszacować liczbę fagocytowanych prątków na komórkę. Ze względu na woskową ścianę komórkową prątki zatrzymują barwnik auraminy po przemyciu kwasem i alkoholem. Jądra makrofagów są następnie barwione kontrastowo barwnikiem Hoechst. Metoda ta pozwala na przeliczenie liczby fagocytowanych bakterii na komórkę i służy do określenia wielokrotności zakażenia (MOI) makrofagów.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę ze szkiełka z komorą, uprzednio pipetując zawartość w górę i w dół trzy razy, aby oderwać bakterie, które nie zostały fagocytowane.</li>
		<li>Przemyć raz 2 mL PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zapas 4% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS przechowywać w aliquotach w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy. Alikwot 4% paraformaldehydu rozmrozić bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńczyć do stężenia 2% paraformaldehydu za pomocą PBS i dodać 2 mL na każdą komorę.</li>
		<li>Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Na tym etapie szkiełko z komorą można wyjąć z komory bezpieczeństwa w celu barwienia.</li>
		<li>Przemyć szkiełko pod delikatnym strumieniem wody z kranu.</li>
		<li>Nanieść na szkiełko za pomocą plastikowej pipety transferowej tyle auraminy, aby zakryć komórki, i inkubować przez 1 min w temperaturze pokojowej w ciemności (przykryć folią aluminiową).</li>
		<li>Zmyć nadmiar barwnika ze szkiełka wodą z kranu i dodać odbarwiacz/tłumik na 1 min w ciemności.</li>
		<li>Zmyć nadmiar wodą z kranu i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej z Hoechst 33342 (10 µg/mL w PBS) w ciemności.</li>
		<li>Zmyć barwnik Hoechst wodą z kranu, zdjąć komory, odlać nadmiar wody ze szkiełka, dodać kroplę środka zapobiegającego blaknięciu (antifade), nałożyć szkiełko nakrywkowe i wysuszyć na powietrzu.</li>
		<li>Obejrzeć szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając obiektywu olejowego 100x. Prątki będą fluoresceć na zielono przy użyciu filtra FITC. Jądra fluorescują na niebiesko przy użyciu filtra DAPI (Rycina 1C).</li>
		<li>Wyznaczyć MOI poprzez przeliczenie liczby prątków fagocytowanych na komórkę oraz procentu zainfekowanych komórek.</li>
		<li>Obliczyć objętość zawiesiny prątków potrzebną do uzyskania wymaganego MOI na podstawie powierzchni komory w płytce; na przykład powierzchnia szkiełek z komorami użytych w tym eksperymencie wynosi 4 cm2. W przypadku eksperymentów prowadzonych przez kilka dni (np. 5 dni) pożądane jest niskie MOI (około 1-2 prątków/komórkę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażanie makrofagów
	<ol>
		<li>Dobrze wymieszać zawiesinę prątków i dodać do komórek na płytkach 12-dołkowych ilość wymaganą do uzyskania pożądanego MOI, po uprzednim wyznaczeniu tej objętości.</li>
		<li>Inkubować w 37 °C przez 3 h, aby umożliwić fagocytozę prątków.</li>
		<li>Usunąć bakterie pozakomórkowe, przemywając dołki kilka razy ciepłą pożywką RPMI lub roztworem HBSS.</li>
		<li>Zlizować makrofagi w jednym dołku (próbka 3 h), aby określić procentowy czas do uzyskania wyniku dodatniego (TTP) początkowego inokulum (próbka 3 h), zgodnie z opisem w kroku 3 poniżej.</li>
		<li>Dodać świeżą pożywkę cRPMI oraz wymagane dawki leku lub kontrolę nośnika do pozostałych dołków; inkubować płytki w inkubatorze CO2 w 37 °C przez niezbędny czas (zależnie od planu eksperymentu, zazwyczaj w kilku odstępach czasu od 1 do 8 dni).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek do systemu detekcji w kulturach płynnych
UWAGA: W dniu infekcji bakterie prątkowe z przestrzeni zewnątrzkomórkowej są usuwane poprzez przemywanie, a bakterie wewnątrzkomórkowe są pozyskiwane poprzez lizę jednej studni z makrofagami (próbka 3 h), aby określić początkową ilość fagocytowanych bakterii jako kontrolę bazową dla infekcji. W kolejnych punktach czasowych medium, lizat komórkowy oraz wody z przemywania są łączone w celu pomiaru całkowitego wzrostu bakterii prątkowych. W razie potrzeby można również oddzielnie ocenić wzrost zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy.
<ol>
	<li>Pozyskiwanie próbki z 3 h w celu określenia TTP
	<ol>
		<li>Wypłucz zewnątrzkomórkowe prątki ze wszystkich dołków po początkowych 3 h infekcji, zgodnie z opisem w kroku 2.3.3. Dodaj 1 mL świeżej pożywki do dołka kontrolnego 3 h, aby wyrównać objętość lizatu z objętościami dla późniejszych punktów czasowych. 
		UWAGA: Patrz krok 3.2.7, jeśli prątki zewnątrzkomórkowe mają zostać wykluczone z analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór próbek
	<ol>
		<li>Ogrzej bulion MB i butelki do hodowli aparatury, aby doprowadzić je do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Przenieś pożywkę z płytki 12-dołkowej do odpowiednich oznakowanych probówek stożkowych.</li>
		<li>Dodaj 500 µL sterylnego buforu do lizy (0,1% Triton x-100 w PBS przefiltrowanego przez sterylny filtr 0,2 µm) do każdego dołka na 10 min.</li>
		<li>Delikatnie zeskrob komórki z dołka za pomocą sterylnego skrobaka i połącz je z pożywką w odpowiedniej probówce stożkowej.</li>
		<li>Przemyj dołek 0,5 mL sterylnego PBS i przenieś do odpowiedniej probówki.</li>
		<li>Każdą próbkę delikatnie przepuść przez igłę i strzykawkę (25 G) 6-8 razy, aby rozbić grudki. Rozcieńcz próbki 1:10 w bulionie MB; 100 µL próbki + 900 µL pożywki MB.</li>
		<li>W wymaganych odstępach czasu/dniach (zazwyczaj od 1 do 8 dni) pobierz pozostałe próbki, postępując zgodnie z krokami 3.2.1-3.2.6 powyżej. 
		UWAGA: Badacze mogą chcieć wykluczyć prątki zewnątrzkomórkowe z analizy; w takim przypadku w kroku 3.2.2 powyżej pożywkę z każdego dołka należy odrzucić, a makrofagi przemyć kilka razy przed dodaniem buforu do lizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja i załadunek butelek do hodowli aparatury 
	UWAGA: Szczegóły dotyczące aparatury do hodowli w cieczy oraz powiązanych materiałów eksploatacyjnych znajdują się w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj gumowy korek butelki do hodowli aparatury za pomocą papierowego ręcznika nasączonego 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia. 
		UWAGA: Krok ten należy przeprowadzić w BSC.</li>
		<li>Przygotuj butelki, przenosząc wystarczającą ilość suplementów odżywczych dla wszystkich próbek do probówki stożkowej (0,5 mL/butelka). Użyj igły i strzykawki, aby wstrzyknąć 0,5 mL suplementu odżywczego do butelki do hodowli aparatury.</li>
		<li>Pipetuj 500 µL rozcieńczonej próbki (1:10) do probówki z dnem w kształcie litery V o pojemności 1 mL.</li>
		<li>Użyj igły i strzykawki, aby wstrzyknąć 500 µL próbki do przypisanej butelki do hodowli aparatury.</li>
		<li>Zdezynfekuj gumowy korek butelki do hodowli aparatury za pomocą papierowego ręcznika nasączonego 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia. Przetrzyj butelki papierowym ręcznikiem nasączonym 70% alkoholem przed wyjęciem z BSC.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś butelki z komory bezpieczeństwa biologicznego do aparatury w celu załadunku.</li>
		<li>Naciśnij przycisk załadunku w zautomatyzowanym systemie detekcji mikrobiologicznej.</li>
		<li>Zeskanuj kody kreskowe na butelkach do hodowli aparatury i umieść butelki w inkubatorze systemu detekcji w temperaturze 37 °C na okres do 42 dni. Odczytaj i zapisz czas potrzebny do uzyskania wyniku pozytywnego z ekranu aparatury. 
		UWAGA: Kod kreskowy pozwala aparaturze na identyfikację butelki i powiązanie odczytów reflekcji z konkretną butelką.</li>
		<li>Oblicz procentowy czas do pozytywności (TTP), porównując TTP początkowego inokulum wewnątrzkomórkowego (Dzień 0) z TTP makrofagów hodowanych przez wskazane czasy. Pozytywna zmiana procentowego TTP oznacza wzrost prątków13. 
		Na przykład dla dnia 3: 
		Procentowa zmiana czasu do pozytywności = <img alt="Wzór na zmianę procentową, schemat, analiza TTP w kontekście badawczym" src="/files/ftp_upload/62838/62838eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tuberculosis+Report%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global Tuberculosis Report.</a> World Health Organization. , Geneva. (2020).</li>
<li>Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+and+the+intimate+discourse+of+a+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection.</a> Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).</li>
<li>Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+host-directed+strategies+to+improve+outcome+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis.</a> Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).</li>
<li>Angeby, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BacT%2FALERT+3D+system+for+recovery+and+drug+susceptibility+testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).</li>
<li>Asmar, S., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+culture-based+diagnosis+of+pulmonary+tuberculosis+in+developed+and+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1184(2015).</li>
<li>Diacon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+liquid+culture+positivity+can+substitute+for+colony+counting+on+agar+plates+in+early+bactericidal+activity+studies+of+antituberculosis+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents.</a> Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).</li>
<li>Diacon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+positivity+in+liquid+culture+predicts+colony+forming+unit+counts+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+sputum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens.</a> Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).</li>
<li>O'Sullivan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+liquid+culture+for+quantitation+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models.</a> Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Strains+H37ra+and+H37rv+have+equivalent+minimum+inhibitory+concentrations+to+most+antituberculosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs.</a> International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).</li>
<li>O'Leary, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+impairs+human+pulmonary+immunity+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).</li>
<li>Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+infection+induces+non-apoptotic+cell+death+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells.</a> BMC Microbiology. 11, 237(2011).</li>
<li>Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+mycobacterium+tuberculosis+strains+evade+apoptosis+of+infected+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages.</a> The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).</li>
<li>Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+therapy+with+interferon-gamma+for+the+treatment+of+pulmonary+tuberculosis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review.</a> International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).</li>
<li>Thorpe, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BacT%2FAlert%3A+an+automated+colorimetric+microbial+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).</li>
<li>Gleeson, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Mycobacterium+tuberculosis+induces+aerobic+glycolysis+in+human+alveolar+macrophages+that+is+required+for+control+of+intracellular+bacillary+replication%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication.</a> The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).</li>
<li>O'Connor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+%28PLGA%29+microparticles+encapsulating+all-trans-Retinoic+acid+%28ATRA%29+as+a+host-directed%2C+adjunctive+treatment+for+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).</li>
<li>O'Connor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharpening+nature%27s+tools+for+efficient+tuberculosis+control%3A+A+review+of+the+potential+role+and+development+of+host-directed+therapies+and+strategies+for+targeted+respiratory+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Ortalo-Magne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+outermost+capsular+material+of+the+tubercle+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus.</a> Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).</li>
<li>Stokes, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycan-rich+outer+layer+of+the+cell+wall+of+Mycobacterium+tuberculosis+acts+as+an+antiphagocytic+capsule+limiting+the+association+of+the+bacterium+with+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages.</a> Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).</li>
<li>O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-independent+pathway+mediates+macrophage+cell+death+in+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).</li>
<li>Cheon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).</li>
<li>Nathan, C., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TB+drug+development%3A+immunology+at+the+table%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">TB drug development: immunology at the table.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).</li>
<li>Bowness, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+Mycobacterium+tuberculosis+MGIT+time+to+positivity+and+cfu+in+sputum+samples+demonstrates+changing+bacterial+phenotypes+potentially+reflecting+the+impact+of+chemotherapy+on+critical+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).</li>
<li>Basu Roy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auto-luminescent+fluorescent+BCG+whole+blood+assay+to+enable+evaluation+of+paediatric+mycobacterial+responses+using+minimal+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Autorzy wykorzystali metodę hodowli płynnej opisaną w tym protokole do monitorowania wzrostu Mtb w makrofagach pochodzących z monocytów i makrofagach pęcherzykowych oraz komórkach THP-1 zróżnicowanych za pomocą PMA 11,16,17. Technika ta może być również zmodyfikowana do stosowania z komórkami nieprzylegającymi12. Niedawno instrument został również wykorzystany w badaniach przedklinicznych do oceny wziewne...

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), czynnik wywołujący gruźlicę, był najważniejszym zabójcą chorób zakaźnych na świecie w 2019 roku1. Aby uniknąć obrony gospodarza, Mtb osłabia aktywność prątkowobójczą wrodzonych komórek odpornościowych, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne (DC), umożliwiając mu przetrwanie wewnątrzkomórkowe i replikację2. Brak skutecznej szczepionki zapobiegającej gruźlicy płuc u dorosłych oraz coraz częstsze pojawianie się szczepów lekoopornych wskazują na pilną potrzebę opracowania nowych terapii.
Wspomagające terapie ukierunkowane na gospodarza (HDT) mogłyby skrócić czas leczenia i pomóc przezwyciężyć oporność3. Przedkliniczna ocena kandydatów na HDT in vitro w celu określenia aktywności prątkowobójczej w makrofagach często opiera się na ilościowym określeniu wzrostu Mtb za pomocą jednostek tworzących kolonie (CFU) na stałych płytkach agarowych. Jest to powolny, pracochłonny test, który nie nadaje się do szybkich badań przesiewowych leków. Dostępne na rynku zautomatyzowane systemy wykrywania drobnoustrojów na bazie bulionu są częściej stosowane w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych do wykrywania i testowania wrażliwości na leki Mtb i innych gatunków prątków w próbkach klinicznych4. Przyrządy te mierzą wzrost pośrednio w oparciu o aktywność metaboliczną bakterii prowadzącą do zmian fizycznych w pożywkach hodowlanych (zmiana poziomów CO2 lub O2 lub ciśnienia) monitorowanych w czasie5. Odczyt to czas do dodatniego wyniku (TPP), który wcześniej wykazano, że koreluje z Mtb CFU w próbkach plwociny pacjentów z gruźlicą w odpowiedzi na leczenie6,7 oraz w lizatach zakażonych płuc i śledziony myszy 8. Ponadto systemy wykrywania płynnych kultur zostały wykorzystane do pomiaru wpływu konwencjonalnych terapii ukierunkowanych na patogeny na wzrost prątków w kulturach aksenicznych i hodowanych makrofagach9,10. Instrument został również wykorzystany do zbadania wrodzonej zdolności komórek dendrytycznych i makrofagów pęcherzykowych do kontrolowania wzrostu wewnątrzkomórkowego Mtb11,12. Ten protokół eksperymentalny pokazuje, że system diagnostyczny płynnych hodowli może być przystosowany do przeprowadzania przedklinicznych badań przesiewowych HDT w kierunku gruźlicy w hodowanych makrofagach. W porównaniu z liczeniem CFU, główną zaletą tej techniki jest to, że znacznie zmniejsza ona pracochłonność eksperymentalną i czas wymagany do ilościowego określenia wzrostu/przeżycia prątków wewnątrzkomórkowych. Technika ta opiera się na dostępie do zautomatyzowanego instrumentu hodowlanego, który można wykorzystać do oceny przeżycia wewnątrzkomórkowych prątków w komórkach odpornościowych traktowanych szeroką gamą odczynników farmakologicznych ukierunkowanych na funkcje komórkowe w celu wzmocnienia odporności gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny IX51</td><td>Olympus, Japonia</td><td>Wykrywanie i obrazowanie AFB</td><td>bez dotyczy</td></tr><tr><td>Mikroprobówka 2 ml, płaskie dno, nakrętka, sterylne</td><td>Sarstedt, Karolina Północna, USA</td><td>72.694.006</td><td>Zakażenie Mtb strzykawką makropahges</td></tr><tr><td>5 mL, Luer lock</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>SZR-150-031K</td><td>Zakażenie Mtb makropahges/CFU</td></tr><tr><td>50 mL probówka, sterylne</td><td>Sarstedt, północ Carolina, Stany Zjednoczone</td><td>62.547.254</td><td>Zakażenie Mtb</td></tr><tr><td>kwasem all-trans-retinowym makropahges (ATRA) &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>R2625</td><td>Kandydat na terapię kierowaną przez gospodarza</td></tr><tr><td>System wykrywania drobnoustrojów BacT/ALERT 3D</td><td>Biomerieux (Hampshire, Wielka Brytania)</td><td>247001</td><td>System detekcji kolorometrycznej na bazie bulionu</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP&nbsp; BACT/ALERT MP Suplement odżywczy</td><td>Biomerieux (Hampshire, Wielka Brytania)</td><td>414997</td> Test <td>detekcji kolormetrycznej na bazie bulionu</td></tr><tr><td>Butelki hodowlane BACT/ALERT MP</td><td>Biomerieux (Hampshire, Wielka Brytania)</td><td>419744</td><td>Test detekcji kolorometrycznej na bazie bulionu</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 ml</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0553</td><td>Płynna kultura prątków</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook Wzbogacenie OADC, 20mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0678</td><td>Jednostki formujące kolonie</td></tr><tr><td>Skrobak komórkowy, 25 cm</td><td>Sarstedt, Karolina Północna, USA</td><td>83.1830</td><td>Zbiór lizatów lmakrofagów</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Corning, 0,2 i mikro; m</td><td>Corning Incorporated, Niemcy</td><td>431219</td><td>Sterylizacja buforu do lizy</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (borokrzemian), 24 x 50 mm, grubość #1,5</td><td>VWR International Limited</td><td>631 - 0147</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymidek, z mikrobiologicznego</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>C7698</td><td>Jednostki tworzące kolonie</td></tr><tr><td>Dako Fluorescencyjne medium</td> montażowe <td>Agilent Technologies Ireland Limited</td><td>S3023</td><td>Antifade nośnik montażowy</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>D8537</td><td>Zakażenie Mtb makropahges</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>10270106</td><td>Hodowla komórek makrofagów</td></tr><tr><td>Glicerol, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>228220</td><td>Jednostki tworzące kolonie</td></tr><tr><td>Hoescht 33342 (trichlorowodorek bisBenzimide H 33342)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>B2261</td><td>Barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>IFN&gamma;, rekombinowany ludzki</td><td>R& D Systems Inc, Minnesota, Stany Zjednoczone</td><td>285-IF</td><td>Kandydat na terapię kierowaną przez gospodarza</td></tr><tr><td>Labtek 2-dołkowe szkiełko komorowe, sterylne, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>TKT-210-150R</td><td>Zakażenie Mtb makropahgami</td></tr><tr><td>L-asparagina, bezwodna</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>A4159</td><td>Jednostki tworzące kolonie</td></tr><tr><td>Linezolid</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>PZ0014</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Igła podskórna Microlance 25 G</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>300400</td><td>Zakażenie Mtb makropahges/CFU</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0303</td><td>Jednostki do tworzenia kolonii</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bulion Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0178</td><td>Płynna kultura Mycobacterium</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana Auramina O Barwnik i odbarwiacz</td><td>Laboratorium Urządzeń Naukowych, IL, USA</td><td>345-250</td><td>AFB barwienie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>158127</td><td>Zakażenie Mtb makropahges</td></tr><tr><td>szalkami Petriego, 92 x 16mm (20/worek)</td><td>Sarstedt, Karolina Północna, USA</td><td>82.1473.001</td><td>Jednostki tworzące kolonie</td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>P8139</td><td>Hodowla komórek makrofagów</td></tr><tr><td>Polisorbat 80, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>231181</td><td>Płynna kultura prątków</td></tr><tr><td>RPMI-1640, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>52400025</td><td>Hodowla komórek makrofagów</td></tr><tr><td>Sterylny rozsiewacz komórek,</td> marka rybna w kształcie litery L<td>, Thermo Fisher, MA, USA</td><td>RB-44103</td><td>Jednostki formujące kolonie</td></tr><tr><td>Kolba T25 TC, kątowa szyjka, nasadka filtra, sterylna, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>156367</td><td>Płynna hodowla prątków Mycobacterium</td></tr><tr><td>Linia komórkowa THP-1</td><td>ATCC, Wirginia, USA</td><td>ATCC TIB-202</td><td>Hodowla komórek makrofagów</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), czynnik wywołujący gruźlicę (TB), był najważniejszym zabójcą chorób zakaźnych na świecie aż do nadejścia COVID-19. Mtb ewoluował, aby przetrwać w środowisku wewnątrzkomórkowym, unikać obrony gospodarza i rozwinąć oporność na wiele leków przeciwgruźliczych. Jednym z podejść do rozwiązania problemu oporności jest identyfikacja istniejących zatwierdzonych leków, które wzmocnią odpowiedź immunologiczną gospodarza na Mtb. Leki te mogą być następnie ponownie wykorzystane jako wspomagające terapie ukierunkowane na gospodarza (HDT) w celu skrócenia czasu leczenia i przezwyciężenia oporności na antybiotyki.
Kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego wzrostu Mtb w makrofagach jest kluczowym aspektem oceny potencjału HDT. Złotym standardem pomiaru wzrostu Mtb jest liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytkach agarowych. Jest to powolny, pracochłonny test, który nie nadaje się do szybkich badań przesiewowych leków. W tym protokole zautomatyzowany system hodowli oparty na bulionie, który jest częściej stosowany do wykrywania Mtb w próbkach klinicznych, został przystosowany do przedklinicznych badań przesiewowych terapii ukierunkowanych na gospodarza. Oceniono zdolność systemu do oznaczania płynnych kultur do badania wewnątrzkomórkowego wzrostu Mtb w makrofagach poddanych działaniu HDT. HDT testowane pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu Mtb to kwas all-trans retinowy (AtRA), zarówno w roztworze, jak i w kapsułkach w mikrocząstkach poli(kwasu mlekowo-koglikolowego) (PLGA) oraz kombinacja interferonu-gamma i linezolidu. Zalety tej zautomatyzowanej techniki opartej na hodowli płynnej w porównaniu z metodą CFU obejmują prostotę konfiguracji, mniej pracochłonne przygotowanie i szybszy czas oczekiwania na wyniki (5-12 dni w porównaniu do 21 dni lub więcej w przypadku płytek agarowych).

Zautomatyzowane urządzenie do hodowli w kulturach płynnych zastosowane w niniejszym badaniu monitoruje poziomy CO2 co 10 min. Zmiana barwy sensora znajdującego się na dnie butelki urządzenia jest mierzona kolorymetrycznie i wyrażana w jednostkach odbicia (reflectance units). Następnie oprogramowanie urządzenia stosuje algorytmy detekcji w celu obliczenia czasu do uzyskania wyniku dodatniego (TTP, time to positivity), czyli liczby dni od inokulacji do momentu oznaczenia kultur jako dodatnie (<strong class="xfig...

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest mniej pracochłonny i czasochłonny niż tradycyjna metoda liczenia jednostek tworzących kolonie w celu oszacowania wewnątrzkomórkowego wzrostu Mycobacterium tuberculosis. Technika ta ułatwia naukowcom szybkie badania przesiewowe leków zatwierdzonych przez FDA w celu zmiany ich przeznaczenia jako terapii kierowanych przez gospodarza w leczeniu gruźlicy. Metoda jest bardzo prosta i nieskomplikowana.Podstawowa wiedza na temat technik hodowli mykobakterii i nosicieli komórek T EO wystarczyłaby, aby krok po kroku postępować zgodnie z protokołem. Na początek przenieś od sześciu do ośmiu mililitrów atenuowanej kultury prątków H37Ra z kolby T25 do 15-mililitrowej rurki polipropylenowej. Odwirować probówkę w wirówce stołowej.Po ostrożnym wyjęciu probówki przenieś probówkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odczekaj minutę, aż bakterie się uspokoją. Wlać supernatant do pojemnika na odpady środka dezynfekującego. Następnie ponownie zamknij probówkę i zawieś bakterie w pozostałym podłożu, delikatnie stukając w bok probówki i pozwalając bakteriom osiąść na jedną minutę.Dodaj i wymieszaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego kompletnego RPMI i przeni

an-automated-culture-system-for-use-preclinical-testing-host-directed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Tutaj demonstrujemy przygotowanie filtratu kulturowego Mtb (CF), który jest pożywką do wzrostu bakterii, która składa się z białek wydzielanych przez bakterie. Mtb wydziela białka modulujące sygnalizację gospodarza i odpowiedź immunologiczną, które mają kluczowe znaczenie dla patogenezy. Przygotowane CF są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania wszystkich czynników wydzielniczych.

Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj zautomatyzowaną metodę hodowli ciekłej do ilościowego oznaczania wzrostu Mycobacterium tuberculosis w makrofagach. To podejście umożliwia szybkie przesiewanie zatwierdzonych leków jako terapii ukierunkowanych na gospodarza w badaniach nad gruźlicą.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Przeglądaj więcej filmów